黃婷婷，柴 琳，王振杰，俞 玲

0 引 言

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），簡(jiǎn)稱口腔癌，惡性程度較高，約占頜面部惡性腫瘤的90%以上［1］?？谇话┑陌l(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，雖然治療上已經(jīng)取得了許多重要進(jìn)展，然而口腔癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下，患者的生存質(zhì)量及預(yù)后情況不理想［2］。因此，尋求一種新的、有效的治療方法是目前治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究熱點(diǎn)。自噬和凋亡是兩個(gè)重要的細(xì)胞過(guò)程，是細(xì)胞對(duì)各種應(yīng)激所致的細(xì)胞損傷做出應(yīng)答。自噬是一種依賴溶酶體的降解途徑，是一種普遍存在的生命現(xiàn)象［3］，它是細(xì)胞降解的重要途徑［4-5］。自噬還參與多種病理生理過(guò)程。有研究表明，自噬的活性與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［6-7］。因此，研究自噬發(fā)生的機(jī)制并有目的的干預(yù)，進(jìn)而有效地控制自噬水平，對(duì)研究腫瘤的治療方法將會(huì)是一個(gè)新的突破。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體細(xì)胞在受到內(nèi)源性或外源性信號(hào)刺激時(shí)，凋亡控制基因程序被激活，經(jīng)過(guò)多條信號(hào)通路傳遞的自殺性保護(hù)過(guò)程。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，是由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，高水平的自噬可能引起線粒體等細(xì)胞器的過(guò)度降解，并促進(jìn)細(xì)胞死亡［8-9］。

尖吻蝮蛇毒組分I（component I from Agkistrodon Acutus Venom，AAVC-I）是將皖南五步蛇粗毒經(jīng)過(guò)Cellulose DE-52 離子交換和Sephadex G-75 分子篩兩步層析后獲得的一種抑瘤組分，酸性蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為27 kD，研究表明AAVC-I 具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的效應(yīng)［10］。并且AAVC-I 在肺癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞中可以通過(guò)線粒體凋亡途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［6-7］。本實(shí)驗(yàn)研究探討AAVC-I 對(duì)人口腔鱗狀癌細(xì)胞的促凋亡作用及對(duì)自噬的影響，為今后口腔鱗癌的進(jìn)一步研究和新藥研發(fā)提供有利的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人口腔鱗狀細(xì)胞癌HN4 細(xì)胞來(lái)自于皖南醫(yī)學(xué)院病理生理教研室。胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。AAVC-I 來(lái)自于皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所。MTT 試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。β-actin 抗體和活化的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）抗體購(gòu)于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥將AAVC-I 凍干粉溶于培養(yǎng)基中，配制不同濃度的AAVC-I。將培養(yǎng)的HN4細(xì)胞分為4 組：對(duì)照組，AAVC-I 低濃度組，AAVC-I中濃度組，AAVC-I 高濃度組。AAVC-I 低、中、高濃度組分別給予2.5、5、10 μg/mL AAVC-I處理，對(duì)照組在同一時(shí)間給予相等劑量的溶劑（2 mL的培養(yǎng)基）。

1.2.2 HN4 細(xì)胞培養(yǎng)將人口腔鱗狀癌HN4 細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行常規(guī)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的抑制率MTT 法測(cè)定HN4細(xì)胞增殖活性，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HN4細(xì)胞，接種于96孔板。按1.2.1方案分組，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，去上清。每孔加入配制好的MTT 50 μL，在37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，在酶聯(lián)檢測(cè)儀上570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）值，重復(fù)3次。

