曹 蕾 魏秀芹 劉建華 沈倩影 馬 超 薛 梅 張夢巧 高 磊 鄭玉峰 高 強(qiáng)

慢性便秘是一種臨床較為常見的下消化道功能紊亂性疾病，世界范圍內(nèi)便秘的患病率約為16%，我國成年人便秘患病率為7.0%～20.3%[1]。便秘與肛門直腸疾病，如痔、肛裂和直腸脫垂等關(guān)系密切，并且慢性便秘在結(jié)直腸癌等疾病的發(fā)生中可能起重要作用；另外便秘患者用力排便可誘發(fā)心腦血管事件；慢性便秘患者經(jīng)治療后癥狀緩解不明顯，反復(fù)就醫(yī)可出現(xiàn)心理情緒障礙，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降[2-3]。慢性便秘可以分為器質(zhì)性和功能性便秘。慢性功能性便秘的具體病理生理學(xué)機(jī)制尚未得到完全闡明。最近研究[4-5]表明，炎癥介質(zhì)參與功能性便秘的病理生理學(xué)過程。白介素(interleukin, IL)-17A和IL-18是兩種促炎因子，在消化道炎癥和腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用[6-8]。但 IL-17A和IL-18在功能性便秘患者結(jié)腸黏膜內(nèi)的表達(dá)情況少有報道，本研究對慢性功能性便秘患者的結(jié)腸黏膜內(nèi)IL-17A和IL-18表達(dá)情況進(jìn)行檢測，旨在分析其在慢性功能性便秘發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月至2019年6月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診的32例慢性功能性便秘患者作為試驗(yàn)組。其中男性13例，女性19例，年齡24～74歲，平均(51.6±12.4)歲，病程0.5～19 年，平均(4.3±4.2)年; 并選取同期在本院進(jìn)行體檢的30例健康者作為對照組，其中男性15 例，女性15例，年齡34～71 歲，平均(52.2±10.5)歲。兩組患者性別、年齡等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者臨床診斷符合2016 年羅馬IV標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于慢性功能性便秘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]；②病程≥3個月，經(jīng)結(jié)腸鏡等檢查無結(jié)腸器質(zhì)性疾病和腫瘤，近1個月內(nèi)未服用其他影響胃腸動力的藥物。試驗(yàn)組的排除標(biāo)準(zhǔn)包括下列的①和②，對照組的排除標(biāo)準(zhǔn)僅為下列的②：①腸道器質(zhì)性病變造成便秘的患者；②合并有惡性腫瘤、心肝腎肺等重要臟器嚴(yán)重病變患者，血液、免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者；哺乳、妊娠等特殊時期功能性便秘患者。兩組研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 總RNA提取試劑TRIzol Reagent購于美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-polymerase chain reaction, RE-PCR)試劑盒購于Takara公司，PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(見表1)。結(jié)腸黏膜內(nèi)IL-17A和IL-18蛋白水平檢測使用美國艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司IL-17A ELISA試劑盒 (ab83688) 和美國Invitrogen 公司IL-18酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(Catalog no: KE00025)進(jìn)行。

表1 引物序列

1.3 臨床取材 兩組研究對象均填寫基本情況登記表，每例研究對象腸鏡檢查前均采用復(fù)方聚乙二醇電解質(zhì)散行腸道清潔。腸鏡下鉗取3塊乙狀結(jié)腸黏膜活檢組織：1塊組織放入10%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋后切片，切片厚度為4 μm，常溫保存以備 HE使用；另1塊組織用做實(shí)時定量PCR測定組織中mRNA，首先加入RNAlater以保護(hù)mRNA不被降解，然后放置4℃環(huán)境24 h后，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存；第3塊組織用于ELISA方法測定組織中蛋白含量，直接放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織學(xué)觀察 對常規(guī)HE染色切片使用光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)進(jìn)行觀察，對比兩組研究對象結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)情況，上皮細(xì)胞和基底膜完整性，以及黏膜下層結(jié)構(gòu)和炎性細(xì)胞浸潤情況。每例切片隨機(jī)選2個視野進(jìn)行觀察，記錄觀察結(jié)果。

1.5 實(shí)時定量PCR檢測結(jié)腸黏膜內(nèi)IL-17A和IL-18 mRNA水平 RT-PCR檢測結(jié)腸黏膜IL-17A和IL-18 mRNA表達(dá)水平。取200 mg結(jié)腸組織，放到無RNase的1.5 mL離心管中，采用Trizol法提取總RNA，用核酸定量儀測定RNA純度和濃度。取總RNA 2 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。在冰上配制PCR反應(yīng)液，25 μL反應(yīng)體系包括cDNA 2 μL，SYBR Premix EX TaqⅡ (2×) 12.5 μL，DEPC水8.5 μL和上下游引物各1 μL。在BIO-RAD Real-time PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為: 95oC預(yù)變性30 s，95oC 5 s、58oC 30 s、95oC 15 s，共40個循環(huán)。結(jié)果以閾循環(huán) (Ct) 值表示，18srRNA作為內(nèi)參基因，每個樣本3個復(fù)孔，各樣本的待測基因擴(kuò)增量與18srRNA基因擴(kuò)增量采用Log10 (2-ΔΔCt) 法分析mRNA相對表達(dá)量。平均Ct值>35，視為該目標(biāo)基因無表達(dá)。

