李聰，代霖，付朝旭，朱雯菲，金銀燕，全昶林，許妍姬

延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研部，延吉 133002

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，無(wú)論是生活還是生產(chǎn)方面，塑料制品得以大量使用[1-2]。在塑料制品的生產(chǎn)工藝中，為了增加塑料材質(zhì)的延展性和可塑性，生產(chǎn)過(guò)程中往往需要添加鄰苯二甲酸酯類(phthalates acid esters, PAEs)作為增塑劑。隨著人類生活質(zhì)量和安全意識(shí)的提高，增塑劑的毒性效應(yīng)逐漸受到關(guān)注。增塑劑中，鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)是目前使用最為廣泛的PAEs有機(jī)化合物，被廣泛應(yīng)用于涂料等建筑材料、食品包裝材料、兒童玩具、辦公用品、化妝品和醫(yī)療器材等塑料產(chǎn)品中[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，DEHP是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptor, EED)，對(duì)機(jī)體有生殖毒性、肝臟毒性、免疫毒性以及神經(jīng)毒性等多種毒性作用，DEHP的毒性研究也越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注[6-12]。

鉛是一種用途廣泛的重金屬，在生活和工業(yè)生產(chǎn)中處處可見(jiàn)。鉛作為一種重要的成分參與塑料制品的生產(chǎn)過(guò)程。聚氯乙烯是一種極性高分子，受熱易分解，產(chǎn)生氯化氫。為解決這個(gè)問(wèn)題，就必須采用熱穩(wěn)定劑。常用的熱穩(wěn)定劑有鉛鹽類、金屬皂類、有機(jī)錫類和復(fù)合穩(wěn)定劑等。其中，因原料易得價(jià)廉、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，鉛鹽熱穩(wěn)定劑廣泛應(yīng)用[13]。隨著鉛的廣泛應(yīng)用，鉛污染嚴(yán)重影響環(huán)境和人體健康，鉛中毒主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性。Pb和DEHP的單一毒性研究已經(jīng)得到眾多學(xué)者的研究證實(shí)[14-21]。

日常生活中，人體可以通過(guò)多種途徑同時(shí)暴露于DEHP和Pb環(huán)境中，但現(xiàn)有的研究還僅局限于DEHP和Pb單一污染物對(duì)動(dòng)物的毒性，缺乏二者聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)將二者聯(lián)合染毒，進(jìn)一步研究DEHP和Pb的聯(lián)合作用及機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

DEHP和Pb均采用體內(nèi)染毒，選擇80只健康雄性適齡SPF級(jí)昆明小鼠(8周齡，體重為(20±2) g)，由延邊大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。為減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異，保證各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均衡性和準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)前按照初始體重進(jìn)行平均分組。在延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)房集中飼養(yǎng)，光、暗周期交替，保持清潔，無(wú)其他病原體環(huán)境，溫度控制在22～25 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%，采用由延邊大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供的普通飼料喂養(yǎng)，小鼠可以自由飲水、飲食，每日記錄其飲水量和飲食量。在實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始前，將小鼠放在正常飼養(yǎng)環(huán)境3 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要實(shí)驗(yàn)試劑：乙酸鉛(純度99.0%，天津市化學(xué)試劑三廠)、鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯(純度99.0%，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)、吐溫80(純度99.0%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：YP600型電子天平(上海精科天平，上海)、SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海生化儀器廠，上海)、全模終端過(guò)濾獨(dú)立送風(fēng)凈化籠具(蘇州工業(yè)園區(qū)唯亭姑秀實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠，江蘇)、Morris水迷宮(上海洛維生物科技有限公司，上海)、小動(dòng)物避暗穿梭儀與跳臺(tái)記錄儀(眾實(shí)迪創(chuàng)(北京)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，北京)。

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)

1.3.1 試劑配制

將DEHP與吐溫80(Tween-80)按照體積為1∶1助溶，并使用雙蒸水配制成濃度為10、50和200 mg·kg-1的染毒液。將乙酸鉛用雙蒸水溶解配制成1 g·L-1，用于鉛組飲水染毒。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組與模型建立

