李俊杰，李玲，黃沛玲

華僑大學(xué)化工學(xué)院，廈門 361021

乙草胺(ACT)是一種氯乙酰胺除草劑，能夠在雜草出苗前或出苗后施用，能被根和葉子吸收，可抑制光合作用的電子傳遞，是我國最廣泛使用的除草劑之一[1]。ACT施用后會(huì)通過灌溉侵蝕或雨水和地表徑流沖刷進(jìn)入水生環(huán)境中造成污染。在中國廣西的甘蔗種植區(qū)，ACT在33.3%的測試水樣中檢出。ACT在中國東北地區(qū)的水產(chǎn)品中也有檢出[2]。在美國，春秋季的地表水和飲用水中均能檢出ACT，它是美國的中西部流域潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的主要貢獻(xiàn)者之一[3]。

當(dāng)ACT進(jìn)入到環(huán)境中時(shí)，會(huì)對非靶標(biāo)生物產(chǎn)生一定的毒性效應(yīng)。Xie等[4]的研究表明，ACT容易積聚在銅綠微囊藻中，會(huì)對藻類造成氧化損傷并且導(dǎo)致其釋放藻毒素。李薪芳等[5]的研究表明，高濃度的ACT會(huì)對銅綠微囊藻造成氧化損傷并抑制其生長。吳曉霞等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ACT對大型水生植物(浮萍和金魚藻)的生長發(fā)育和生理生化指標(biāo)具有顯著影響。王秀紅等[7]的研究表明，ACT高濃度時(shí)會(huì)抑制藻類蛋白質(zhì)的合成和α-淀粉酶的活性從而導(dǎo)致其死亡。此外，接觸ACT也可以致魚類中甲狀腺激素相關(guān)基因的組織特異性替代表達(dá)，導(dǎo)致基因變異[8]。Xu等[9]的研究表明，ACT會(huì)影響斑馬魚胚胎發(fā)育且破壞甲狀腺功能。有研究表明，長期接觸ACT會(huì)誘發(fā)大鼠肝臟和腎臟損害，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)功能障礙，并影響脂肪酸的合成[10]。美國環(huán)境保護(hù)局將ACT列為B-2致癌物[11]；ACT的廣泛存在已經(jīng)對生態(tài)環(huán)境造成了巨大威脅。本文研究了在不同濃度ACT的脅迫下，水華微囊藻在染毒期間，葉綠素?zé)晒鈪?shù)、藻蛋白、藻膽蛋白和藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到的影響，綜合評價(jià)ACT對浮游植物光合作用的潛在影響。此結(jié)果可為ACT環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估及農(nóng)藥的合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和儀器

供試藥劑：乙草胺(2-乙基-6甲基-N-乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺)原藥由浙江大有化工有限公司提供，純度>90%。

儀器：浮游植物分類熒光儀(Phyto-PAM，Walz公司，德國)，透射電子顯微鏡(H-7650，日立公司，日本)，切片機(jī)(UC7，Leica公司，奧地利)，酶標(biāo)儀(SP-Max 2300A，上海閃譜生物科技有限公司，中國)，人工氣候箱(PYX-250Q-B，韶關(guān)科力儀器有限公司，中國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)藻水華微囊藻(Microcystisflos-aquae)(FACHB-1028)由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供。水華微囊藻采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于人工氣候箱中，培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，濕度60%，光暗比12 h∶12 h，光強(qiáng)為3 700 lx左右，靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)人工搖動(dòng)3次。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葉綠素相關(guān)熒光的測定

在水華微囊藻進(jìn)入生長對數(shù)期(1×106～3×106cell·mL-1)后進(jìn)行染毒，置于250 mL三角錐形瓶中培養(yǎng)。設(shè)置乙草胺對水華微囊藻藻液的染毒濃度分別為0、0.01、0.1、1、10和50 mg·L-1。每組濃度設(shè)置3個(gè)平行，染毒9 d。