1.2.4 免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)給予AAVC-I 24 h 后，收集細(xì)胞用胰酶消化細(xì)胞，離心半徑8 cm、1000 r/min，離心5 min，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心，提取總蛋白。用15%SDS-PAGE 膠電泳分離所提取的蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，將帶有目標(biāo)蛋白的膜裁好并加入5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，然后根據(jù)抗體說(shuō)明書孵育一抗和內(nèi)參過(guò)夜，第2 天用TBST 緩沖液漂洗10 min×3 次，用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育2 h，再用TBST漂洗10 min×3次，ECL 發(fā)光液試劑盒暗室曝光。蛋白水平用UN-SCAN-IT 軟件（Silk Scientific Inc.，Orem，UT，USA）處理分析。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Caspase-3 的表達(dá)量制作細(xì)胞爬片。藥物作用24 h 后，取適量0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），處理20 min，3%H2O2室溫放置10 min，吸取液體立即滴加適量山羊血清封閉液，然后在37℃溫箱中封閉30 min。一抗孵育4℃冰箱中過(guò)夜，PBS 清洗2 min×3 遍。二抗37℃孵育30 min，PBS 清洗2 min×3 遍后，滴加鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）試劑，37℃溫育30 min，PBS 清洗2 min×3 遍。最后，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色及梯度酒精脫水。

1.2.6 JC-1 法檢測(cè)線粒體膜電位根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，配制JC-1 染色工作液。藥物作用24 h 后，每孔加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃孵育20 min。然后吸除上清，每孔取適量的JC-1緩沖液（1×）清洗2遍。

1.2.7 免疫熒光法檢測(cè)LC3 蛋白的表達(dá)量制作細(xì)胞爬片。取適量破膜液完全破膜，滴加牛血清白蛋白（BSA）孵育30 min 進(jìn)行血清封閉，加一抗4℃孵育，加二抗避光孵育50 min。取適量DAPI染液滴加在片子上，避光室溫孵育10 min。洗滌3 次，每次5 min。等片子稍甩干后，用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡給予AAVC-I 24 h 后收集細(xì)胞。用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化后離心，收集細(xì)胞。先用冷PBS 洗滌細(xì)胞，1000×g 離心5 min，棄上清，加入400 μL Annexin V結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻2～8 oC 孵育15 min；加入10 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻2～8oC 孵育5 min。立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AAVC-I 對(duì)HN4 細(xì)胞增殖的影響不同濃度的AAVC-I 作用24 h 后，隨著AAVC-I 濃度的增加，AAVC-I 低、中、高濃度組HN4 細(xì)胞的增殖抑制率呈上升趨勢(shì)。AAVC-I 低、中、高濃度組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但AAVC-I低濃度組與AAVC-I 中濃度組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 Western blot 法檢測(cè)Cleaved Caspase-3 的蛋白表達(dá)AAVC-I 處 理HN4 細(xì) 胞24 h 后，隨 著AAVC-I 濃度增加，Cleaved Caspase-3 表達(dá)增加，提示細(xì)胞凋亡增加。組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1，表2。

表1 不同濃度AAVC-I對(duì)HN4細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）

表1 不同濃度AAVC-I對(duì)HN4細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，#P<0.05

圖1 各組Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)量

表2 Western blot法檢測(cè)各組Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 Western blot法檢測(cè)各組Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)量比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I低濃度組比較，#P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.05

2.3 免疫組化法檢測(cè)Cleaved Caspase-3 的表達(dá)不同濃度AAVC-I 處理HN4 細(xì)胞24 h 后Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)增加，與對(duì)照組比較，隨著AAVC-I 濃度的增加Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2，表3。

表3 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細(xì)胞后Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細(xì)胞后Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I低濃度組比較，#P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.05

圖2 免疫組化法檢測(cè)各組Caspase-3的表達(dá)（×200）

2.4 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位不同濃度AAVC-I作用HN4細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，AAVC-I不同濃度組隨著AAVC-I 濃度的增加，紅色熒光逐漸減少，綠色熒光逐漸增加。各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

2.5 免疫熒光法檢測(cè)LC3 蛋白的表達(dá)量不同濃度的AAVC-I 作用24 h 后，隨著AAVC-I 濃度的增加細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，免疫熒光法檢測(cè)LC3 蛋白的表達(dá)量結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，AAVC-I 低、中、高濃度組LC3 蛋白的表達(dá)量逐漸增加（P<0.05）。見圖3，表5。

2.6 AAVC-I 處理后HN4 細(xì)胞的凋亡情況流式細(xì)胞儀檢測(cè)HN4 細(xì)胞凋亡情況顯示，隨著AAVC-I藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也隨著藥物濃度增加而逐漸增加，并且各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4，表6。

表4 不同濃度AAVC-I 對(duì)HN4 細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s）

表4 不同濃度AAVC-I 對(duì)HN4 細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I 低濃度組比較，#P<0.05、##P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.01

