趙敏，王芳芳，王學(xué)彬

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種好發(fā)于育齡期女性的全身性自身免疫性疾病，以皮膚、關(guān)節(jié)、腎臟等多系統(tǒng)受累及血清中具有多種自身抗體為其突出特點(diǎn)。隨著診療手段的逐漸提高，SLE患者生存率明顯改善。然而，值得注意的是，SLE患者心血管事件發(fā)生率顯著增高[1]。同傳統(tǒng)心血管疾病一樣，動脈粥樣硬化仍為其基本病理改變。目前認(rèn)為，動脈粥樣硬化以內(nèi)膜內(nèi)脂質(zhì)的異常沉積和異常的炎癥反應(yīng)為特征[2]。在SLE患者中動脈粥樣硬化被發(fā)現(xiàn)過早并加速發(fā)展，SLE并發(fā)動脈粥樣硬化的病因是多因素的，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，SLE中動脈粥樣硬化的發(fā)生被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、功能失調(diào)的脂質(zhì)、血管壁的炎癥過程、多種自身抗體的發(fā)展、傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素和狼瘡本身治療藥物綜合作用的結(jié)果[3]。在SLE中，中性粒細(xì)胞可能在誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)和器官損傷中發(fā)揮重要作用。中性粒細(xì)胞貫穿整個(gè)炎癥發(fā)展過程。目前認(rèn)為，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)作為中性粒細(xì)胞的一種獨(dú)特的死亡方式，在SLE動脈粥樣硬化慢性炎癥過程的啟動和維持中起重要作用，可通過多種機(jī)制參與其中。

1 SLE與動脈粥樣硬化

Manzi等[4]研究了498例女性SLE患者與2 208名健康對照組女性的心血管事件發(fā)生率，在SLE確診后有33例患者發(fā)生首次心血管事件，其中11例發(fā)生心肌梗死，10例發(fā)生心絞痛，12例發(fā)生心絞痛并發(fā)心肌梗死，事件發(fā)生時(shí)2/3的患者年齡在55歲以下；尤其是35～44歲亞組的女性SLE患者，發(fā)生急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)是健康對照組的50倍。有研究報(bào)道，與非SLE患者相比，SLE患者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)高3.39倍，即使在調(diào)整了潛在的混雜變量后，SLE的診斷仍然與冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加獨(dú)立相關(guān)[5]。SLE患者比普通人群有更高的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，而且發(fā)生在較年輕的患者群體中。然而，大多數(shù)年輕女性沒有明顯的心血管疾病的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，因此，不能簡單的用Framingham風(fēng)險(xiǎn)方程中包括的經(jīng)典風(fēng)險(xiǎn)因素來完全解釋。持續(xù)的炎癥以及免疫失調(diào)被認(rèn)為在SLE患者的斑塊進(jìn)展和促進(jìn)心血管疾病進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。而SLE患者較高的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)主要與動脈粥樣硬化加速有關(guān)，這導(dǎo)致與普通人群相比，其臨床癥狀和表現(xiàn)出現(xiàn)更早。Henrot等[6]發(fā)表的一項(xiàng)薈萃分析顯示，與健康對照組相比，SLE患者頸動脈內(nèi)膜中層厚度明顯增厚，頸動脈斑塊發(fā)生率明顯升高，血流介導(dǎo)的血管舒張功能顯著降低，動脈粥樣硬化發(fā)病率明顯增高。Roman等[7]報(bào)道了各年齡組SLE患者動脈粥樣硬化的發(fā)生率增加，尤其是40歲以下的患者，其發(fā)生率是健康對照組的5.6倍。