試驗(yàn)使用浮游植物分類熒光儀(Phyto-PAM，Walz公司，德國)測定水華微囊藻藻細(xì)胞的葉綠素a含量(Chla)、光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光合效率(Fv/Fm)、PSⅡ的實(shí)際光合效率(Y(Ⅱ))、快速光響應(yīng)曲線(電子傳遞速率(rETR)、光合有效輻射(PAR))、光能利用率(α)、最大潛在相對電子傳遞速率(ETRmax)、半飽和光強(qiáng)(Ik)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。Chla每天測一次，其余參數(shù)隔天測一次。計(jì)算公式如下：

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

(1)

Y(Ⅱ)=(Fm’-F)/Fm’

(2)

rETR=PAR×Y(Ⅱ)×0.84×0.5

(3)

Ik=ETRmax/α

(4)

式中：F0表示初始熒光，F(xiàn)v表示可變熒光，F(xiàn)m表示最大熒光，F(xiàn)m’表示光適應(yīng)最大熒光，F(xiàn)表示實(shí)際熒光產(chǎn)量。

1.3.2 藻蛋白和藻膽蛋白的測定

蛋白的提?。涸O(shè)置乙草胺染毒濃度為0、1、10和50 mg·L-1，在染毒3、6和9 d時(shí)，取一定量的藻液在4 ℃條件下冷凍離心10 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r·min-1，去除上清液，藻細(xì)胞重懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.05 mol·L-1，pH 7.8)中，冰浴破碎后，再在4 ℃條件下冷凍離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1，取上清液用PBS定容，-80 ℃低溫保存。

藻蛋白的測定：采用Bradford法[12]。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和蛋白提取液加入考馬斯亮藍(lán)(G250)溶液，在595 nm處測定吸光度。

藻膽蛋白的測定：在620 nm(A620)、650 nm(A650)和565 nm(A565)處測定吸光度，計(jì)算公式如下[13]：

藻藍(lán)蛋白(PC)=(A620-0.7A650)/7.38

(5)

別藻藍(lán)蛋白(APC)=(A650-0.19A620)/5.65

(6)

藻紅蛋白(PE)=(A565-2.8PC-1.34APC)/12.7

(7)

1.3.3 藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

設(shè)置乙草胺染毒濃度為0 mg·L-1和10 mg·L-1，在染毒4 d時(shí)，取一定量的藻液離心，去上清，藻細(xì)胞加入2.5%的戊二醛，在4 ℃下固定4 h，用PBS洗3次，每次15 min。再加入1%四氧化鋨固定1 h，用乙醇的水溶液按30%、50%和70%的濃度梯度對樣品進(jìn)行脫水，每次15 min，之后在90%乙醇、90%乙醇∶丙酮(V∶V=1∶1)和90%丙酮中脫水各15 min，100%丙酮脫水2次，每次15 min。使用丙酮、Spurr樹脂包埋劑浸透與包埋，70 ℃加溫聚合24 h。用Leica UC7超薄切片機(jī)切成厚度100 nm的切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，超純水漂洗。最后在透射電子顯微鏡(TEM)中觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件的單因素分析及Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05表示有顯著性差異。所得數(shù)據(jù)利用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Chl a含量的變化

由圖1可知，隨著染毒時(shí)間的增加，同一濃度組的Chla含量呈現(xiàn)上升趨勢，但都低于對照組；在前6天，各濃度組與對照組均無顯著性差異(P>0.05)，從第7天起，除了0.01 mg·L-1濃度組以外，其余濃度組均顯著低于對照組(P<0.05)；到第9天時(shí)，0.1、1、10和50 mg·L-1濃度組中水華微囊藻Chla含量分別為對照組的91%、88%、86%和78%。

圖1 不同濃度乙草胺(ACT)對水華微囊藻葉綠素a(Chl a)含量的影響注：*代表與對照組比較具有顯著性差異，P<0.05；下同。Fig. 1 Effects of different concentrations of acetochlor (ACT) on chlorophyll a (Chl a) content of Microcystis flos-aquaeNote: *represents significant difference compared with the control group, P<0.05; the same below.

