陳 娟，劉傳麗，陳艷思，王振國，孔祥玲

0 引 言

卵巢惡性腫瘤是女性常見的腫瘤之一，其中以上皮癌最多見，卵巢上皮癌死亡率居于各婦科腫瘤之首［1］。由于卵巢體積小，且發(fā)病時缺乏典型癥狀，難以早期發(fā)現(xiàn)，這使得挖掘可以提示腫瘤發(fā)生及預(yù)后的標(biāo)志物，并探索其分子調(diào)控機(jī)制成為卵巢癌防治的關(guān)鍵［2-3］。越來越多的研究證明［4-5］，炎性微環(huán)境對于惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展具有重要作用，白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）家族是銜接腫瘤與炎癥的關(guān)鍵炎癥因子之一，其中IL-17A 是該家族中最具代表性的成員［6］。既往研究多著重于比較外周血中IL-17A 表達(dá)水平高低與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，欠缺長期隨訪數(shù)據(jù)以及相關(guān)分子機(jī)制的深入探討［7-8］。為此本研究首先從臨床樣本出發(fā)，驗證卵巢癌患者腫瘤組織與癌旁組織IL-17A 表達(dá)變化差異，隨后借助公開臨床數(shù)據(jù)庫-腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）及生物信息學(xué)手段分析IL-17A與患者生存率的相關(guān)性，以及IL-17A 調(diào)控腫瘤的潛在分子機(jī)制，為卵巢癌的防控提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取我中心婦科2018年1月至11月間收治的原發(fā)性卵巢漿液性囊腺癌患者20例，年齡39～72歲，臨床分期為Ⅰ期4例、Ⅱ期8例、Ⅲ期8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理證實為卵巢漿液性囊腺癌；②均為首次進(jìn)行手術(shù)，手術(shù)范圍包括子宮全切+雙附件切除+大網(wǎng)膜及盆腔淋巴結(jié)清掃；③無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④術(shù)前均未接受化療或放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在心、肝、腎等重要臟器疾患；②有自身免疫性疾病，或近期存在感染。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：WJ201712024），患者均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集及檢測根據(jù)術(shù)中快速冰凍病理結(jié)果，分別提取腫瘤組織及癌旁正常組織，-80℃保存。待所有樣本收集完畢后，采用ELISA 法檢測IL-17A 水平。人IL-17A 試劑盒購自美國R&D Systems公司，酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific 公司，檢測過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 數(shù)據(jù)來源及生存曲線分析從Omisc 軟件（http：//www.linkedomics.org）下載卵巢漿液性囊腺癌患者mRNA 數(shù)據(jù)集，篩選出同時包含IL-17A 表達(dá)水平測定和完整臨床數(shù)據(jù)的病例共549例，按照IL-17A 表達(dá)水平由高到低排序，將排在前50%的患者設(shè)為高表達(dá)組（n=275），剩余患者設(shè)為低表達(dá)組（n=274），應(yīng)用GraphPad Prism繪制2組患者生存曲線。

1.3.2 IL-17A 相關(guān)基因篩選選取包含IL-17A 表達(dá)水平測定的RNA 基因芯片數(shù)據(jù)共549例，共檢測基因5309個，利用在線分析工具（http：//www.linkedomics.org/admin.php）將各基因表達(dá)水平逐一與IL-17A 表達(dá)水平進(jìn)行Pearson 相關(guān)性檢測，選取與IL-17A 表達(dá)呈正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)最高50個基因，以及與IL-17A表達(dá)呈負(fù)相關(guān)且相關(guān)系數(shù)最高50個基因，分別繪制基因熱圖［9］。