2 NETs概述

2004年，Brinkmann等[8]首次發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在激活后可釋放出一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被稱為NETs，是由DNA、組蛋白、顆粒蛋白和胞漿蛋白等構(gòu)成。NETs是一種不同于凋亡和壞死的程序性細(xì)胞死亡途徑，其釋放過程也被稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成(NETsosis)。NETsosis可分為以下幾個(gè)過程：細(xì)菌毒素或表面受體(G蛋白偶聯(lián)受體配體(GPCRs)、腫瘤壞死因子(TNF)和FC受體)的參與，激活中性粒細(xì)胞，啟動NETsosis；可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加，隨后鈣通道開放，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲存的鈣釋放；蛋白激酶C等關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子激酶信號級聯(lián)的激活，以及來源于NADPH氧化酶和線粒體的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生[9]；活性氧可以釋放細(xì)胞核、顆粒和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物，包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和髓過氧化物酶，降解肽基精氨酸脫氨酶4誘導(dǎo)的組蛋白瓜氨酸化，并促進(jìn)染色質(zhì)解聚，組蛋白與顆粒蛋白混合并從中性粒細(xì)胞中排出[10]。以上過程均對NETsosis起關(guān)鍵作用。中性粒細(xì)胞可以通過NETs殺滅病原體，而NETs增多提示機(jī)體組織受損，目前更多的關(guān)注在其與炎癥與免疫疾病的發(fā)生和維持之間的關(guān)系。

3 NETs參與SLE動脈粥樣硬化

3.1 NETs損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動脈粥樣硬化啟動的最早步驟之一。在持續(xù)炎癥刺激下內(nèi)皮細(xì)胞活化，活性氧生產(chǎn)增加，血管通透性增加、脂質(zhì)積聚和免疫細(xì)胞募集，產(chǎn)生腫瘤壞死因子等多種促炎細(xì)胞因子，啟動動脈粥樣硬化[11]。SLE患者有顯著的內(nèi)皮功能受損，其強(qiáng)大的血管修復(fù)功能也明顯下降。與NETs-患者相比，NETs水平升高(NETs+)的SLE患者內(nèi)皮細(xì)胞微粒增多，而血漿內(nèi)皮細(xì)胞微粒水平與循環(huán)NETs水平呈正相關(guān)，表明內(nèi)皮損傷和NETs之間存在聯(lián)系[12]。NETs對內(nèi)皮細(xì)胞也有直接損傷作用。SLE的NETs中金屬基質(zhì)蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)上調(diào)，MMP-9特異性地?fù)p害了小鼠主動脈內(nèi)皮依賴性的血管舒張，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改變內(nèi)皮細(xì)胞的功能完整性；此功能與MMP-9激活內(nèi)皮金屬基質(zhì)蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)有關(guān)，抑制MMP-2活化可恢復(fù)內(nèi)皮依賴功能，降低NETs誘導(dǎo)的血管細(xì)胞毒作用。此外，MMP-9可能是SLE中一種新的自身抗原，在SLE血清中檢測到由MMP-9和抗MMP-9組成的免疫原性復(fù)合物，可以誘導(dǎo)NETsosis增多，進(jìn)一步損傷內(nèi)皮[13]。這可能與SLE動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制有關(guān)。中性粒細(xì)胞/胞外陷阱介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷部分依賴于活化的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的白介素-8[14]。動脈粥樣硬化患者血清白介素-8和NETs水平明顯升高[15]。白介素-8與其受體CXC趨化因子受體2(CXCR2)在中性粒細(xì)胞上相互作用，通過Src、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)形成NETs，加重體內(nèi)動脈粥樣硬化進(jìn)展。激活的中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的NETosis直接上調(diào)巨噬細(xì)胞TLR9/NF-κB通路，進(jìn)而啟動白介素-8的釋放。在動脈粥樣硬化進(jìn)展過程中中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞相互作用，并表明NETs是治療動脈粥樣硬化的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