2.2 Fv/Fm的變化

如圖2所示，在前3天，各濃度組Fv/Fm都呈現(xiàn)增大的趨勢，但是50 mg·L-1濃度組的Fv/Fm低于對照組；從第3天起，50 mg·L-1濃度組的Fv/Fm呈現(xiàn)下降趨勢，時(shí)間越長，F(xiàn)v/Fm越小，顯著低于對照組(P<0.05)；而10 mg·L-1濃度組從第5天起也開始顯著低于對照組(P<0.05)。第9天，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的Fv/Fm值分別為對照組的82%和27%。而其余濃度組在染毒期間與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 不同濃度ACT對水華微囊藻最大光合效率(Fv/Fm)的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of ACT on the maximum photosynthetic efficiency (Fv/Fm) of Microcystis flos-aquae

2.3 Y(Ⅱ)值的變化

如圖3所示，在前3天，所有濃度組Y(Ⅱ)值均呈現(xiàn)上升趨勢，但是50 mg·L-1濃度組的Y(Ⅱ)值增長速率低于對照組，從第3天起，50 mg·L-1濃度組的Y(Ⅱ)值呈現(xiàn)下降趨勢，時(shí)間越長，Y(Ⅱ)值越小，顯著低于對照組(P<0.05)；而10 mg·L-1濃度組從第5天起也開始顯著低于對照組(P<0.05)。第9天，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的Y(Ⅱ)值分別為對照組的82%和25%。而0.01、0.1和1 mg·L-1濃度組在染毒期間與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 不同濃度ACT對水華微囊藻PSⅡ的實(shí)際光合效率(Y(Ⅱ))的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of ACT on the actual photosynthetic efficiency of PSⅡ(Y(Ⅱ)) of Microcystis flos-aquae

2.4 快速光響應(yīng)曲線的變化

如圖4所示，在第1天時(shí)，各濃度組的快速光響應(yīng)曲線與對照組并無顯著性差異(P>0.05)；在第3天時(shí)，隨著PAR的增大，50 mg·L-1濃度組的rETR開始顯著低于對照組(P<0.05)；在第5天時(shí)，隨著PAR的增大，10 mg·L-1濃度組的rETR也開始低于對照組；從第7天起，隨著PAR的增大，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組rETR均顯著低于對照組(P<0.05)，而其余濃度組的rETR均與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 不同濃度ACT對水華微囊藻快速光響應(yīng)曲線的影響注：PAR表示光合有效輻射，rETR表示電子傳遞速率。Fig. 4 Effects of different concentrations of ACT on rapid light curves of Microcystis flos-aquaeNote: PAR is photosynthetically active radiation and rETR is electron transport rate.

2.5 α值、ETRmax值和Ik值的變化

ACT對水華微囊藻α值的影響如圖5所示，隨著染毒時(shí)間的增加，0.01、0.1和1 mg·L-1濃度組的α值與對照組的變化趨勢一致，呈先上升后趨于相對平穩(wěn)；而10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組則呈先上升后降低，且從第5天起，α值顯著低于對照組(P<0.05)。到第9天時(shí)，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的α值分別為對照組的85%和25%。

圖5 不同濃度ACT對水華微囊藻光響應(yīng)曲線的初始斜率(α)值的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of ACT on the initial slope of rapid light curve (α) value of Microcystis flos-aquae

ACT對水華微囊藻ETRmax值的影響如圖6所示，隨著染毒時(shí)間的增加，0.01、0.1和1 mg·L-1濃度組的ETRmax值保持相對穩(wěn)定的上升趨勢；而10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組則隨著染毒時(shí)間的增加，呈先增后減的趨勢，從第7天起顯著低于對照組(P<0.05)。到第9天時(shí)，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的ETRmax值分別為對照組的78%和22%。

圖6 不同濃度ACT對水華微囊藻最大潛在相對電子傳遞速率(ETRmax)值的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of ACT on maximum potential relative electron transfer rate (ETRmax) value of Microcystis flos-aquae

