曾強(qiáng)，李輝，侯磊

西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650224

納米TiO2因具有良好的催化活性、吸附活性和抗紫外線吸收等特性，被廣泛應(yīng)用于污水處理、工業(yè)合成催化和防曬化妝品等領(lǐng)域[1]。在納米TiO2的生產(chǎn)、使用和廢棄過程中不可避免地被釋放到環(huán)境中，使其成為一種新型污染物[2-5]。納米TiO2可能會通過各種途徑進(jìn)入到水體和土壤環(huán)境中，再通過水循環(huán)進(jìn)入到植物體內(nèi)，由此引起的植物生長發(fā)育、生理生態(tài)和營養(yǎng)吸收等方面的效應(yīng)值得探索。

近年來，有不少研究報道了納米TiO2對植物的效應(yīng)，研究對象包括農(nóng)作物、草本植物、藻類及少量濕地植物，涉及對植物種子萌發(fā)、幼苗生長、植物生理特征(如細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、光合色素、抗氧化酶活性)、營養(yǎng)利用(如氮代謝、磷吸收)等多方面的影響[6-13]。其中，針對納米TiO2對植物光合作用影響的報道結(jié)果差異較大。一方面，納米TiO2顯示出了對植物光合作用的促進(jìn)效應(yīng)。如Yang等[12]發(fā)現(xiàn)，在土壤中施加2.5～40 g·kg-1納米TiO2，不僅增強(qiáng)了菠菜的光合作用，而且還提高了根的固氮能力。在對油菜的脅迫實驗中，納米TiO2未顯示出植物毒性，并促進(jìn)了油菜的光合作用，使得油菜產(chǎn)量增加[14]。另一方面，研究也報道了納米TiO2對植物光合作用的抑制效應(yīng)，例如，Ayyaraju等[15]將小球藻在濃度為0、0.1、1、5、10和20 mg·L-1的納米TiO2中暴露96 h之后，不僅光合活性受到顯著抑制，而且出現(xiàn)了細(xì)胞損傷，還進(jìn)一步影響了小球藻的基因表達(dá)。Dias等[16]將小麥幼苗于濃度為0、5、50和150 mg·L-1的納米TiO2溶液中暴露20 d，小麥的葉綠素a含量、PSⅡ的最大有效效率、凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和淀粉含量都顯著降低。縱覽當(dāng)前的研究報道，納米TiO2對于植物光合作用的促進(jìn)和抑制作用都有報道，但是針對納米TiO2影響濕地植物光合作用的研究鮮有開展，濕地植物因生境的差異可能表現(xiàn)出與其他植物不同的特征，因此這方面有待深入研究。

大薸(Pistiastratiotes)和澤瀉(Alismaplantago-aquatica)分別作為濕地植物中的浮水和挺水植物的代表，因生活型的差異，對于水體環(huán)境中人工納米顆粒濃度變化的響應(yīng)可能有區(qū)別，故選為研究對象。通過水培實驗，評估了一種金紅石型納米TiO2暴露對2種濕地植物生物量變化及光合活性影響的差異，并討論了可能的機(jī)制。該研究結(jié)果可為準(zhǔn)確評估納米TiO2的濕地植物生物效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

納米TiO2購于上海水田科技有限公司，純度>99%，為金紅石型，通過Tecnai G2 F20透射電鏡(TEM)(美國FEI公司)表征，并用Nano Measure 1.2軟件測得平均粒徑為(42.6±5) nm。

實驗使用的浮水植物大薸和挺水植物澤瀉購于昆明泛亞花卉基地，挑選長勢相近的植物進(jìn)行實驗，植物培養(yǎng)為水培方式，培養(yǎng)液為0.5倍濃度的Hoagland溶液，其中，大量元素濃度為：2.5 mmol·L-1Ca(NO3)2，1.0 mmol·L-1KH2PO4，2.5 mmol·L-1KNO3，1.0 mmol·L-1MgSO4和0.5 mmol·L-1NaCl；微量元素濃度為：23.1 μmol·L-1B，4.6 μmol·L-1Mn，0.38 μmol·L-1Zn，0.16 μmol·L-1Cu，0.052 μmol·L-1Mo和8.95 μmol·L-1Fe (EDTA-Fe)[17]，所有化學(xué)試劑均為分析純，購于廣東光華科技有限公司。在可控溫控濕的溫室大棚中預(yù)培養(yǎng)7 d備用。