選用80只昆明種小鼠，雄性，體重為(20±2) g。實(shí)驗(yàn)前，為減少個(gè)體差異而影響實(shí)驗(yàn)分組差異，采取稱量初始體重，按照體重大小平均分為8組，每組各10只，分組見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Experimental grouping

每天在固定的時(shí)間，DEHP處理組按照0.1 mL·(10 g)-1的劑量對(duì)小鼠灌胃給藥，CT組和Pb組按照相同比例的劑量給予雙蒸水(DDW)灌胃以作為安慰劑。鉛組用1 g·L-1乙酸鉛通過(guò)自由飲水進(jìn)行染毒，CT組和DEHP組采用雙蒸水自由飲水。聯(lián)合染毒處理組用1 g·L-1乙酸鉛通過(guò)自由飲水染毒，且按照0.1 mL·(10 g)-1的劑量對(duì)小鼠灌胃給藥DEHP。所有各組均自由進(jìn)食。連續(xù)染毒6周，實(shí)驗(yàn)周期共計(jì)50 d。實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察小鼠的毛色、呼吸和狀態(tài)，并記錄各組小鼠體重、進(jìn)食量以及飲水量。

1.4 動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)周期的第6周進(jìn)行小鼠Morris水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練期間照常按時(shí)給藥。水迷宮由直徑1.2 m的圓形水池構(gòu)成，水池中安置有9 cm平臺(tái)，由頂部攝像頭進(jìn)行錄像拍攝，通過(guò)視頻分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。設(shè)定水池分為4個(gè)象限，第一、第二和第三象限分別在池壁設(shè)置固定投放點(diǎn)，平臺(tái)位于第四象限。水池水位位于平臺(tái)上1 cm，實(shí)驗(yàn)全程，保持水溫在(25±1) ℃。

標(biāo)點(diǎn)指引實(shí)驗(yàn)：分別從第一、第二和第三象限的固定位置將小鼠面朝水池壁，頭朝上，投入水中，并同時(shí)啟動(dòng)攝像機(jī)錄像功能，時(shí)間60 s。記錄小鼠從不同象限游上平臺(tái)的時(shí)間，所測(cè)得的時(shí)間稱逃避潛伏期。如果60 s內(nèi)，小鼠未能成功游上平臺(tái)，則需要通過(guò)引導(dǎo)棒引導(dǎo)小鼠上臺(tái)，讓小鼠停留在平臺(tái)10 s，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶力。實(shí)驗(yàn)每隔24 h訓(xùn)練一次，連續(xù)訓(xùn)練6 d，測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)能力。

平臺(tái)尋找實(shí)驗(yàn)：在連續(xù)訓(xùn)練6 d后，間隔24 h，撤去平臺(tái)，將小鼠從平臺(tái)所在象限的對(duì)角象限第二象限固定點(diǎn)位置投放水中，同時(shí)啟動(dòng)攝像機(jī)錄像系統(tǒng)記錄數(shù)據(jù)。記錄小鼠的游泳路線，統(tǒng)計(jì)穿臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間，測(cè)定小鼠空間記憶能力[22-23]。

1.4.2 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，把小鼠先放入跳臺(tái)測(cè)試儀中，使小鼠適應(yīng)儀器密閉環(huán)境3 min。將電壓設(shè)定在36 V的交流電上，將小鼠放在跳臺(tái)儀中的平臺(tái)上，然后開(kāi)啟儀器，記錄數(shù)據(jù)。儀器自動(dòng)記錄小鼠第一次從絕緣平臺(tái)跳下的時(shí)間，即為相應(yīng)小鼠的潛伏期數(shù)據(jù)。連續(xù)記錄5 min，小鼠從臺(tái)上跳下受到電擊的次數(shù)，即為錯(cuò)誤次數(shù)。學(xué)習(xí)成績(jī)階段：記憶獲得階段結(jié)束24 h后進(jìn)行，再次進(jìn)行小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，記錄跳臺(tái)潛伏期和5 min內(nèi)跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)。

1.4.3 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)