ACT對水華微囊藻Ik值的影響如圖7所示，所有濃度組的Ik值隨著染毒時(shí)間的增加而增大。從第7天起，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組顯著低于對照組(P<0.05)。到第9天時(shí)，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的Ik值分別為對照組的108%和120%。

圖7 不同濃度ACT對水華微囊藻半飽和光強(qiáng)(Ik)值的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of ACT on the semi-saturated light intensity (Ik) value of Microcystis flos-aquae

2.6 藻蛋白和藻膽蛋白的變化

ACT對水華微囊藻藻蛋白的影響如圖8(a)所示，藻蛋白相對含量隨著ACT濃度的增加呈下降的趨勢，從染毒第6天起，50 mg·L-1濃度組的藻蛋白相對含量開始顯著低于對照組(P<0.05)；在第9天，50 mg·L-1濃度組的藻蛋白相對含量為59.29%±6.54%，且顯著低于第3天和第6天時(shí)該濃度組的藻蛋白相對含量(P<0.05)；而其余濃度組與對照組之間未見顯著性差異(P>0.05)。

ACT對水華微囊藻藻藍(lán)蛋白的影響如圖8(b)所示，藻藍(lán)蛋白相對含量隨著ACT濃度的增加呈下降的趨勢，在染毒第9天，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的藻藍(lán)蛋白相對含量顯著低于對照組(P<0.05)，相對含量分別為82.24%±11.06%和64.61%±2.61%，且50 mg·L-1濃度組的藻藍(lán)蛋白相對含量與其余濃度組存在顯著性差異(P<0.05)。

ACT對水華微囊藻別藻藍(lán)蛋白的影響如圖8(c)所示，別藻藍(lán)蛋白相對含量隨著ACT濃度的增加呈下降的趨勢。其中，1、10和50 mg·L-1濃度組的別藻藍(lán)蛋白相對含量從第3天起就顯著低于對照組(P<0.05)；且隨著染毒時(shí)間的增加，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的別藻藍(lán)蛋白相對含量在第9天時(shí)顯著低于第3天和第6天(P<0.05)，其相對含量分別為77.48%±2.23%和57.61%±3.30%。

圖8 不同濃度ACT對水華微囊藻藻蛋白和藻膽蛋白的影響注：不同小寫字母(a、b和c)表示相同暴露時(shí)間的不同濃度組之間存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母(A和B)表示相同濃度組不同暴露時(shí)間之間存在顯著差異(P<0.05)；大寫字母的下標(biāo)1、2和3分別表示1 mg·L-1、10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組。Fig. 8 Effects of different concentrations of ACT on protein and phycobiliprotein of Microcystis flos-aquaeNote: Different lowercase letters (a, b and c) indicate significant differences (P<0.05) between different concentrations at the same exposure time; different capital letters (A and B) indicate significant differences (P<0.05) between different exposure time groups with the same concentration; the subscripts 1, 2 and 3 of capital letters respectively represent concentration groups of 1 mg·L-1, 10 mg·L-1 and 50 mg·L-1.

ACT對水華微囊藻藻紅蛋白的影響如圖8(d)所示，藻紅蛋白相對含量隨著ACT濃度的增加呈下降的趨勢，從第3天起，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的藻紅蛋白相對含量均顯著低于對照組(P<0.05)；在第9天時(shí)，10 mg·L-1和50 mg·L-1濃度組的藻紅蛋白相對含量分別為85.18%±7.59%和76.51%±7.35%。