1.2 實驗方法

在營養(yǎng)液中加入納米TiO2粉末，使用JY99-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎儀(中國寧波新芝生物科技有限公司)超聲30 min，制成懸浮液?；谖墨I(xiàn)報道的納米TiO2產(chǎn)生植物效應(yīng)的濃度范圍(0.01～1 000 mg·L-1)[8-9,18]，選擇納米TiO2中間濃度進(jìn)行水培實驗。營養(yǎng)液中納米TiO2的濃度(以TiO2的質(zhì)量濃度計)分別設(shè)置為10、30和250 mg·L-1，同時設(shè)置空白實驗組(0 mg·L-1)，每個濃度設(shè)置5個平行(5棵植物)。將制備好的納米TiO2懸浮液裝于聚乙烯塑料桶中，每個桶放置一棵植物，大薸浮于水面，澤瀉用海綿固定，標(biāo)記液面位置，同時用黑色卡紙對根部進(jìn)行遮光處理。脅迫實驗期間，每天補充去離子水至刻度線，并攪拌懸浮液。暴露實驗開始前需要測定每棵植物的生物量，整個實驗過程均在溫室大棚中進(jìn)行。

1.3 光合參數(shù)測定

2017年9月，使用Li-6400光合儀(美國LI-COR公司)進(jìn)行光合參數(shù)的測定，在納米TiO2暴露的第14天，選擇天氣晴朗的早上9:00—11:00測定，使用紅藍(lán)光源葉室并設(shè)定光強(qiáng)為1 000 μmol·m-2·s-1。測定指標(biāo)包括凈光合速率(Pn，μmol·m-2·s-1)、氣孔導(dǎo)度(Gs，mmol·m-2·s-1)、胞間CO2濃度(ci，μmol·mol-1)、蒸騰速率(Tr，mmol·m-2·s-1)和ci/ca(ca為空氣中CO2濃度，μmol·mol-1)，并計算氣孔限制值(Ls=1-ci/ca)。

1.4 植物生物量及Ti濃度測定

光合參數(shù)測定完成后，將植物收割，根部用去離子水清洗3遍后擦干。測定每棵植物的生物量，用處理前后植物生物量差值除以處理前該植物的生物量計算得到每個濃度處理組的相對生物量變化率。將大薸按照根、葉和芽，澤瀉按照根、莖和葉的方式進(jìn)行分割，記錄每部分的重量，于105 ℃殺青30 min，然后在60 ℃烘干，研磨后備用。分別稱取0.15 g和0.30 g研磨后的大薸和澤瀉植物樣品，采用H2SO4-H2O2方法消煮[19]，并用710型ICP-OES儀器(美國Agilent公司)測定消煮液中Ti元素濃度(mg·L-1)，并折算為鮮植物組織中的Ti濃度(mg·kg-1)。分別運用公式(1)和(2)計算大薸和澤瀉對Ti元素的生物富集系數(shù)(bioaccumulation factors, BAFs)和轉(zhuǎn)移系數(shù)(transportation factors, TFs)。

BAFs=植物體中Ti元素質(zhì)量(mg)/營養(yǎng)液中Ti元素質(zhì)量(mg)

(1)

TFs=植物地上部分Ti元素質(zhì)量(mg)/植物根中Ti元素質(zhì)量(mg)

(2)

其中，大薸和澤瀉的植物地上部位Ti元素質(zhì)量分別為葉和芽、莖和葉中Ti元素的質(zhì)量和。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用分析軟件SPSS 22.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性差異檢驗，統(tǒng)計量顯著性水平為P<0.05認(rèn)為差異顯著。利用SigmaPlot 10.0和Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 納米TiO2暴露對大薸和澤瀉生物量的影響