小鼠避暗實(shí)驗(yàn)分為記憶獲得階段和學(xué)習(xí)成績(jī)階段[26]。記憶獲得階段：實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始記錄前，將小鼠先放入明箱中使其適應(yīng)儀器明箱環(huán)境3 min，暗箱不通電，小鼠可在明暗箱之間自由活動(dòng)。適應(yīng)結(jié)束后，將小鼠面部背朝洞口放入明箱中，將電壓設(shè)定為36 V，啟動(dòng)儀器進(jìn)行測(cè)定。記錄小鼠第一次從明箱通過(guò)洞口到達(dá)暗箱受到電擊所用的時(shí)間，即為潛伏期。持續(xù)記錄5 min，記錄小鼠從明室穿梭到暗室受到電擊的次數(shù)，即為錯(cuò)誤次數(shù)。學(xué)習(xí)成績(jī)階段：記憶獲得階段24 h后，再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄避暗潛伏期和5 min內(nèi)避暗錯(cuò)誤次數(shù)。

1.5 生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，將各組小鼠禁水禁食12 h，然后稱量各小鼠體重，并采取頸椎脫臼法處死小鼠，解剖并稱量小鼠腦組織(大腦)、心臟、肺、肝臟、脾臟和腎臟，計(jì)算其各臟器系數(shù)。

1.5.2 腦組織勻漿制備及蛋白含量的測(cè)定

通過(guò)機(jī)械扣腦方法，將小鼠大腦完整取出，置于冰上，去除腦組織表面血液，并準(zhǔn)確稱量腦組織重量，按照腦組織重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入生理鹽水，在冰浴條件下，用勻漿器機(jī)械勻漿，制備成10%的腦組織(大腦)勻漿液，放入低溫離心機(jī)內(nèi)，2 500 r·min-1離心10 min，收集上清液。

在西方國(guó)家，從實(shí)質(zhì)意義上而言，個(gè)人本位與社會(huì)本位是沒(méi)有多大區(qū)別的，因?yàn)椋鞣饺耸窃诔浞謱?shí)現(xiàn)個(gè)人權(quán)利的基礎(chǔ)上，全力實(shí)現(xiàn)整個(gè)社會(huì)的公共利益。由此可見(jiàn)，西方的個(gè)人本位與社會(huì)本位，沒(méi)有實(shí)質(zhì)的差異，絕不是中國(guó)人所理解的非此即彼的關(guān)系，更不具有道德的高低之分。然而，在中國(guó)，個(gè)人本位與社會(huì)本位卻因社會(huì)環(huán)境的因素，成為水火不容的對(duì)立局面。從一定程度來(lái)說(shuō)，還是國(guó)人并不理解個(gè)人本位與社會(huì)本位的實(shí)質(zhì)內(nèi)涵，以及誤解了西方個(gè)人本位與社會(huì)本位的關(guān)系，錯(cuò)誤地把社會(huì)本位作為一切的重心，完全拋棄了個(gè)人本位的價(jià)值。其實(shí)，推崇社會(huì)至上的理論，抹殺個(gè)人權(quán)利，迎合中國(guó)千年的所謂王道精神是極為愚蠢和愚昧的。

按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒的方法和步驟，準(zhǔn)確操作，通過(guò)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.99)，通過(guò)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各腦組織的蛋白濃度。

1.5.3 腦組織生化指標(biāo)測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取適量腦組織勻漿液分別測(cè)定丙二醛(MDA)含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、還原型谷胱甘肽(GSH)含量、一氧化氮(NO)含量、總抗氧化能力、單胺氧化酶(MAO)活性和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性。通過(guò)測(cè)定結(jié)果，推斷各組小鼠腦組織損傷程度。

1.6 效應(yīng)相加模型

本實(shí)驗(yàn)采用效應(yīng)相加模型[27]進(jìn)行聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)分析。該模型假設(shè)2種物質(zhì)之間不相互作用，通過(guò)比較化合物混合處理后實(shí)測(cè)值與理論值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值)，判斷2種化合物的聯(lián)合效應(yīng)。