2.7 超微結(jié)構(gòu)觀察

通過透射電子顯微鏡觀察到ACT染毒前后水華微囊藻細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，如圖9所示。圖9Ⅰ為對照組經(jīng)過96 h后的水華微囊藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞周圍有一層黏液，核區(qū)、類囊體、藻青素小粒和氣泡清晰可見(圖9Ⅰ(a))，類囊體之間存在少量糖原(圖9Ⅰ(b))；圖9Ⅰ(c)和圖9Ⅰ(d)中展示的是處于細(xì)胞分裂的細(xì)胞，箭頭指示的細(xì)胞壁層含有脂質(zhì)顆粒，多β羥基丁酸和多面體也清晰可見。圖9Ⅱ?yàn)樗A微囊藻暴露在10 mg·L-1ACT 96 h后的藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞整體變形，質(zhì)壁分離明顯(圖9Ⅱ(a))，細(xì)胞壁被破壞，細(xì)胞質(zhì)紊亂，類囊體數(shù)量減少，且大多與細(xì)胞壁垂直(圖9Ⅱ(b))，細(xì)胞分裂不對稱，氣泡、藻青素小粒數(shù)量減少，多β羥基丁酸和脂質(zhì)顆粒增多(圖9Ⅱ(c)和Ⅱ(d))。

圖9 接種96 h后水華微囊藻超微結(jié)構(gòu)的變化注：Ⅰ 對照組，Ⅱ 10 mg·L-1 ACT組；超微結(jié)構(gòu)包含類囊體(T)、黏液(M)、核區(qū)(N)、藻青素小粒(CG)、多面體(PB)、多β羥基丁酸(PBH)、脂質(zhì)顆粒(L)、糖原(G)、氣泡(GV)、細(xì)胞壁(CW)和細(xì)胞膜(CM)。Fig. 9 Ultrastructure of Microcystis flos-aquae cell in sample (96 h after inoculation)Note: Ⅰ control, Ⅱ 10 mg·L-1 ACT group; ultrastructure includes thylakoids (T), mucilage (M), nucleoplasmic area (N), cyanophycin granules (CG), polyhedral body (PB), hydroxybutyrate (PBH), lipid (L), glycogens (G), gas vesicle (GV), cell wall (CW) and cell membrane (CM).

3 討論(Discussion)

Chla是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量反映光合作用的狀況，也是衡量植物生長狀況的重要指標(biāo)之一[14]。本研究中，隨著ACT濃度的增加，水華微囊藻的Chla含量逐漸降低，這可能是因?yàn)锳CT對水華微囊藻光合色素的合成有抑制作用，從而導(dǎo)致Chla含量的下降。以上結(jié)果與很多已有研究結(jié)果相似，例如，Wang等[15]的研究表明，三角褐指藻的Chla含量會(huì)隨著對氯苯胺濃度的增加而減少，因?yàn)閷β缺桨方档土巳呛种冈骞夂蜕睾铣擅傅幕钚?，?dǎo)致光和色素合成受到抑制；Smythers等[16]的研究表明，除草劑拿捕凈暴露會(huì)導(dǎo)致小球藻的Chla含量降低。

Fv/Fm是表征PSⅡ中藻類細(xì)胞損傷的快速指標(biāo)，當(dāng)藻類遭受非生物脅迫時(shí)，就會(huì)顯著降低[17-18]。本研究中，水華微囊藻的Fv/Fm隨著ACT濃度的增加而減少，表明最大量子產(chǎn)量減少，最大光能轉(zhuǎn)化效率受到抑制，這可能是因?yàn)樵诟邼舛華CT的脅迫下，水華微囊藻的光合作用過程受到破壞，光合電子傳遞過程中斷，藻體利用光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的能力降低[19]。élise等[20]的研究也表明，草甘膦會(huì)造成藍(lán)藻和綠藻的Fv/Fm降低。Khanama等[21]的研究表明，高濃度敵草隆會(huì)造成藻類光合性能降低。劉偉杰等[22]的研究表明，羊角月牙藻的Fv/Fm隨著壬基酚的濃度增加而下降，這證明壬基酚能降低羊角月牙藻的光合性能且抑制羊角月牙藻的生長。PSⅡ的Y(Ⅱ)反映了PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率和實(shí)際量子產(chǎn)量[23]。水華微囊藻Y(Ⅱ)隨著ACT濃度的增加而減少，這表明，ACT暴露會(huì)導(dǎo)致水華微囊藻PSⅡ的實(shí)際量子產(chǎn)量減少，實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率降低，從而影響光合作用。Zhao等[24]的研究報(bào)道了4種除草劑(莠去津、敵草隆、敵稗和滅草松)導(dǎo)致3種藻(小球藻、銅綠微囊藻和斜生柵藻)光合作用的最大光合效率和實(shí)際光合效率降低。王壽兵等[25]的研究表明，高濃度Cu2+暴露會(huì)導(dǎo)致銅綠微囊藻PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率下降，說明銅綠微囊藻的光化學(xué)性能受到抑制。

