劉 林 李佳佳 張 鳳

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，安徽 蚌埠 233000

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse largeB-cell lymphoma，DLBCL)是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤。有文獻(xiàn)報(bào)道DLBCL在歐美國(guó)家NHL發(fā)病率約占40%[1]，在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率比例更高。因此積極尋找更多的治療靶點(diǎn)是十分必要的。表觀遺傳學(xué)是指基因表達(dá)或蛋白表達(dá)的改變不涉及DNA序列變化，但又可穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象，主要包括基因組印記、DNA甲基化、組蛋自修飾和非編碼RNA等。DNA甲基化與組蛋白乙?；赏ㄟ^(guò)甲基CpG結(jié)合蛋白(MeCP)協(xié)同調(diào)控基因表達(dá)，因而可通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與HDACI協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞，使失活的抑癌基因恢復(fù)功能，克服耐藥性，減輕不良反應(yīng)，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。鑒于此，本研究采用去甲基化藥物5-Aza-CdR及SAHA處理彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤SU-DHL-4細(xì)胞株，觀察5-Aza-CdR及SAHA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)SHP-1表達(dá)水平的變化，探討其作用與機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

紫外分光光度儀(型號(hào)：NANODROP 8000，美國(guó)Thermo Scientific公司)；反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用試劑(日本TaKaRa公司)；GAPDH及SHP-1引物(上海英駿生物公司合成)；5-Aza-CdR、SAHA、MTT試劑(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SU-DHL-4細(xì)胞株(上海瑞金醫(yī)院血液學(xué)研究所趙維蒞教授饋贈(zèng))。從液態(tài)氮罐取出后，用含有10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，放置于培養(yǎng)箱(溫度37 ℃、5%CO2、空氣飽和濕度95%)。每2 d換液傳代。5-Aza-CdR處理細(xì)胞時(shí)，維持細(xì)胞密度在0.5×106～1×106/ml，用終濃度為1μM的5-Aza-CdR處理細(xì)胞，隔日半量換液，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液和藥物調(diào)整至終濃度，持續(xù)培養(yǎng)48 h后，再加入終濃度為2μM的SAHA，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，第4 d收集1×107以上數(shù)量細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)不同濃度的5-Aza-CdR和SAHA單用及聯(lián)合使用對(duì)各細(xì)胞株的增殖抑制作用。各細(xì)胞株，以每孔15000個(gè)細(xì)胞分別將細(xì)胞懸浮于濃度為0.25μM、0.5μM、1μM和2μM的5-Aza-CdR和SAHA培養(yǎng)液中，接種于96孔板中。設(shè)對(duì)照組(不加藥)和空白孔組(只有培養(yǎng)液無(wú)細(xì)胞)。先用5-Aza-CdR處理48 h，然后加用SAHA繼續(xù)處理24 h；72 h后，向每孔中加入0.1 mg MTT， 37 ℃作用4 h后，每孔加入180 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量標(biāo)本吸光度(A)值并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算平均A值，按照公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)設(shè)3復(fù)孔，反復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-A加藥組/A對(duì)照組)×100%

1.4 SYBR Green熒光染料標(biāo)記的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

分別用終濃度為用1 μmol/L的5-Aza-CdR、2μmol/L的SAHA及兩藥聯(lián)合應(yīng)用處理SU-DHL-4細(xì)胞，培養(yǎng)72h后收集對(duì)照組與加藥組細(xì)胞，按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用分光光度法檢測(cè)RNA的濃度和純度，A260/A280比值均為1.9～2.1，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求采取兩步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH基因作為內(nèi)參。設(shè)計(jì)過(guò)程：首先，在Nucleotide中查找基因序列，然后使用軟件Primer 3.0設(shè)計(jì)，最后做BLAST分析核對(duì)引物的特異性及可行性。PCR反應(yīng)分三步：第一步，95 ℃，30 s；第二步，95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；第三步，95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s；共40個(gè)循環(huán)。同時(shí)擴(kuò)增SHP-1基因和內(nèi)參基因，溶解曲線檢測(cè)產(chǎn)物的特異性，所得結(jié)果和同期擴(kuò)增內(nèi)參基因做比較，用基因相對(duì)定量法(2-ΔΔCt)計(jì)算各組基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)：ΔCt=待測(cè)基因CT值-內(nèi)參基因CT值，-ΔΔCt=待測(cè)基因ΔCt-對(duì)照基因ΔCt，每個(gè)基因做3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用SNK-q檢驗(yàn)， 以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5-Aza-CdR及SAHA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增殖的抑制作用

各濃度5-Aza-CdR及SAHA均可以不同程度的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且表現(xiàn)為濃度依賴性。在終濃度為0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、和2μmol/L5-Aza-CdR及SAHA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞的抑制率分別為8.13%、13.42%、28.07%、43.39%和6.99%、10.38%、14.87%、21.03%，1μmol/L5-Aza-CdR及2μmol/SAHA聯(lián)合應(yīng)用后，SU-DHL-4細(xì)胞的增殖抑制率增高為52.23%，且不同藥物濃度間吸光度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(表1)

表1 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤SU-DHL-4細(xì)胞株增殖抑制情況

注：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-A加藥組/A對(duì)照組)×100%；a與對(duì)照組比較；加藥組內(nèi)各組間比較，P<0.01.

