（貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004）

人類Y染色體為男性特有的性染色體，其在減數(shù)分裂中不發(fā)生重組，以單倍體形式呈父系遺傳[1]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，其突變率較STR低，具有較高的遺傳穩(wěn)定性[2]。Y染色體SNP（Y-SNP）單倍群譜系在世界人群中的分布具有很強的地理特異性，是研究人類父系遷移的理想遺傳標(biāo)記[3-5]。其中單倍群O、C、D、N約占東亞男性的93%[6]，O單倍群下游O1a-M199、O2a1-M95在中國南方集中分布，是南方壯侗語族人群的主要單倍型[7-8]。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，Y-SNP單倍群可用于推斷生物學(xué)檢材的族群地域來源[9-10]，在陳舊性檢材的身份鑒定中亦得到成功應(yīng)用，如曹操叔祖父[11]、中國赴緬遠征軍[12]、淮海戰(zhàn)役[13]等的遺骸鑒定。

水族是貴州省18個世居民族之一，主要聚居于黔桂交界的龍江、都柳江上游地帶，貴州省黔南的三都水族自治縣、荔波、獨山、都勻等縣市為其主要居住區(qū)。2003年何燕等[14]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)貴州三都水族的Y染色體單倍群主要為南方人群主要的單倍型O2a1-M95與O1a-M119，頻率高達90%。本研究對貴州180份水族男性無關(guān)個體Y染色體上的11個Y-SNP位點進行分型檢測，進一步分析其單倍群分布情況，探索其與其他民族的親緣關(guān)系，以期為法醫(yī)學(xué)族群地域推斷應(yīng)用和群體遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和DNA提取

本研究使用的所有血痕濾紙片由貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)司法鑒定中心提供。收集來自貴州省荔波縣、獨山縣、三都縣、都勻市地區(qū)三代均為水族的無血緣關(guān)系男性樣本180例，記錄為貴州水族。在簽署知情同意書的前提下，采集指尖血制成血痕濾紙片，自然陰干，常溫保存。采用Chelex-100法[2]提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。本研究已通過貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 Y-SNP基因分型

單倍群O-M175、C-M130、D-M174和N-M231是東亞4個主要的Y染色體單倍群，其中O-M175是東亞最大的單倍群，約占75%[7-8]。依據(jù)2018版Y染色體譜系樹（https://isogg.org/tree/2018/index18.html）和文獻[15]調(diào)研，本研究選擇了O-M175、C-M130、D-M174和N-M231位點及O單倍群下游的O1-F265、O2-M122、O1a-M119、O1b-M268、O2a-M324、O2b-F742、O2a2-IMS-JST021354共11個Y-SNP位點對貴州水族180份男性樣本進行研究。

采用微測序技術(shù)對貴州水族男性樣本11個YSNP位點的分型進行檢測[16]，擴增引物及延伸引物見表1。使用9700型PCR儀（美國Applied Biosystems公司）進行PCR擴增，用3500遺傳分析儀（美國Applied Biosystems公司）進行毛細管電泳檢測。利用Gene-MapperTMID-X v1.4軟件（美國Thermo Scientific公司）進行等位基因分型。

表1 11個Y-SNP位點的擴增引物和延伸引物信息Tab.1 Information of the amplification primers and extension primers for the 11 Y-SNP loci

續(xù)表1Continued Tab.1

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)每個樣本11個Y-SNP位點的分型判斷其所屬單倍群類別，用直接計數(shù)法統(tǒng)計180例貴州水族無關(guān)男性樣本的Y-SNP單倍群頻數(shù)及頻率。基于所研究的貴州水族及文獻[17-21]報道的22個民族群體的YSNP單倍群頻率數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計軟件包Multi-variate statistical package（MVSP）對包括研究目標(biāo)在內(nèi)的23個群體進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。采用Arlequin v3.5軟件計算貴州水族與其他群體的Fst遺傳距離，使用MEGA 4.0軟件根據(jù)Fst值繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié) 果

2.1 Y染色體單倍群在貴州水族的頻率分布

11個Y-SNP位點所構(gòu)成的單倍群譜系樹如圖1所示。180例貴州水族男性樣本中，共觀察到6種Y染色體單倍群：C-M130、D-M174、O1a-M199、O1b-M268、O2a-M324和 O2a2-IMS-JST021354。O 單倍群的分布頻率最高，為71.11%，其次是C單倍群，為25.00%，之后是D單倍群，為3.89%，未觀察到N-M231單倍群。其中分布頻率較高的是O1b-M268、O2a2-IMS-JST021354、C-M130單倍群，分別為31.11%、28.33%、25.00%。分布頻數(shù)和頻率如表2所示。

圖1 11個Y-SNP位點構(gòu)成的單倍群譜系樹Fig.1 Haplogroup pedigree tree of the 11 Y-SNP loci

表2 貴州水族單倍群頻數(shù)及頻率Tab.2 Numbers and frequencies of haplogroups in Guizhou Shui ethnic group

2.2 貴州水族與其他民族的比較

基于單倍群頻率進行PCA，結(jié)果如圖2所示。PC1和PC2的貢獻率分別為41.90%和26.74%，兩者的累計貢獻率為68.64。從圖2可以看出，除貴州毛南族與畬族外，其余民族的分布較為集中。本研究中貴州水族與貴州仡佬族和漢族的遺傳距離較近，與貴州毛南族、畬族及羌族關(guān)系較遠。從語系角度來看，除毛南族與布依族外，大部分壯侗語族（壯族、侗族、水族、仡佬族、仫佬族）距離較近；阿爾泰語系（蒙古族、滿族）均在第二象限，距離也較近；漢語語族（漢族、回族）分布較為離散，不在同一象限；大部分的藏緬語族（納西族、彝族、土家族、白族）距離較近，而景頗族及羌族距離較遠；苗瑤語族除畬族外，瑤族與苗族均在第一象限，距離較近。