納米TiO2暴露濃度對大薸和澤瀉相對生物量變化率的影響如圖1所示。由圖1可知，大薸和澤瀉的相對生物量變化率隨納米TiO2濃度的增加總體呈現(xiàn)上升趨勢，與對照組相比，納米TiO2暴露后，大薸相對生物量變化率增加了5.08%～17.58%，而澤瀉增加了2.41%～8.15%，并在250 mg·L-1處理組分別檢測到大薸和澤瀉相對生物量變化率的最大值64.97%(P<0.05)和18.18%(P<0.05)，分別是對照組變化率的1.37倍和1.81倍。從對照組來看，大薸相對生物量變化率是澤瀉的4.72倍，納米TiO2暴露后，2種植物相對生物量變化率的倍數(shù)關(guān)系無顯著變化。

圖1 不同濃度納米TiO2對大薸和澤瀉相對生物量變化率的影響注：不同字母表示與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 1 Effect of different concentrations of TiO2 nanoparticle on the biomass change rate of Pistia stratiotes and Alisma plantago-aquaticaNote: Different letters indicate that there are significant differences (P<0.05), compared with the control.

2.2 Ti在大薸和澤瀉不同部位的分布

Ti元素在植物不同部位的分布隨納米TiO2暴露濃度的變化規(guī)律如圖2所示。由圖2可知，Ti元素在大薸和澤瀉各個部位中的濃度隨著納米TiO2濃度的上升而上升，與對照組相比，均顯著增加(P<0.05)，并在最高濃度250 mg·L-1處理組達(dá)到最大值，Ti元素在2種植物根中的濃度均最高。2種植物相比，大薸各部位的Ti濃度均隨TiO2濃度的升高而升高，澤瀉僅有根表現(xiàn)出以上規(guī)律。經(jīng)過納米TiO2暴露后，大薸的根和葉中Ti元素濃度均高于澤瀉的，其中，根中Ti元素濃度是澤瀉根中Ti濃度的4.20倍～4.95倍。此外，2種植物的對照組中，各個部位均檢測到了Ti元素，其中，澤瀉根和葉中濃度分別是大薸的3.57倍和7.77倍。

不同濃度納米TiO2暴露條件下，2種植物對Ti元素的生物富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)變化規(guī)律如表1所示。由表1可知，同一處理濃度，澤瀉表現(xiàn)出比大薸更高的生物富集系數(shù)，且隨著納米TiO2濃度的增加，2種植物對Ti元素的生物富集系數(shù)均減小。此外，2種植物對Ti元素的轉(zhuǎn)移系數(shù)也表現(xiàn)出不同規(guī)律，低濃度條件下(10 mg·L-1)，澤瀉的轉(zhuǎn)移系數(shù)大于大薸，但納米TiO2濃度升高后，大薸的轉(zhuǎn)移系數(shù)無顯著變化(P>0.05)，而澤瀉的轉(zhuǎn)移系數(shù)明顯下降(P<0.05)。

表1 大薸和澤瀉對Ti的生物富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)隨納米TiO2暴露濃度的變化Table 1 Changes of bioaccumulation factors and transportation factors of Ti element for Pistia stratiotes and Alisma plantago-aquatica in different exposure concentrations of TiO2 nanoparticles

圖2 Ti在大薸和澤瀉各部位的濃度分布注：不同字母表示與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Distribution of Ti concentration in each part of Pistia stratiotes and Alisma plantago-aquaticaNote: Different letters indicate that there are significant differences (P<0.05), compared with the control.

2.3 納米TiO2暴露對大薸和澤瀉的光合參數(shù)的影響

納米TiO2暴露對2種植物光合參數(shù)的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著納米TiO2暴露濃度的上升，與對照組相比，2種植物的凈光合速率均表現(xiàn)出低濃度抑制、高濃度促進(jìn)的規(guī)律，但變化趨勢不顯著(P>0.05)。與凈光合速率相關(guān)的其他指標(biāo)，2種植物呈現(xiàn)出類似的變化規(guī)律，隨著納米TiO2濃度升高，氣孔導(dǎo)度與凈光合速率呈現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，胞間CO2濃度下降，蒸騰速率增大，除蒸騰速率外，其余指標(biāo)的變化均不顯著(P>0.05)。對比2種植物的各項參數(shù)發(fā)現(xiàn)，挺水植物澤瀉的凈光合速率更大，是大薸的1.58倍～2.04倍，對應(yīng)的胞間CO2濃度更低，氣孔導(dǎo)度更大，此外，澤瀉的蒸騰速率是大薸的582.14倍～932.65倍。同時，隨著納米TiO2濃度的升高，大薸的氣孔限制值顯著增加(P<0.05)，而澤瀉的無顯著變化(P>0.05)。