1.3.3 富集分析選取P<0.05 且相關(guān)系數(shù)絕對值排在前100 的基因，使用DAVID 在線生物信息學(xué)分析工具（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行生物學(xué)注釋和分類，即完成基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書通路（the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway，KEGG 通路）富集分析。GO 富集分析又分為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三個類型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩獨立樣本t 檢驗，生存時間的比較使用Gehan-Breslow-Wilcoxon 分析，相關(guān)基因篩選采用Pearson 相關(guān)性分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌組織與癌旁組織IL-17A 水平比較癌組織IL-17A 表達(dá)水平［（7.23±2.11）ng/L］顯著高于癌旁正常組織［（4.19±1.33）ng/L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 IL-17A 表達(dá)水平差異對生存曲線影響IL-17A 高表達(dá)組中位生存時間高于IL-17A 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［1451 d vs 1348 d，風(fēng)險比（HR）=0.74，95%CI為0.60～0.92，P<0.05］，見圖1。

2.3 IL-17A 相關(guān)基因篩選結(jié)果在檢測的5309個基因中，有2103個基因與IL-17A 存在相關(guān)性（P<0.05），見圖2a。與IL-17A 表達(dá)呈正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)最高50個基因見圖2b，與IL-17A 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)且相關(guān)系數(shù)最高50個基因見圖2c。其中鈣電壓門控通道亞單位α1（calcium voltage-gated channel subunit alpha1 S，CACNA1S）與IL-17A 表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)最高（r=0.6928，P<0.05），見圖2d。

圖1 IL-17A高表達(dá)組與低表達(dá)組遠(yuǎn)期生存率比較

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析GO 富集分析結(jié)果顯示，主要涉及的生物學(xué)過程包括生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)和多細(xì)胞生物過程，主要涉及的細(xì)胞組分為細(xì)胞膜、細(xì)胞核和囊泡，主要涉及的分子功能為蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合和轉(zhuǎn)運活性，見圖3。KEGG 通路富集分析顯示，主要涉及的信號通路為泛醌10 和其他萜類醌的生物合成、三磷酸腺苷（ATP）綁定蛋白轉(zhuǎn)運、類固醇生物合成、補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用和神經(jīng)突觸激活，見圖4。

圖2 與IL-17A相關(guān)性較高的基因篩選結(jié)果

圖3 與IL-17A呈正、負(fù)相關(guān)的前50個基因的GO富集分析

圖4 與IL-17A 呈正、負(fù)相關(guān)的前50個基因的KEGG 通路富集分析

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其所處微環(huán)境密切相關(guān)，炎性細(xì)胞及相關(guān)炎癥因子是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。慢性炎癥可促進(jìn)腫瘤惡變，同時惡變的腫瘤細(xì)胞還可主動募集炎性細(xì)胞，形成適宜生長的炎性環(huán)境［10-11］。IL-17 是T 輔助細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）分泌的炎癥因子，其中IL-17A 作為IL-17家族的主要成員，在自身免疫性疾病和過敏性疾病中扮演重要角色［12］。近期研究發(fā)現(xiàn)，其在卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用。陳獻(xiàn)等［13］發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者癌組織中IL-17A 陽性率顯著高于卵巢交界性腫瘤和良性卵巢腫瘤患者的腫瘤組織，熊雯等［14］亦發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清中IL-17 表達(dá)顯著上調(diào)。本研究通過卵巢漿液性囊腺癌患者腫瘤組織的檢測發(fā)現(xiàn)，IL-17A 在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，這與多數(shù)研究結(jié)果一致，這可能是由于慢性炎癥的存在可削弱機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移［15-17］。

