孫平平，石雅君，張 磊，李小燕，馬 強，李正男

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學園藝與植物保護學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010011）

我國是世界最大的蘋果和梨生產(chǎn)國[1]，隨著蘋果和梨種植面積和產(chǎn)量的快速增加，果園管理不當引起的病蟲害問題逐漸嚴重。由貝倫格葡萄座腔菌（Botryosphaeria berengeriana）引起的輪紋病又稱瘤皮病、粗皮病、水爛病，是核果和仁果類果樹的主要病害，該病原菌能侵染果實、枝干，也可危害葉片，枝干發(fā)病后，促使樹勢早衰，果實受害，造成爛果和爛窖[2-3]，全國每年因輪紋病造成直接經(jīng)濟損失達30億～50億元[4]。

我國氣候條件多樣，蘋果和梨種質(zhì)資源豐富，了解不同蘋果、梨品種對梨輪紋病的抗性水平，比較抗病品種和感病品種在病原菌侵染過程中的顯微結(jié)構(gòu)差異，可為培育抗病品種，了解輪紋病害的侵染機制以及對該病害的防控提供參考。截至目前，侯暉等[5]、魏樹偉等[6]分別完成了189份蘋果種質(zhì)資源和43份梨種質(zhì)資源枝干的輪紋病抗性鑒定工作；張玉經(jīng)等[7]完成了279份蘋果種質(zhì)資源果實的輪紋病抗性鑒定。楊麗麗等[8]利用掃描和透射電鏡比較了抗病品種和感病品種果實表面及皮下組織亞顯微結(jié)構(gòu)的變化情況，表明病菌侵染后果面產(chǎn)生的分泌物與抑菌和抗侵入有關(guān)。上述研究均以商品化的大蘋果品種和野生資源為主，除金紅外，對內(nèi)蒙古自治區(qū)地產(chǎn)小蘋果果實的抗性鑒定均未見報道。

內(nèi)蒙古是我國典型的冷寒種植區(qū)，該地區(qū)光照強，晝夜溫差大，果實品質(zhì)上乘，高產(chǎn)耐貯，主要種植金紅、雞心果、沈農(nóng)2號、海紅果以及早酥梨、蘋果梨等耐寒抗旱品種[9-11]。為了探究內(nèi)蒙古地產(chǎn)蘋果、梨品種對輪紋病的抗性，本研究基于果實接種輪紋病菌后的發(fā)病率和病斑大小，以秋香和富士兩個蘋果品種為對照，對呼和浩特地區(qū)特色蘋果和梨果實對輪紋病的抗性進行鑒定，篩選出了易感和抗病兩個品種，并在顯微鏡下比較了輪紋菌侵染果實的過程，旨在為寒、旱地區(qū)拮抗輪紋病種質(zhì)資源研究和抗病品種繁育提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

秋香（Malus domestica Borkh.cv.Qiuxiang）和富士（Malus domestica Borkh.cv.Red Fuji）兩個大蘋果品種采集自山東省煙臺市商業(yè)果園，金紅、沈農(nóng)2號、綠紅寶、雞心果、火焰海棠以及蘋果梨和早酥梨，采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市周邊果園（北緯40°51′～41°8′， 東經(jīng)110°46′～112°10′）。采集的果實均放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

輪紋病菌（Botryosphaeria berengeriana）從感病的果實中分離、純化、保存[12]，將保存的病原菌轉(zhuǎn)入PDA 平板，25℃培養(yǎng)7 d后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 待測品種對輪紋病的抗性測定 參考SADEGHIAN 等[13]的方法測定待測品種對輪紋病的活體防效。每個品種各選12～30個健康果實，自來水沖洗后，1%NaClO 表面消毒5 min，再用無菌水沖洗晾干；取孔徑為4 mm的輪紋病菌菌餅，菌絲面朝向果實貼在晾干后的果實表面，用膠帶固定，接種果實放置在鋪有雙層紗布的盆中，蓋上保鮮膜保濕，放置在培養(yǎng)箱中25℃、濕度75%、18 h/6 h 光暗培養(yǎng)。秋香和富士作為對照，每個處理6個果實，1個果實接種2個菌餅。海棠每個處理15個果實，其他品種每個處理10個果實，每個果實接種1個菌餅。隨時觀察病原菌的侵染情況，開始發(fā)病后統(tǒng)計病斑直徑和感病果實數(shù)，計算發(fā)病率和平均病斑直徑。平均病斑直徑為當天所有發(fā)病果實上病斑直徑的平均值。