1.6 ELISA檢測結(jié)腸黏膜內(nèi)IL-17A和IL-18蛋白水平 預(yù)冷 RIPA蛋白抽提試劑，加入酶抑制。在蛋白抽提開始前加入0.1M PMSF母液。Fluka 電動組織勻漿器15 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行勻漿，每次10 s轉(zhuǎn)速進(jìn)行勻漿，間隔10 s進(jìn)行3次。勻漿時EP管需要浸入冰水混合物中進(jìn)行降溫。勻漿完成后在冰上孵育20 min、4oC、13 000 r/min離心，離心完成后取上清，分裝保存待測。ELISA檢測操作按照廠家說明書要求進(jìn)行，檢測線性范圍均為20～480 pg/mL。美國美谷分子 (Molecular Devices) 酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象結(jié)腸黏膜HE染色情況比較 試驗(yàn)組和對照者結(jié)腸黏膜的HE染色結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)異常，未見到明顯淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤等。見圖1、表2。

圖1 試驗(yàn)組和對照組結(jié)腸黏膜活檢情況(HE染色×200)

表2 結(jié)腸黏膜活檢情況

2.2 兩組研究對象結(jié)腸黏膜內(nèi)IL-17A mRNA和IL-18 mRNA表達(dá)水平比較 試驗(yàn)組結(jié)腸黏膜中IL-17A mRNA的表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而IL-18 mRNA表達(dá)水平比較，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 結(jié)腸黏膜內(nèi)IL-17A和IL-18 mRNA表達(dá)水平比較相對表達(dá)倍數(shù))

2.3 結(jié)腸黏膜內(nèi)IL-17A蛋白和IL-18蛋白水平比較 試驗(yàn)組結(jié)腸黏膜中IL-17A蛋白在結(jié)腸癌的黏膜中表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IL-18蛋白兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 結(jié)腸黏膜內(nèi)IL-17A和IL-18 蛋白表達(dá)水平比較表

3 討論

慢性功能性便秘是一種臨床常見的疾病，其發(fā)病機(jī)制的是多種病理生理因素參與，但具體病理生理學(xué)機(jī)制尚未得到完全闡明，目前認(rèn)為便秘與遺傳因素、飲食中纖維素攝入少、活動量少、腸道菌群結(jié)構(gòu)變化以及腸道神經(jīng)化學(xué)信號物質(zhì)如P物質(zhì)和5-羥色胺等多種因素有關(guān)[11-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，炎癥介質(zhì)IL-17A mRNA和蛋白在功能性便秘患者腸道黏膜內(nèi)的表達(dá)水平明顯升高。細(xì)胞因子IL-17A是IL-17家族中6個成員(IL-17A-F)的成員之一，是一種具有多種功能的細(xì)胞因子，主要由Th17細(xì)胞等細(xì)胞分泌，在急慢性炎癥、自身免疫反應(yīng)和腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。IL-17A 通過促進(jìn)細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等炎癥物質(zhì)參與炎癥的過程，并有維持黏膜屏障等保護(hù)作用[13]，IL-17A參與腸道炎癥過程[14]。Mokhtare 等[5]在研究老年便秘患者細(xì)胞因子與便秘的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，血清中IL-1、IL-6和TNF-α明顯高于正常對照組。Cirali等[4]發(fā)現(xiàn)，在兒童便秘患者血清中IL-6和IL-12水平升高，他們認(rèn)為患兒存在亞臨床炎癥。在動物實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)用蒼術(shù)素(Atractylodin)緩解腸道便秘和腹瀉癥狀是通過它的抗炎作用實(shí)現(xiàn)的[15]。結(jié)合這些臨床和動物研究結(jié)果表明炎癥參與便秘的發(fā)病機(jī)制，適當(dāng)?shù)乜刂蒲装Y有可能成為治療便秘的方法之一。在本研究中，從組織學(xué)HE染色結(jié)果來看，并沒有發(fā)現(xiàn)便秘結(jié)腸黏膜明顯的組織病理學(xué)的改變，也沒有發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞或單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞增多，提示結(jié)腸組織明顯的炎癥表現(xiàn)。在本實(shí)驗(yàn)中由于沒有進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和原位雜交以確定IL-17A mRNA的細(xì)胞來源，IL-17A表達(dá)水平增多的原因和細(xì)胞來源還待進(jìn)一步研究。

IL-18主要由單核巨噬細(xì)胞系細(xì)胞分泌，細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖有促進(jìn)IL-18的作用[16]。作為一種促炎因子IL-18具有多種功能，參與腸道炎癥過程，具有促進(jìn)白細(xì)胞聚集、增加黏膜通透性的作用，IL-18在炎癥性腸病中作用已經(jīng)有較為深入的研究[17]。本研究中，IL-18 mRNA和蛋白水平在功能性便秘患者腸道黏膜內(nèi)的表達(dá)水平未見明顯變化，組織學(xué)HE染色也沒有發(fā)現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞增多。IL-17參與功能性便秘發(fā)病的炎癥機(jī)理中，而IL-18則可能沒有參與，原因需要進(jìn)一步研究。Yoon等[18]應(yīng)用益生菌治療慢性功能性便秘，研究結(jié)果顯示益生菌可以有效地改善便秘癥狀，然而并未發(fā)現(xiàn)TNF-α血清水平有所改變，這說明在功能性便秘發(fā)病機(jī)制中不同的IL發(fā)揮的作用存在差異。

綜上所述，IL-17A mRNA和蛋白在功能性便秘結(jié)腸黏膜中表達(dá)升高，提示IL-17A可能參與功能性便秘的發(fā)病機(jī)理或病理過程，而IL-18沒有參與。由于本次研究的樣本量較少，沒有進(jìn)行便秘臨床分型，測定的炎癥介質(zhì)種類不多，也沒有進(jìn)行細(xì)胞學(xué)定性，不能全面反映炎癥介質(zhì)在功能性便秘中的作用。系統(tǒng)全面的、大樣本的深入研究應(yīng)該進(jìn)行以進(jìn)一步全面明確炎癥介質(zhì)與功能性便秘關(guān)系，為臨床治療功能性便秘結(jié)提供依據(jù)。