表5 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細(xì)胞后LC3 蛋白的表達(dá)量比較（±s）

表5 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細(xì)胞后LC3 蛋白的表達(dá)量比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I低濃度組比較，#P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.01

圖3 免疫熒光檢測(cè)AAVC-I處理后LC3蛋白的表達(dá)量（×200）

圖4 不同濃度AAVC-I對(duì)HN4細(xì)胞凋亡的影響

表6 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況（±s）

表6 不同濃度AAVC-I 處理HN4 細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況（±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與AAVC-I低濃度組比較，#P<0.01；與AAVC-I中濃度組比較，△P<0.01

3 討 論

口腔癌狀細(xì)胞癌是危害人類健康和生命常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和精神狀態(tài)，據(jù)報(bào)道全球每年新增患者約10萬(wàn)人［11］。目前口腔癌的臨床治療手段并不能完全治愈，只能延緩疾病進(jìn)程，緩解患者癥狀［12］，且中晚期患者的5年生存率依舊很低［13-14］。毒蛇作為一種天然的藥用資源，具有廣泛的生物學(xué)活性，其中在抗腫瘤方面具有廣闊的應(yīng)用前景。大量研究表明，從蛇毒粗度中提取的活性成分除了抗凝、促凝、止痛等功效外，還具備傳統(tǒng)抗腫瘤藥物所具有的功效［15］。而從皖南地區(qū)尖吻蝮蛇提取物（AAVC-I）同樣具有抗腫瘤作用，本研究主要探索AAVC-I 在人口腔鱗癌HN4 細(xì)胞中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用以及對(duì)自噬的影響。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的自主而有序的死亡過(guò)程。線粒體調(diào)節(jié)膜電位并控制細(xì)胞程序性死亡，當(dāng)其受到不良刺激，線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點(diǎn)處生成通透性轉(zhuǎn)變孔道，會(huì)使線粒體膜通透性提高，引起線粒體跨膜電位不可逆下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16-17］。線粒體膜通透性增加也能使誘導(dǎo)凋亡因子（AIF）等分子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bax 具有孔形成能力，并能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 從線粒體釋放入胞漿［17-18］，在dATP存在時(shí)與凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）結(jié)合并激活Caspase-9，后者繼而激活Caspase-3。Caspase-3是Caspase 家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是凋亡途徑下游進(jìn)行底物酶解的關(guān)鍵蛋白酶，被認(rèn)為是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)［19-20］。自噬是依賴溶酶體對(duì)大分子蛋白質(zhì)和某些細(xì)胞器進(jìn)行降解再利用的過(guò)程，基礎(chǔ)水平的自噬對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，但高水平自噬也有可能過(guò)度降解細(xì)胞器，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［21］。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及本研究結(jié)果顯示，AAVC-I可能通過(guò)某些途徑上調(diào)Caspase-3 蛋白的表達(dá)水平，并具有濃度依賴性，JC-1檢測(cè)結(jié)果表明Caspase-3蛋白的表達(dá)水平可能與細(xì)胞膜電位的改變有關(guān)，同時(shí)免疫熒光檢測(cè)到LC3 表達(dá)增加，表明AAVC-I 可提高HN4 細(xì)胞的自噬水平，提示AAVC-I 對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的促凋亡作用可能是通過(guò)降低線粒體膜電位引起Caspase-3的表達(dá)增加，并提高自噬水平。

綜上所述，AAVC-I 對(duì)HN4 細(xì)胞有抑制其增殖、誘導(dǎo)其凋亡作用，這可能是通過(guò)降低線粒體膜電位進(jìn)而上調(diào)Caspase-3 蛋白的表達(dá)及提高自噬水平實(shí)現(xiàn)的。凋亡和自噬兩者的相互關(guān)系及轉(zhuǎn)換機(jī)制還需要詳細(xì)的研究［22］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可為今后研究口腔鱗癌治療方法提供有利依據(jù)，但是細(xì)胞的凋亡過(guò)程較為復(fù)雜，又有多種基因參與細(xì)胞的凋亡，因此AAVC-I 在人口腔鱗癌細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。