發(fā)病率/%=（發(fā)病的果實個數(shù)/待測果實總數(shù)）×100

1.2.2 病原菌侵入過程觀察比較 根據(jù)不同果實對輪紋病菌的抗性比較結(jié)果，分別選取對輪紋病高感和高抗的兩個蘋果品種，按照上述方法接種輪紋病菌，感病品種在處理后的12 h、1 d、3 d、5 d、7 d 取樣，抗病品種在接種后的3、5、7、10、14 d 取樣，參照ZHANG 等[14]的方法，對待測品種的果皮、果肉及菌絲結(jié)構(gòu)進行觀察，具體如下：在果實表面切取約1 cm3果皮和果肉樣品，用無菌刀片將取樣部位水平或者垂直切成薄片，用鑷子取切好的樣品在95%乙醇和冰醋酸的等體積混合液中浸泡5 min，用0.05%的棉蘭乳酚油染色10 min。光學顯微鏡下（OlympusBX51，Japan）觀察果皮結(jié)構(gòu)，比較抗病品種和感病品種在接種病原菌后的侵染過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蘋果、梨品種果實對輪紋病抗性結(jié)果

9個待測蘋果和梨品種在接種輪紋病菌后的發(fā)病情況具有顯著差異（表1、表2、圖1）。接種輪紋病菌4 d后海棠、雞心果、綠紅寶和蘋果梨開始發(fā)病，火焰海棠、雞心果、綠紅寶的發(fā)病率均低于30%，蘋果梨的發(fā)病率達到100%，平均病斑直徑為0.85 cm。接種后5 d，早酥梨開始發(fā)病，發(fā)病率為38%，平均病斑直徑為1.62 cm。接種6 d后富士、秋香和金紅開始發(fā)病。接種8 d后沈農(nóng)2號仍未發(fā)病，富士的發(fā)病率為35%，其他7個待測品種的發(fā)病率均在50%以上?；鹧婧Ｌ脑诮臃N4 d后發(fā)病果實的平均病斑直徑為1.18 cm，接種7 d后的病斑直徑達到2.60 cm，病斑已經(jīng)達到果實的1/2 以上，金紅雖然在接種6 d后開始發(fā)病，但是病斑發(fā)展相對較快，在接種8 d后的平均病斑直徑達到4.13 cm。

綜合發(fā)病率、病斑直徑和病斑擴展速率，待測的9種果實中蘋果梨、火焰海棠為輪紋病的高感品種，綠紅寶、金紅、雞心果和早酥梨為易感品種，富士和秋香相對抗病，沈農(nóng)2號對蘋果輪紋病的抗性最強，為高抗品種。因此，選擇高感品種火焰海棠和高抗品種沈農(nóng)2號進行病原菌侵染過程比較觀察。

表1 不同品種果實接種輪紋病后的發(fā)病率 單位：%

表2 不同品種果實接種輪紋病后的病斑直徑 單位：cm

2.2 輪紋病菌侵染火焰海棠和沈農(nóng)2號果實過程觀察

火焰海棠在接種輪紋病菌12 h后，果皮上未見附生菌絲（圖2a），在接種1 d后，病原菌菌絲在果皮上大量繁殖（圖2b），在接種后2 d 可以觀察到部分菌絲穿透果皮進入果肉細胞（圖2c），接種3 d后病原菌在果肉細胞間隙之間大量繁殖，并且菌絲頂端逐漸形成丫狀分支（圖2d），接種后5 d 可以觀察到菌絲頂端加粗增殖，形成火柴頭狀突起，菌絲進入果肉細胞（圖2e），接種7 d后果肉細胞排列更加松散，細胞間隙和細胞內(nèi)均有大量的菌絲繁殖（圖2f）。