快速光響應(yīng)曲線可以反映不同試驗(yàn)條件下浮游生物光合活性的相對變化[26]。rETR反映了相對電子傳遞速率，PAR為有效光輻射強(qiáng)度。在10 mg·L-1和50 mg·L-1ACT濃度組中，隨著PAR的增加，rETR增加速率低于對照組，表明藻類的光合作用受到抑制，可能是因?yàn)楦邼舛鹊腁CT破壞了光合作用的電子傳遞過程，使得光合作用受阻，凈光合作用能力降低，從而影響藻類生長。Wu等[27]的研究表明，高濃度微塑料會(huì)阻礙藻類光合作用中的電子傳遞，導(dǎo)致光響應(yīng)曲線的變化。王俊英[28]用水胺硫磷(ICP)對水華微囊藻進(jìn)行對映體選擇性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)(+)-ICP降低了藻類的光合活性，原因是(+)-ICP阻礙了PSⅡ中電子的傳遞。Sandra等[29]的研究表明，當(dāng)藻類受到脅迫時(shí)，光響應(yīng)曲線會(huì)顯著降低，光合作用受到抑制。

α值反映了藻細(xì)胞對光能的利用效率，能直觀反映藻類捕光色素對光能的吸收能力[30]。ETRmax值可反映一定光強(qiáng)下單位藻細(xì)胞內(nèi)光合作用速率的快慢[31]。Ik表示浮游植物保持捕獲光能和處理光能的最佳平衡點(diǎn)[32]，是浮游植物光適應(yīng)能力的指標(biāo)，能反映對強(qiáng)光耐性的大小。本研究結(jié)果表明，0.01、0.1和1 mg·L-1ACT濃度組中，水華微囊藻的α值和ETRmax值呈上升趨勢，其中，部分α值和ETRmax值與空白組呈現(xiàn)顯著性差異?？赡苁且?yàn)樵诘蜐舛鹊腁CT脅迫下，水華微囊藻通過增強(qiáng)捕光能力和電子傳遞能力來維持光合能力，從而避免機(jī)體受損；而在10 mg·L-1和50 mg·L-1ACT濃度組中，α值和ETRmax值的顯著降低可能是因?yàn)樗A微囊藻在高濃度ACT脅迫下，捕光能力和電子傳遞能力減弱，導(dǎo)致藻類機(jī)體受到損傷。所有ACT濃度組中，水華微囊藻的Ik值呈上升趨勢且與對照組有顯著性差異，可能是因?yàn)楫?dāng)ACT濃度增大時(shí)，水華微囊藻的生長受到脅迫，而耐受能力增強(qiáng)。已有研究表明，在除草劑的作用下，藻類的光合作用能力下降。例如，異丙隆會(huì)抑制斜生柵藻和衣藻PSⅡ的活性[33-34]。Deblois等[35]的研究表明，阿特拉津會(huì)影響藻類的電子輸運(yùn)、初級(jí)生產(chǎn)和光調(diào)節(jié)過程。Ni等[36]的研究表明，藻類的α值和ETRmax值會(huì)隨著除草劑硝磺草酮濃度的增加而降低，表明藻類的光合能力受到抑制。