理論值是指2種物質(zhì)單獨(dú)毒性效應(yīng)之和，實(shí)測(cè)值為2種物質(zhì)聯(lián)合作用實(shí)際測(cè)得的毒性效應(yīng)。對(duì)實(shí)測(cè)值和理論值進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)實(shí)測(cè)值與理論值之間沒(méi)有顯著性差異時(shí)(P>0.05)，說(shuō)明2種物質(zhì)互不影響，聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加作用。當(dāng)實(shí)測(cè)值與理論值之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)(P<0.05)，如果實(shí)測(cè)值顯著低于理論值，則表示二者存在拮抗作用；如果實(shí)測(cè)值顯著高于理論值，則表示二者為協(xié)同作用。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠體重及臟器系數(shù)

2.1.1 各組實(shí)驗(yàn)小鼠觀察結(jié)果

各組小鼠經(jīng)灌胃后，立即觀察到，小鼠活動(dòng)均減少，DEHP高劑量組小鼠部分出現(xiàn)胃痙攣和嘔吐等現(xiàn)象。CT組和Pb組恢復(fù)正?；顒?dòng)的時(shí)間相對(duì)較短，隨著DEHP濃度增高，小鼠恢復(fù)正?；钴S度的時(shí)間延長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，各組小鼠的皮毛光滑。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中，小鼠大小便無(wú)異常，眼、鼻和口腔均無(wú)分泌物。通過(guò)灌胃染毒，小鼠沒(méi)有發(fā)生運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，呼吸和飲食飲水均正常，無(wú)死亡現(xiàn)象。將小鼠處死后，觀察腹腔各臟器，各臟器均無(wú)明顯異常。各組小鼠的攝食量和飲水量無(wú)明顯差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果Table 2 Experimental observation results of each group

2.1.2 各組實(shí)驗(yàn)小鼠體重的變化

分別取實(shí)驗(yàn)周期中每周末小鼠體重，進(jìn)行相互比較，無(wú)明顯差異(P>0.05)(表3)。

表3 各給藥組實(shí)驗(yàn)小鼠體重的變化Table 3 Changes in body weight of experimental mice in each drug-administered group

2.1.3 各組實(shí)驗(yàn)小鼠臟器系數(shù)比較

處死小鼠前，稱量小鼠體重，解剖小鼠，取腦、肺、肝、脾、心和腎，稱量各臟器的重量，計(jì)算各臟器系數(shù)。比較各組小鼠的肺、脾、心和腎的臟器系數(shù)，無(wú)明顯差異(P>0.05)；各組小鼠腦組織重量，隨著DEHP濃度增加，逐漸降低，與CT組和Pb組相比，DEHP2+Pb組和DEHP3+Pb組均有差異(P<0.05)；隨DEHP濃度升高，肝臟重量在中劑量DEHP處理組和中劑量聯(lián)合處理組中降低，與CT組和Pb組相比，DEHP2組和DEHP2+Pb組均有差異(P<0.05)。與單獨(dú)染毒組相比，高濃度聯(lián)合染毒組毒性效應(yīng)顯著增強(qiáng)，按效應(yīng)相加模型對(duì)聯(lián)合作用方式進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)測(cè)值大于理論值，聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用(P<0.05)(表4)。

表4 各組實(shí)驗(yàn)小鼠臟器系數(shù)比較Table 4 Comparison of organ coefficients of experimental mice in each group

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各處理組小鼠逃避潛伏期，與空白對(duì)照組相比，隨著DEHP濃度增高，逐漸延長(zhǎng)(P<0.05)；聯(lián)合染毒組分別與DEHP組、Pb組比較，可知聯(lián)合染毒后小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)明顯(P<0.05)。DEHP和Pb染毒對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)能力有不同程度的損害(表5)。

表5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠逃避潛伏期Table 5 The mice escape latency of each group in Morris water maze punctuation guide experiment

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠游泳速度無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)果表明，排除各組小鼠的個(gè)體差異，染毒處理對(duì)各組小鼠體能無(wú)明顯影響(表6)。

表6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠游泳速度比較Table 6 Comparison of swimming speeds of mice in the Morris water maze