沈農(nóng)2號在接種輪紋病菌6 d 內(nèi)，細胞組織未見差異，7 d 時果皮開始出現(xiàn)裂紋，但細胞形態(tài)依然正常（圖3a）；10 d 在果皮表面出現(xiàn)大量菌絲（圖3b），14 d 觀察到菌絲頂端形成丫狀分支，有的頂端加粗形成蹼狀結(jié)構(gòu)，果肉細胞內(nèi)大量菌絲繁殖（圖3c）。

3 結(jié)論與討論

由于試驗方法和鑒定指標不同會引起不同品種對輪紋病的抗病性評價結(jié)果不同，而采用室內(nèi)離體果實接種鑒定的方法相對具有更好的應用價值[7]，因此，本研究通過室內(nèi)離體接種果實對輪紋病的抗性進行鑒定，并通過統(tǒng)計發(fā)病率、病斑大小，同時考慮病斑擴展速率評價不同品種的抗病水平。綜合接種輪紋病菌后果實發(fā)病時間、發(fā)病率、病斑直徑和病斑擴展情況，證明9種待測品種果實中蘋果梨、火焰海棠為輪紋病的高感品種，綠紅寶、金紅、雞心果和早酥梨為中感品種，富士和秋香相對較抗病，沈農(nóng)2號對蘋果輪紋病的抗性最強，為抗性品種。該結(jié)果與張玉經(jīng)等[7]評價的金紅果實為中感品種，秋香為中抗品種的結(jié)果一致。

通過對高感品種火焰海棠和高抗品種沈農(nóng)2號接種輪紋病菌后的菌絲侵染過程進行觀察，從輪紋病菌對不同抗病品種果實的侵染情況肯定了火焰海棠的高感和沈農(nóng)2號的高抗。輪紋病菌在侵染果實過程中均表現(xiàn)出在果皮上大量繁殖，逐漸透過果皮進入果肉，在果肉細胞間隙繁殖，形成丫狀分支或者菌絲頂端加厚加粗形成蹼狀結(jié)構(gòu)，然后進入果肉細胞的過程。該結(jié)果與ZHANG 等[14]對水稻立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）入侵馬鈴薯后，在病原菌入侵植物細胞時菌絲頂端均出現(xiàn)了加厚等癥狀的觀察結(jié)果相似。

內(nèi)蒙古巴彥淖爾市光照充足、晝夜溫差大，生產(chǎn)的蘋果梨具有皮薄、肉脆、含糖量高等優(yōu)點，成為蘋果梨的主要種植產(chǎn)區(qū)[15]。雞心果因口感爽脆、甘甜深受消費者喜歡，是目前內(nèi)蒙古地區(qū)大力推廣的小蘋果品種。本研究結(jié)果顯示，蘋果梨果實對輪紋病菌極度高感，雞心果果實為輪紋病的中感品種，應加強蘋果梨和雞心果貯藏過程中輪紋病菌的檢測和防控，減少輪紋病的發(fā)生。

沈農(nóng)2號果實為輪紋病菌的高抗品種。但是在高溫、高濕環(huán)境貯藏過程中出現(xiàn)果皮開裂、果肉變綿等現(xiàn)象。本研究對輪紋病菌侵染沈農(nóng)2號的顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，輪紋病菌會在沈農(nóng)2號果皮開始出現(xiàn)開裂后在果皮表面大量繁殖，并逐漸入侵果肉細胞，造成侵染。因此，在沈農(nóng)2號貯藏過程中調(diào)節(jié)貯藏條件防治果皮開裂能有效防止該病害的發(fā)生和擴展。

本研究結(jié)果在前期研究的基礎上補充了內(nèi)蒙古地產(chǎn)蘋果和梨品種的抗輪紋病特性，豐富了我國蘋果和梨資源對輪紋病的抗性信息，為寒、旱地區(qū)果樹育種及果樹品種的推廣和管理提供了參考。