3.2 低密度粒細(xì)胞促進(jìn)NETs形成，發(fā)揮促炎作用

低密度粒細(xì)胞(low-density granulocytes，LDGs)是在SLE患者中發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞的一個(gè)亞群，LDGs具有強(qiáng)大的促炎作用。低密度粒細(xì)胞是未成熟的中性粒細(xì)胞，在促炎細(xì)胞因子白介素-8和白介素-17的影響下過早離開骨髓，在全身定居。這些細(xì)胞在體外系統(tǒng)中迅速發(fā)生凋亡，并且容易發(fā)生NETsosis[16]。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者組與健康對照組的正常密度的中性粒細(xì)胞相比，LDGs具有更強(qiáng)的殺傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，能夠促進(jìn)腫瘤壞死因子分泌，受到刺激時(shí)，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞合成干擾素-α的能力增強(qiáng)，促進(jìn)和增加組織損傷[17]。多種炎癥細(xì)胞因子在動脈粥樣硬化斑塊區(qū)域高表達(dá)。腫瘤壞死因子可促進(jìn)動脈炎癥及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，刺激單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞；能誘導(dǎo)黏附因子表達(dá)，加快T細(xì)胞、單核細(xì)胞到內(nèi)皮細(xì)胞的募集，可能是SLE相關(guān)心血管疾病的重要因素[18]。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)，與健康對照組相比，只有SLE中LDGs能夠誘導(dǎo)Th1型促炎細(xì)胞因子，包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等，并且證實(shí)LDGs與干擾素基因特征存在直接正相關(guān)，也提示LDGs與干擾素-I途徑的激活密切相關(guān)[19]。干擾素在SLE發(fā)病機(jī)理中起致病作用，主要由漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和干擾素-α合成的激活顯著加速了動脈粥樣硬化的發(fā)展。SLE患者血清干擾素活性與血流介導(dǎo)的舒張功能降低、動脈內(nèi)膜中層厚度升高和冠狀動脈鈣化嚴(yán)重程度獨(dú)立相關(guān)[20]；與SLE患者內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)，導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞耗竭，可能與SLE心血管風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[21]。另外LDGs具有自發(fā)形成NETs傾向，具有更高的合成NETs的能力，SLE中LDGs以線粒體衍生的超氧化物依賴的方式自發(fā)釋放富含氧化線粒體DNA的NETs，導(dǎo)致促炎能力增強(qiáng)，進(jìn)一步刺激漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞合成和釋放干擾素-α[22-23]。LDGs與干擾素之間形成惡性循環(huán)，這種惡性循環(huán)也被認(rèn)為是SLE并發(fā)動脈粥樣硬化干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)。LDGs在外周血液中表達(dá)的基因信號水平明顯高于正常密度的中性粒細(xì)胞，LDGs基因特征與SLE中血管損傷和不穩(wěn)定的冠狀動脈斑塊有關(guān)，也支持LDGs與SLE心血管疾病相關(guān)性的假說[24]。

3.3 NETs促進(jìn)血栓形成

不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊破裂，可導(dǎo)致血栓形成。在血栓出血部位檢測到NETs明顯富集，是血小板和紅細(xì)胞以及纖維蛋白的主要支架。NETs顯著影響動脈粥樣硬化的開始和發(fā)展，并且可以誘導(dǎo)和促進(jìn)動脈血栓的形成、穩(wěn)定和生長[10]。NETs中的多種成分與血栓形成有關(guān)。NETs的DNA成分激活凝血因子Ⅻ(FⅫ)，啟動級聯(lián)反應(yīng)(與凝血因子Ⅺ一起)，最終導(dǎo)致凝血酶的形成；NETs中的組蛋白激活血小板，隔離血栓調(diào)節(jié)蛋白和蛋白C等抗凝分子；NETs中的中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶，裂解抗凝血分子組織因子途徑抑制物和抗凝血酶，還通過多種途徑激活血小板；最后，NETs作為支架組裝和聚集血小板和紅細(xì)胞(RBC)，致使血栓形成[25]。NETs的關(guān)鍵成分——核小體(DNA-組蛋白復(fù)合物)和雙鏈DNA(DsDNA)，病變部位的水平明顯升高，被認(rèn)為是心血管事件的敏感生物標(biāo)志物，也與冠狀動脈血栓NETs負(fù)荷相關(guān)[26]。組織因子/凝血酶軸在SLE炎癥性血栓中起關(guān)鍵作用；活動期SLE患者NETs表達(dá)組織因子和白介素-17A，活動期SLE患者NETs形成的組織因子具有生物活性，可以促使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)增加凝血酶水平[27]。從尸檢檔案中提取30例急性心肌梗死患者64個(gè)石蠟包埋的冠狀動脈斑塊節(jié)段，其中復(fù)雜斑塊44個(gè)(斑塊內(nèi)出血 17個(gè)，糜爛9個(gè)，破裂18個(gè))，完整斑塊20個(gè)。根據(jù)血栓或出血的組織學(xué)年齡，通過免疫組織化學(xué)染色顯示中性粒細(xì)胞(抗髓過氧化物酶、抗彈性蛋白酶和抗CD177)和NETs(抗瓜氨酸組蛋白-3和抗肽基精氨酸脫亞胺酶-4)。結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞和NETs在所有類型的復(fù)雜斑塊中均大量存在，其程度無明顯差異。但在完整斑塊中不存在，而復(fù)雜但不完整斑塊的鄰近血管周圍組織也含有大量的中性粒細(xì)胞和NETs[28]。這可能促進(jìn)血栓形成或出血性并發(fā)癥的進(jìn)展，影響血栓塊的進(jìn)展及穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致隨后的臨床冠脈缺血綜合征的發(fā)生。肽基-精氨酸脫亞胺酶-4和DNase是該過程中的關(guān)鍵酶。一項(xiàng)NZM小鼠的研究顯示，經(jīng)DNase處理后頸動脈血栓含量下降，抑制肽基-精氨酸脫亞胺酶-4可以抑制中性粒細(xì)胞的NETs形成，延長血管閉塞時(shí)間，顯著減輕NZM小鼠的促血栓表型[29]。因此，抑制NETs形成的關(guān)鍵步驟或增加其降解，可能有助于預(yù)防及治療血栓形成。