Morris水迷宮平臺(tái)尋找實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間最長(zhǎng)，小鼠在目標(biāo)象限的游泳距離占總游泳距離的比例最高，穿臺(tái)次數(shù)最多；隨著DEHP濃度的增高，上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)值降低；高濃度聯(lián)合染毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果最低，空間記憶能力障礙明顯(P<0.05)。與單獨(dú)染毒組相比，高濃度聯(lián)合染毒組毒性效應(yīng)顯著增強(qiáng)，按效應(yīng)相加模型對(duì)聯(lián)合作用方式進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)測(cè)值大于理論值，聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用(P<0.05)(表7)。

表7 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠平臺(tái)尋找實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 The results of finding the platform in each group in Morris water maze experiments

由小鼠在平臺(tái)尋找實(shí)驗(yàn)中的游泳軌跡來(lái)看，空白對(duì)照組小鼠記憶能力最強(qiáng)，在水迷宮中目的性很強(qiáng)，游泳軌跡多集中于目標(biāo)象限，并多次穿越目標(biāo)平臺(tái)；隨著DEHP濃度的增高，小鼠的游泳軌跡逐漸變得無(wú)目的和不規(guī)則；高濃度聯(lián)合染毒組小鼠的游泳軌跡則雜亂無(wú)章，多為無(wú)目的性探索(圖1)。

圖1 小鼠平臺(tái)尋找實(shí)驗(yàn)的游泳軌跡Fig. 1 The swimming trajectories of mice in platform finding task in Morris water maze experiments

2.2.2 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠記憶獲得所用時(shí)間無(wú)明顯差異(P>0.05)；各組小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)階段所用時(shí)間，隨DEHP濃度和聯(lián)合染毒濃度的增高而降低(P<0.05)。高濃度染毒組小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)明顯高于空白對(duì)照組，聯(lián)合染毒組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力低于單一染毒組(P<0.05)(表8)。

表8 各組小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 The experimental results of mice in each group of step down test

2.2.3 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠記憶獲得潛伏期無(wú)明顯差異(P>0.05)；各組小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)潛伏期，隨DEHP濃度和聯(lián)合染毒濃度的增高而降低，差異明顯(P<0.05)。高濃度染毒組小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)明顯高于空白對(duì)照組，聯(lián)合染毒組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力低于單一染毒組(P<0.05)。結(jié)果表明，聯(lián)合染毒對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力影響更大(表9)。

表9 各組小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 9 The experimental results of mice in each group of darkness test

2.3 腦組織生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

小鼠腦組織各生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，與CT組和Pb組相比，單獨(dú)DEHP處理組中，CAT活性、GSH含量和總抗氧化能力隨著DEHP濃度增加逐漸降低，聯(lián)合染毒組與Pb組和對(duì)應(yīng)劑量DEHP染毒組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表10)。單獨(dú)DEHP處理組與對(duì)照組比較，隨著DEHP濃度增加NO含量、MDA含量、MAO活性和AchE活性逐漸增加，聯(lián)合染毒組與Pb組和對(duì)應(yīng)劑量DEHP染毒組比較上述4個(gè)生化指標(biāo)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表11)。與單獨(dú)染毒組相比，中、高濃度聯(lián)合染毒組毒性效應(yīng)顯著增強(qiáng)，按效應(yīng)相加模型對(duì)聯(lián)合作用方式進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)測(cè)值大于理論值，聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用(P<0.05)。

表10 小鼠腦組織抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 10 Results of antioxidant index in mouse brain tissue

表11 小鼠腦組織NO、MDA、MAO和AChE活力測(cè)定結(jié)果Table 11 Results of NO, MDA, MAO and AChE activity in mouse brain tissue

3 討論(Discussion)