藻蛋白和藻膽蛋白都隨著ACT濃度的增加呈下降趨勢。蛋白含量的降低說明有毒物質(zhì)能夠抑制藍(lán)藻蛋白質(zhì)的合成[37]。Chia等[38]的研究表明，類毒素會(huì)抑制銅綠微囊藻蛋白質(zhì)的合成。藻膽蛋白包含藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白，它們能附著在類囊體上，其作用是將光能傳遞給Chla，從而進(jìn)行光合作用[39]。ACT染毒后蛋白質(zhì)含量的降低可能與光合作用速率降低有關(guān)，因?yàn)楫?dāng)光合作用受到抑制會(huì)導(dǎo)致用于蛋白合成的碳骨架的缺乏[40]。本研究結(jié)果表明，ACT對藻膽蛋白的抑制作用順序?yàn)閯e藻藍(lán)蛋白>藻藍(lán)蛋白>藻紅蛋白。樓春[41]的研究表明，酰胺類農(nóng)藥對銅綠微囊藻藻膽蛋白的抑制作用也表現(xiàn)為同樣的順序。林必桂等[42]的研究表明，賴氨酸對銅綠微囊藻藻膽蛋白各組分有不同的抑制作用，使微囊藻的光合作用系統(tǒng)受到破壞。因此，推測ACT會(huì)抑制水華微囊藻蛋白質(zhì)的合成，使蛋白質(zhì)含量減少，導(dǎo)致水華微囊藻對光能的捕獲能力降低，造成光合作用受到抑制，致使藻類營養(yǎng)供給不足，這又進(jìn)一步使得蛋白質(zhì)的合成受到抑制。

本研究中藻細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，對照組的類囊體是封閉的圓盤，圍繞核仁區(qū)域并與之平行，而ACT暴露后，類囊體減少并且排列發(fā)生變化，與細(xì)胞壁垂直，這可能是一種保護(hù)細(xì)胞免受超氧陰離子攻擊的機(jī)制[43]，類囊體中存在捕光色素，當(dāng)類囊體受到損傷時(shí)，藻類生長和光合作用也會(huì)受到抑制。氣泡為水生原核生物提供浮力，氣泡壁是由蛋白質(zhì)形成的，ACT染毒后藻細(xì)胞氣泡減少可能是由于蛋白質(zhì)的合成受到抑制且氣泡壁被破壞[44]。染毒后細(xì)胞內(nèi)也會(huì)出現(xiàn)較多的脂質(zhì)顆粒，這可能也是藻細(xì)胞在受到脅迫時(shí)自身的解毒機(jī)制[45]。藻青素小粒是一種氮儲(chǔ)存物，染毒后數(shù)量減少，可能是因?yàn)樵寮?xì)胞在脅迫條件下的生長和分裂過程消耗了細(xì)胞內(nèi)部的氮供應(yīng)[46]。糖原是藍(lán)藻光合作用的產(chǎn)物，主要存在于光合片層之間，ACT染毒后的水華微囊藻中的糖原減少，這可能是因?yàn)樨?fù)責(zé)降解這種多糖的酶過度產(chǎn)生，或者是參與糖原生產(chǎn)和儲(chǔ)存的酶數(shù)量減少[47]。

綜上所述，在低濃度(0.1 mg·L-1和1 mg·L-1)ACT的脅迫下，水華微囊藻Chla含量雖然有所下降，但其能夠通過增強(qiáng)捕光能力和電子傳遞能力使其光合作用不受影響；在高濃度(10 mg·L-1和50 mg·L-1)ACT的脅迫下，水華微囊藻Chla含量、捕光能力、光能轉(zhuǎn)化效率和相對電子傳遞速率均下降，從而導(dǎo)致藻體光合作用能力下降。此外，ACT的脅迫會(huì)導(dǎo)致藻蛋白和藻膽蛋白含量下降，且別藻藍(lán)蛋白最為敏感，蛋白含量的下降會(huì)影響光能的傳遞。與此同時(shí)，ACT對藻細(xì)胞內(nèi)部類囊體造成的損傷也會(huì)導(dǎo)致捕光色素含量降低，這也是導(dǎo)致光合作用能力下降的重要因素。綜合本研究中各項(xiàng)指標(biāo)測量結(jié)果可知，Chla含量對ACT的脅迫最為敏感，但要整體評估藻體光合能力，還需結(jié)合藻體葉綠素?zé)晒鈪?shù)及相關(guān)蛋白含量等參數(shù)。