3.4 NETs介導(dǎo)高密度脂蛋白氧化，損害膽固醇流出能力

SLE中的血脂異常主要表現(xiàn)為高密度脂蛋白水平降低，低密度脂蛋白水平高或不變，被稱為“狼瘡型”血脂異常。在氧化應(yīng)激作用下，低密度脂蛋白形成氧化低密度脂蛋白，氧化型低密度脂蛋白具有高度促炎性。McMahon等[30]描述了高密度脂蛋白本身具有抗炎及抗氧化的作用，可在急性反應(yīng)時(shí)具有促炎能力，保護(hù)低密度脂蛋白抗氧化能力減弱，清除膽固醇能力下降；研究中發(fā)現(xiàn)44.7%的SLE患者具有促炎性高密度脂蛋白，相比對照組升高了4.1%，而且氧化型低密度脂蛋白水平與促炎癥高密度脂蛋白水平相關(guān)；異常高密度脂蛋白損害了低密度脂蛋白氧化的能力，可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成。高密度脂蛋白介導(dǎo)的膽固醇外流是防止泡沫細(xì)胞和動脈粥樣硬化產(chǎn)生的重要因素。NETs與膽固醇流出能力密切相關(guān)，尤其是LDGs形成的NETs。研究證明LDGs與膽固醇流出能力成負(fù)相關(guān)，認(rèn)為中性粒細(xì)胞可能破壞高密度脂蛋白功能，從而促進(jìn)SLE動脈粥樣硬化的形成[24]。SLE患者血液中NETs水平升高，同時(shí)具有髓過氧化物酶(MPO)、NADPH氧化酶(NOX)和一氧化氮合酶(NOS)等多種氧化酶；SLE中LDGs形成的NETs可能是細(xì)胞外氧化酶的重要來源，多種氧化酶會對高密度脂蛋白進(jìn)行氧化修飾，從而降低其有益的膽固醇流出能力，致使動脈粥樣硬化形成[31]。

綜上所述，中性粒細(xì)胞在炎癥及免疫性疾病中起著非常重要的作用。最近越來越多的研究表明NETs參與SLE中動脈粥樣硬化的形成。NETs可能通過損傷內(nèi)皮、促進(jìn)血栓、介導(dǎo)脂質(zhì)氧化等途徑參與SLE動脈粥樣硬化發(fā)展，尤其是LDGs形成的NETs。盡管研究存在挑戰(zhàn)，但NETs研究有望為改善SLE心血管疾病的診斷和治療提供依據(jù)。NETs可能作為早期監(jiān)測及干預(yù)SLE合并動脈粥樣硬化的生物標(biāo)記物和潛在靶點(diǎn)，以減少動脈粥樣硬化的發(fā)生及血栓的形成。但NETs的重要性仍有爭議，仍需要更多的基礎(chǔ)及臨床的探索性研究(圖1)。

圖 1 NETs參與SLE動脈粥樣硬化進(jìn)展機(jī)制Fig 1 NETs participate in the progression of atherosclerosis in SLE

目前關(guān)于NETs的研究更多基于動物模型，在SLE患者群體中涉及較少。對于NETs在自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究仍處于探索階段，尚有許多問題需要解決。未來尋找簡單可靠的方法評估NETs以及找到清除NETs的手段極為重要，對于評估其對人類免疫系統(tǒng)疾病的診治意義，很有價(jià)值。