圖3 納米TiO2濃度對大薸和澤瀉的光合參數(shù)的影響注：Pn、Gs、ci、Tr和Ls分別表示凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率和氣孔限制值；不同字母表示與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 3 Effects of TiO2 nanoparticle concentrations on the photosynthetic parameters of Pistia stratiotes and Alisma plantago-aquaticaNote: Pn, Gs, ci, Tr and Ls represent net photosynthetic rate, stomatal conductance, intercellular carbon dioxide concentration, transpiration rate and limiting value of stomata, respectively; different letters indicate that there are significant differences (P<0.05), compared with the control.

3 討論(Discussion)

為了進(jìn)一步討論植物各個部位中Ti元素濃度、相對生物量變化率及光合各參數(shù)間的關(guān)系，深入分析納米TiO2暴露對2種植物光合特征影響差異的原因，繪制了各參數(shù)間的相關(guān)系數(shù)熱圖(圖4)。由圖4可以觀察到2類關(guān)系，即植物中Ti元素濃度與相對生物量變化率及光合參數(shù)之間的關(guān)系。第一，2種植物各個部位中Ti元素濃度與相對生物量變化率呈正相關(guān)關(guān)系，大薸的相關(guān)系數(shù)高于澤瀉，且大薸芽中Ti元素濃度越高，相對生物量變化率越大。第二，Ti元素濃度與Pn和Tr正相關(guān)，與ci負(fù)相關(guān)。與Pn的相關(guān)系數(shù)，大薸大于澤瀉，與Tr的相關(guān)系數(shù)大薸小于澤瀉，而與ci的相關(guān)系數(shù)，2種植物無明顯差異。Ti元素濃度與Gs和Ls的相關(guān)關(guān)系2種植物相反，對于大薸，Ti元素濃度與Gs負(fù)相關(guān)，而與Ls正相關(guān)。由此可見，納米TiO2暴露對2種類型濕地植物的影響差異較為明顯，可能與2種植物生活型的差異有關(guān)。

圖4 大薸和澤瀉各部位Ti濃度與光合參數(shù)間相關(guān)系數(shù)熱圖注：Δm 表示相對生物量變化率。Fig. 4 Heat map of correlation coefficients between Ti concentrations and photosynthetic parameters of Pistia stratiotes and Alisma plantago-aquaticaNote: Δm represent biomass change rate.

本研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2暴露能夠促進(jìn)大薸和澤瀉的生長，同時隨著暴露濃度的升高，植物各部位中Ti元素濃度也增加，根尤其明顯。目前針對植物吸收納米TiO2的研究開展較多，對象包括農(nóng)作物、草本植物、藻類及少量濕地植物，發(fā)現(xiàn)納米TiO2可被小麥、玉米、擬南芥和青萍等植物體吸收[7-11]，在根部濃度較高[20]，納米TiO2同時也能被吸收進(jìn)入植物的莖、葉等營養(yǎng)器官，甚至在果實中也可檢測到[6,21]。本研究的發(fā)現(xiàn)與這些研究結(jié)果相一致。本研究還觀察到植物生活型差異導(dǎo)致了吸收納米TiO2能力的差異，我們發(fā)現(xiàn)澤瀉對Ti的生物富集系數(shù)更大，而大薸對Ti的轉(zhuǎn)移系數(shù)更穩(wěn)定。此外，本研究沒有設(shè)置含Ti溶液暴露組，因此不能區(qū)分納米TiO2暴露和Ti溶液暴露的差異，在今后的研究中需要考慮。