圖2 貴州水族與其他22個民族的PCA圖Fig.2 Principal component analysis of Guizhou Shui ethnic group and other 22 ethnic groups

貴州水族與其他22個民族的系統(tǒng)發(fā)生樹如圖3所示。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示本研究對象貴州水族單為一類，與貴州同語族的仡佬族、侗族父系的親緣關(guān)系最近。系統(tǒng)發(fā)生樹中顯示畬族與其他22個民族分為兩支。按語言分類來看，各族群以小范圍相同語系族群聚集在一起：壯侗語族中，仡佬族、水族、侗族親緣關(guān)系較近，壯族、仫佬族、三都水族親緣關(guān)系較為接近，而布依族及毛南族則與他們親緣關(guān)系較遠；藏緬語族的彝族、白族、納西族親緣關(guān)系最近，與土家族、羌族、景頗族親緣關(guān)系較遠；苗瑤語族的苗族與瑤族親緣關(guān)系較近；阿爾泰語系的滿族與蒙古族親緣關(guān)系較遠，同時漢語語族的漢族與回族親緣關(guān)系也較遠。PCA圖與系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果相一致，均提示貴州水族與貴州仡佬族父系的遺傳關(guān)系較近。

圖3 貴州水族與其他22個民族的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of Guizhou Shui ethnic group and other 22 ethnic groups

3 討 論

本研究對貴州水族男性無關(guān)個體11個Y-SNP位點進行分型，共觀察到6種單倍群，頻率最高的為OM175單倍群（71.11%），這與我國Y染色體單倍群的分布頻率一致，約75%的中國人可歸到這一類[5]。OM175是東亞人群的特征性單倍群，為O單倍群下游分支，O2-M122是漢藏族群的主要單倍群，而O1a-M119是壯侗語族群的高頻率單倍群，O1b-M268和O2a2-IMS-JST021354 常見于 南 方少數(shù)民族[7-8，22]。2003 年 ，何燕等[14]對92例貴州三都水族Y染色體單倍群進行分析，主要單倍群為O2a1-M95（58.70%）和O1a-M119（31.50%），但是樣本量較少，Y染色體單倍群數(shù)據(jù)存在一定的偏差。而在本研究中O1b-M268（31.11%）和 O2a2-IMS-JST021354（28.33%）均比 O1a-M119（10.56%）所占比例高，三者所占比例之和為70.00%，表明貴州水族是典型的南方少數(shù)民族。C-M130單倍群的頻率為25.00%，相較于以往的文獻報道存在一定差異。2003年，文波[23]檢測的50例貴州三都水族人群中未觀察到C-M130單倍群。2019年，張秀秀[17]在研究貴州17個世居少數(shù)民族人群時，也未檢出C-M130單倍群。這可能與樣本的采集地域和樣本數(shù)量有關(guān)，同時也為貴州水族人群提供了新的參考數(shù)據(jù)。M130是C單倍群的特征位點，起源于第一批從非洲遷出的現(xiàn)代人類，在歐亞大陸的東部、東亞、東南亞地區(qū)人群可見，且C-M130下游的分支都有著區(qū)域特異性分布[24]，提示對貴州水族人群的族群來源或者對與之有基因交流的人群進行研究時，還應(yīng)對C單倍群下游的分支進行分型。

對貴州水族與其他22個民族Y-SNP主要單倍群頻率進行比較，可以看出，不同語系之間存在差異，除苗瑤語族的畬族以及漢語語族的貴州漢族、回族較為離散外，各語系以小范圍的族群相互聚集在一起。而對于畬族及回族的語言歸屬存在過爭議，根據(jù)其使用語言分別定為苗瑤語族及漢語語族[25-26]。從各語系聚類結(jié)果來看，聚類效果并不明顯，這可能是由于所選擇參考人群大部分為貴州族群，地理位置較為接近、各族群基因交流頻繁所致。從PCA圖可以初步看出，本研究的貴州水族與貴州仡佬族遺傳距離最近。余躍生等[27]研究貴州水族線粒體DNA時發(fā)現(xiàn)，貴州水族與壯族存在較多的單倍型共享，與其具有同源性。本課題組前期對該貴州水族男性人群Y-STR進行研究時發(fā)現(xiàn)，貴州水族也與壯族遺傳關(guān)系較近[28]，但是對貴州水族X-STR研究時發(fā)現(xiàn)，貴州水族與仡佬族、漢族親緣關(guān)系較近[29]，本研究結(jié)果與其基本一致，這與樣本量及采集樣本的隨機性有一定關(guān)系。水族與仡佬族均屬壯侗語族，兩者由古代“百越”族群發(fā)展而來[30]，這提示貴州水族可能是生活在中國西南地區(qū)的土著人口。本研究中貴州水族群體與張秀秀[17]研究的三都水族群體遺傳距離較遠，可以考慮對貴州地區(qū)各地域的水族樣本更加細分、增加樣本量來減少樣本選擇上所帶來的誤差。

本研究從Y-SNP單倍群角度，通過對180份貴州水族男性無關(guān)個體11個Y-SNP位點的檢測與分析，獲得單倍群頻率數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，貴州水族Y-SNP單倍群分布具有一定特異性，可為貴州地區(qū)法醫(yī)學(xué)生物檢材族群地域推斷奠定基礎(chǔ)，豐富貴州地區(qū)少數(shù)民族的遺傳學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。