DEHP是目前使用最為廣泛的增塑劑，鉛鹽作為重要的熱穩(wěn)定劑被廣泛應(yīng)用于塑料制品的生產(chǎn)過(guò)程中。人體可以通過(guò)多種途徑暴露于DEHP和Pb環(huán)境中，但是現(xiàn)有的研究還僅局限于DEHP和Pb單一污染物對(duì)動(dòng)物的毒性[28-35]，缺乏二者聯(lián)合毒性研究。因此，研究?jī)烧叩穆?lián)合毒性效應(yīng)及其發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，DEHP和Pb染毒對(duì)小鼠體重、每日攝食量和每日飲水量影響不明顯。各處理組中小鼠的肺臟、脾臟、心臟和腎臟無(wú)明顯損傷；隨著染毒濃度增加，腦組織重量逐漸降低，且聯(lián)合染毒組更明顯；肝臟重量隨著DEHP濃度升高，在中劑量時(shí)降低，在高劑量時(shí)有所增加，提示DEHP對(duì)肝臟具有毒性作用，并可能在肝臟產(chǎn)生富集作用。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染毒處理對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)能力損害明顯，導(dǎo)致小鼠空間記憶能力障礙。聯(lián)合染毒組神經(jīng)毒性作用明顯高于各單一染毒組，用效應(yīng)相加模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

為探究其毒性增加是否和氧化損傷相關(guān)，分別對(duì)MDA、NO、CAT、GSH和總抗氧化能力等氧化損傷指標(biāo)和MAO、AchE等神經(jīng)遞質(zhì)類指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。隨著DEHP濃度增加，腦組織中MDA含量、NO含量、MAO活性和AchE活性逐漸增加，聯(lián)合染毒組MDA含量、NO含量、MAO活性和AchE活性增加明顯，腦組織中CAT活性、GSH含量和總抗氧化能力逐漸降低，聯(lián)合染毒組與Pb組和對(duì)應(yīng)劑量DEHP染毒組相比，CAT活性、GSH含量和總抗氧化能力降低明顯。可見(jiàn)，染毒處理導(dǎo)致小鼠腦組織中活性氧增加，清除速率降低，且活性氧作用被放大，抗氧化能力降低，引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至死亡；聯(lián)合染毒后細(xì)胞損傷明顯，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦血流量調(diào)節(jié)障礙，并引發(fā)組織細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低學(xué)習(xí)記憶能力。MAO和AchE是分解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和乙酰膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)的活性酶，染毒處理可影響MAO和AchE活性，從而導(dǎo)致腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)減少，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙。DEHP和Pb聯(lián)合染毒的毒性效果增加，用效應(yīng)相加模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

相關(guān)研究表明，DEHP和甲醛聯(lián)合染毒，小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力較單一染毒組受損明顯，其聯(lián)合毒性具有一定的增強(qiáng)作用[36]。DEHP能影響外周葡萄糖和胰島素穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致海馬胰島素代謝紊亂，與阿爾茨海默病存在潛在關(guān)聯(lián)[37]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEHP可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙，當(dāng)與鉛聯(lián)合染毒后，腦組織氧化損傷加重，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙更為明顯。

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用效應(yīng)相加模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，DEHP和Pb聯(lián)合毒性并非簡(jiǎn)單的相加作用，表現(xiàn)為協(xié)同作用。由于兩者在生活中極易接觸，二者的聯(lián)合作用還需要從分子毒理學(xué)的角度進(jìn)行深入研究。

目前，聯(lián)合作用的評(píng)價(jià)方法大多數(shù)采用2個(gè)基本模型，包括效應(yīng)相加模型[38]與劑量相加模型[39]。本研究采用的效應(yīng)相加模型評(píng)價(jià)方法，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便易行。方法中將實(shí)測(cè)值和理論值進(jìn)行直觀比較，進(jìn)一步保證了結(jié)果的可靠性。但該方法也有不足之處，完全基于受試物某個(gè)特定濃度點(diǎn)產(chǎn)生的單獨(dú)及聯(lián)合效應(yīng)值的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，缺少一定的濃度效應(yīng)關(guān)系依據(jù)。國(guó)內(nèi)外對(duì)于聯(lián)合作用的評(píng)價(jià)方式尚不統(tǒng)一，聯(lián)合毒性作用具有特異性，因此，采用不同的評(píng)價(jià)方式進(jìn)一步開(kāi)展研究并從分子學(xué)角度進(jìn)行驗(yàn)證很有必要的。