納米TiO2暴露對2種植物的Pn均表現(xiàn)出低濃度抑制、高濃度促進(jìn)的規(guī)律，但變化趨勢不顯著(P>0.05)，但是從ci和Ls的變化規(guī)律可以發(fā)現(xiàn)，納米TiO2暴露影響2種植物光合作用的機(jī)制不同。許大全[22]指出，可以通過ci和Ls的變化方向來判斷氣孔是否為光合速率下降的限制因素，如ci下降，Ls上升，那么氣孔導(dǎo)度變化是主因，而ci上升，Ls下降，則光合速率下降為非氣孔因素導(dǎo)致。在本研究中，隨著納米TiO2暴露濃度的升高，大薸的ci下降，Ls上升，氣孔限制是其光合速率變化的主因，而澤瀉的ci和Ls沒有明顯變化趨勢，氣孔限制不是其光合速率變化的主因。

納米TiO2暴露能促進(jìn)部分植物的光合作用和生長發(fā)育，其可能的原因正如Carvajal和Alcaraz[23]在研究中提出的，Ti元素非植物必需元素，但對植物有益，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)Ti元素能夠促進(jìn)植物的生長，90%的關(guān)于農(nóng)作物的研究顯示，Ti元素能夠提高作物產(chǎn)量；(2)提高植物細(xì)胞中酶的活性，促進(jìn)相關(guān)的代謝過程，如促進(jìn)植物葉片光能的吸收分配、光電轉(zhuǎn)換和光合放氧等過程，提高光合作用效率等[24-25]；(3)降低其他元素的毒性效果[23]；(4)增加植物對必需元素的吸收和利用，如Ti可攜帶離子促進(jìn)植物對營養(yǎng)元素Fe、N的吸收；植物缺Fe時，適當(dāng)濃度的Ti元素可刺激植物提高Fe轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而提高Fe的吸收[26]。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)的Ti元素在大薸中濃度更高，對其生長和光合影響更為顯著的結(jié)果可以推測，浮水植物沒有莖組織，Ti元素能夠更快地進(jìn)入到葉片中，發(fā)揮積極作用，而在挺水植物中，Ti元素可能滯留在莖組織中，進(jìn)而降低其對葉片光合作用的影響。基于Carvajal和Alcaraz[23]的研究結(jié)果，還可以推測，本研究中觀察到TiO2加入后，2種植物凈光合速率增加不顯著的現(xiàn)象(P>0.05)，可能是Ti元素同時提高了植物的光合和呼吸作用，進(jìn)而導(dǎo)致凈光合速率變化不明顯。Yang等[12]關(guān)于納米TiO2提高菠菜對氮元素代謝的報道，可能從側(cè)面支撐了本研究的推測。

研究也報道了納米TiO2暴露對植物生長的抑制作用乃至毒性效性，當(dāng)納米TiO2暴露濃度超過一定限度時，可附著在植物根表降低根部導(dǎo)水率，縮小細(xì)胞壁孔徑，影響葉片的蒸騰作用及生長[17,27-28]；也有可能產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，造成細(xì)胞氧化損傷，從而抑制植物的生長[29-31]；也可與營養(yǎng)元素競爭配體或轉(zhuǎn)運蛋白，導(dǎo)致植物缺營養(yǎng)而對植物產(chǎn)生毒性[32-33]。本研究中添加的納米TiO2未對大薸和澤瀉表現(xiàn)出毒性效應(yīng)，可能是該粒徑的納米TiO2未對植物細(xì)胞產(chǎn)生損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：

(1)納米TiO2暴露促進(jìn)了大薸和澤瀉的生物量增長，雖大薸生長更快，但納米TiO2暴露對2種植物生物量增加的促進(jìn)作用沒有顯著差異(P>0.05)。

(2)納米TiO2暴露后主要富集在2種植物的根部，富集量隨暴露濃度的升高而增加，納米TiO2也能進(jìn)入植物體內(nèi)，大薸植物內(nèi)Ti元素濃度明顯高于澤瀉。

(3)較高濃度納米TiO2暴露(250 mg·L-1)能夠顯著改變2種植物的葉孔開放程度、CO2消耗狀況及蒸騰速率，但對凈光合速率的影響不顯著(P>0.05)。通過相關(guān)性和氣孔限制分析發(fā)現(xiàn)，植物的生活型可能決定納米TiO2暴露影響大薸和澤瀉光合作用的機(jī)制。