2.2 5-Aza-CdR及SAHA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞SHP-1基因表達(dá)的影響

擴(kuò)增曲線可見(jiàn)GAPDH及SHP-1基因擴(kuò)增一致，分析融解曲線可以確定SHP-1基因產(chǎn)物的特異性(表2)。對(duì)其進(jìn)行相對(duì)定量分析，可見(jiàn)加藥組SHP-1基因表達(dá)量升高，其中去甲基化藥物5-Aza-CdR使基因表達(dá)量增加的更明顯，并且兩藥聯(lián)合應(yīng)用后SHP-1的表達(dá)量進(jìn)一步增加,兩兩比較均可見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 SHP1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況

注：相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt表示；a與對(duì)照組比較；任意各組兩兩比較，P值均<0.01。

3 討 論

DLBCL是是一種高侵襲性腫瘤，也是非霍奇金淋巴瘤中最常見(jiàn)的類型，在細(xì)胞起源、形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)表型、分子遺傳學(xué)、累及部位、化療反應(yīng)及生存率等方面都表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。近年來(lái)，隨著CD20單克隆抗體-美羅華的使用，使生存率有了顯著性提高，但仍有部分復(fù)發(fā)難治患者可因疾病進(jìn)展生存期明顯下降。

5-Aza-CdR是脫氧胞苷的類似物，可以通過(guò)整合入DNA干擾DNA對(duì)甲基的接受能力，或直接抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，最終導(dǎo)致DNA甲基在細(xì)胞分裂周期中進(jìn)行性丟失而產(chǎn)生低甲基化，使某些基因重新激活，因此其可作為一種表觀遺傳學(xué)藥物干預(yù)腫瘤中相關(guān)基因的表達(dá)[2]。SAHA屬羥肟酸類組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可通過(guò)抑制在腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的HDAC，提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙?；?，中和組蛋白的電荷，引起核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活部分抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控抑癌基因的再表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。可以通過(guò)增加組蛋白的乙?；癄顟B(tài)，中和組蛋白的電荷，使DNA結(jié)構(gòu)變得更加松散、開(kāi)放，增加轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)入，從而促使某些沉默的抑癌基因重新表達(dá)。SHP-1基因位于第12號(hào)染色體的p12-p13區(qū), 是一種含有SH2結(jié)構(gòu)域且主要在造血細(xì)胞中表達(dá)的胞質(zhì)蛋白 - 酪氨酸磷酸酶[3], 是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)節(jié)因子[4]。K.Amara等[5]發(fā)現(xiàn)了B細(xì)胞淋巴瘤/白血病病人病理組織中SHP-1基因高頻率的高甲基化狀態(tài)，且SHP-1甲基化患者的生存期有縮短的趨勢(shì)，提示SHP-1基因沉默是疾病發(fā)生的關(guān)鍵事件之一。

5-Aza-CdR能使甲基化沉默的基因重新被激活，恢復(fù)其正常功能。HDAC抑制劑主要是通過(guò)改變組蛋白的乙?；潭葋?lái)干擾腫瘤細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙酰化和去乙?；癄顟B(tài)的平衡，可引起染色體重建和細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和自噬、調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤抑制基因的脫乙?；饔肹6]。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤SU-DHL-4細(xì)胞株給予5-Aza-CdR及SAHA處理后可發(fā)現(xiàn)對(duì)其增殖有較明顯的抑制作用，聯(lián)合用藥組抑制率更高，且各加藥組吸光度之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)，定量PCR檢測(cè)到加藥后SHP-1在基因和蛋白水平均恢復(fù)表達(dá)，聯(lián)合用藥組較單藥組表達(dá)量更高，其中單用5-Aza-CdR較單用SAHA組SHP-1表達(dá)恢復(fù)的更明顯，可能是去甲基化藥物5-Aza-CdR在降低SHP-1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化的作用更大，也更直接一些。

總之，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)5-Aza-CdR及SAHA具有抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)，針對(duì)加藥后SHP-1表達(dá)量的明顯升高，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了特異性甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR及組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA可通過(guò)去甲基化及組蛋白乙?；缺碛^遺傳修飾，重新激活沉默的SHP-1基因，促使SHP-1基因恢復(fù)表達(dá)，從而起到抑制SU-DHL-4細(xì)胞增殖的作用。