但是亦有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在促進(jìn)腫瘤內(nèi)部的血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的同時，又可通過增強細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性從而抑制肥大細(xì)胞瘤及漿細(xì)胞瘤的生長，即IL-17 在腫瘤的形成中具有雙重作用［18］，這提示需要更多的臨床隨訪數(shù)據(jù)去觀察IL-17A 與惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系，以便于進(jìn)一步探討IL-17A 的作用機(jī)制并制定防治策略。TCGA 數(shù)據(jù)庫在過去的十余年里收錄了加拿大和美國地區(qū)11 000 多例腫瘤組織以及相匹配的正常組織，和約2.5 PB 的高通量基因組測序結(jié)果，TCGA 創(chuàng)建的基因組數(shù)據(jù)分析流程，可有效收集、選擇和分析組織基因組改變，并結(jié)合收錄患者的診斷和治療信息，為改進(jìn)癌癥預(yù)防、早期檢測和治療提供了強大的研究基礎(chǔ)［19］。本研究通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫中549例卵巢漿液性囊腺癌患者的隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，IL-17A 表達(dá)水平升高提示預(yù)后良好，這與Lan 等［20］的研究結(jié)果類似，其通過對104例卵巢癌患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，IL-17高表達(dá)與晚期卵巢癌中無進(jìn)展生存期的改善相關(guān)。這可能由于腫瘤細(xì)胞在募集炎癥因子的同時，炎癥因子本身也可作為一種第二信使，刺激腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中免疫細(xì)胞的聚集，特別是T細(xì)胞，從而增強腫瘤細(xì)胞的清除，IL-17A 介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用強于慢性炎癥帶來的腫瘤血管生成作用，故呈現(xiàn)為IL-17A高表達(dá)促進(jìn)了患者遠(yuǎn)期生存率的提高。

但是IL-17A 具體作用的靶點尚不明確，為此本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中的基因檢測結(jié)果，篩選出與IL-17A 表達(dá)密切相關(guān)的基因，并進(jìn)行富集分析，以求挖掘出潛在機(jī)制。結(jié)果可見，CACNA1S 與IL-17A 表達(dá)水平相關(guān)性最為明顯。CACNA1S 基因位于染色體1q31-32 上，編碼L-型鈣通道的主要功能單位α1 亞基。al 亞基包含4個同源的結(jié)構(gòu)域，它們排列對稱，圍成中間的親水通道，隨膜電位發(fā)生變化而形成構(gòu)象變化，調(diào)節(jié)通道的開閉［21-22］。研究結(jié)果提示卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)展與電壓門控通道的改變存在相關(guān)性，這可能是由于前列腺素、趨化因子、炎性細(xì)胞因子等可間接或直接作用于細(xì)胞表面受體，影響胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度，使胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生改變，影響腫瘤細(xì)胞的增殖與腫瘤血管形成。

GO 富集分析結(jié)果提示，多數(shù)相關(guān)基因與蛋白質(zhì)結(jié)合和生物調(diào)節(jié)相關(guān)，編碼蛋白主要定位于細(xì)胞膜，這也與篩選出的CACNA1S 基因功能高度一致。KEGG 通路富集分析顯示，相關(guān)基因主要集中于泛醌10 和其他萜類醌的生物合成通路。泛醌10 又稱輔酶Q10，與多數(shù)類固醇、類萜等生物分子類似，主要由乙酰輔酶A 經(jīng)甲羥戊酸途徑合成［23］，作為線粒體氧化呼吸鏈中的內(nèi)源性抗氧化劑和電子載體，其在腫瘤細(xì)胞中可參與鐵死亡過程。鐵是人體生理活動中不可缺少的元素之一，近年來研究表明鐵元素可參與線粒體氧化磷酸化，并可促使細(xì)胞產(chǎn)生過量活性氧，進(jìn)而損害核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這種新的細(xì)胞死亡形式被稱為鐵死亡［24］。在卵巢惡性腫瘤組織，以及卵巢癌起始細(xì)胞模型中膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白含量可顯著減少［25］，也提示鐵代謝異常可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究通過臨床標(biāo)本驗證了IL-17A在卵巢癌中的表達(dá)差異，及其與預(yù)后的相關(guān)性，并進(jìn)一步基于IL-17A從數(shù)據(jù)庫挖掘卵巢癌的潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)IL-17A 相關(guān)基因的功能特征主要富集在細(xì)胞膜表面的電壓門控通道的調(diào)控及細(xì)胞凋亡過程，為IL-17A的臨床價值提供了生物信息學(xué)證據(jù)支持。