（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

死亡時(shí)間或死后間隔時(shí)間（postmortem interval，PMI）是指機(jī)體死后所經(jīng)歷的時(shí)間間隔[1]。早期死亡時(shí)間推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題，對(duì)于認(rèn)定案件事實(shí)、確定犯案時(shí)間、排查犯罪嫌疑人以及劃定偵查范圍有著重要的意義。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，死亡時(shí)間推斷主要依靠尸體現(xiàn)象，如尸溫、尸僵、尸斑、角膜變化、超生反應(yīng)等，這些方法簡單實(shí)用，但主觀性較強(qiáng)，結(jié)果差異大，因此，有學(xué)者[2]認(rèn)為不應(yīng)將這類推斷結(jié)果作為法庭證據(jù)使用。其他例如物理方法、組織生物化學(xué)方法、DNA和RNA降解相關(guān)研究及代謝組學(xué)方法均已有報(bào)道[3-5]。在死亡時(shí)間推斷的研究中，環(huán)境溫度是重要的影響因素之一，無論是傳統(tǒng)方法還是新技術(shù)，均會(huì)影響推斷結(jié)果的準(zhǔn)確性[6-7]。YANG等[8]為了考察環(huán)境溫度的影響，通過測量玻璃體液中鉀、鈉、氯等離子及腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、肌酐和尿素氮的濃度，結(jié)合環(huán)境溫度，建立了物質(zhì)濃度、環(huán)境溫度、死亡時(shí)間三者相互關(guān)系的插值函數(shù)模型，用于不同環(huán)境溫度下的死亡時(shí)間推斷。

代謝組學(xué)是一種對(duì)體內(nèi)小分子代謝物（相對(duì)分子質(zhì)量<1 000）進(jìn)行整體分析的方法，通過系統(tǒng)觀察小分子代謝物整體變化情況可以推斷死亡時(shí)間，而與氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結(jié)合是常用的技術(shù)手段。雖然該方法需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理[9]，但由于該方法分辨率高、靈敏度好、選擇性好、分析時(shí)間短以及擁有諸如美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）數(shù)據(jù)庫等優(yōu)勢(shì)，被許多相關(guān)的研究所采用。近年來，已有許多利用代謝組學(xué)手段推斷死亡時(shí)間的研究[10-12]，其中部分學(xué)者[13-15]基于GCMS代謝組學(xué)進(jìn)行大鼠窒息死以及中毒死的死亡時(shí)間推斷研究，并建立了死亡時(shí)間推斷的代謝組學(xué)模型。然而，這些利用代謝組學(xué)推斷死亡時(shí)間的研究均將外界環(huán)境溫度設(shè)定在一個(gè)恒定狀態(tài)，并未探討不同環(huán)境溫度下的死亡時(shí)間推斷情況。

本研究旨在通過GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)觀察不同環(huán)境溫度（5℃、15℃、25℃、35℃）下機(jī)體死后內(nèi)源性小分子物質(zhì)的整體變化情況，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析篩選各環(huán)境溫度下大鼠機(jī)體內(nèi)與死亡時(shí)間相關(guān)的差異代謝物，并利用這些差異代謝物分別建立不同環(huán)境溫度條件下大鼠的早期死亡時(shí)間（0～24h）推斷模型，對(duì)大鼠早期死亡時(shí)間進(jìn)行推斷。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），Sorvall ST16R高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），DC-24-RT防腐型氮吹儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），CTHI-250B恒溫恒濕箱［施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司］。

L-2-氯苯丙氨酸（純度99%）、甲氧胺鹽酸鹽（純度98%）均購自北京百靈威科技有限公司，硬脂酸甲酯（純度99.5%，美國Sigma-Aldrich公司），N，O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺［N，O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA］+1%三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS）25 mL（北京索萊寶科技有限公司），乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司），吡啶（分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司），正庚烷（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF級(jí)SD大鼠132只，體質(zhì)量（220±10）g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。本研究獲得四川大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度45%～55%，光照/黑暗 12 h 交替（08：00—20：00/20：00—08：00），自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)組

將96只大鼠隨機(jī)分為5℃、15℃、25℃、35℃組，每組均設(shè)置死后3 h、6 h、12 h、24 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，所有大鼠在處死后立即被放入設(shè)置好溫度的培養(yǎng)箱中。

大鼠的處死方式均為：用尼龍繩打一個(gè)可活動(dòng)的結(jié)扣，乙醚麻醉大鼠后，將其頸部置于結(jié)扣內(nèi)，拉動(dòng)結(jié)扣使其慢慢收緊，造成頸部氣管受壓從而引起窒息死亡。在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)解剖大鼠并采集心血約0.5 mL，迅速將血液樣本置于液氮中冷凍后于-80℃儲(chǔ)存。

1.2.2 對(duì)照組

取6只大鼠，于處死后立即（死后0 h）解剖并取樣，作為對(duì)照組。其余處理方法同實(shí)驗(yàn)組。

1.2.3 預(yù)測組

另取30只大鼠作為預(yù)測組。首先將其中24只大鼠分為5℃、15℃、25℃、35℃組，每組設(shè)置死后9 h、18h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只。另外6只大鼠：3只的死后環(huán)境溫度設(shè)置為10℃，于死后12 h取樣；3只的死后環(huán)境溫度設(shè)置為20℃，于死后6h取樣。其余處理方法同實(shí)驗(yàn)組。

1.3 樣本前處理

血液樣本：在已有文獻(xiàn)[16]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，將血液樣本置于4℃冰箱中解凍，解凍后將樣本混勻。取100μL血液樣本于1.5mL微量離心管中，加入250μg/mL的L-2-氯苯丙氨酸溶液20 μL，混勻。加入-20℃冰乙腈300μL，渦旋混勻15s后于冷凍離心機(jī)中在4℃下以16099×g離心10min，取上清液100μL于另一微量離心管中，室溫下氮?dú)饬鲹]干。殘?jiān)屑尤?0μL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的甲氧胺吡啶溶液，密閉渦旋15s，置于80℃烘箱中肟化15min，取出后于暗處放置冷卻30min。肟化完成后，迅速加入30μL硅烷化試劑（BSTFA+1%TMCS），渦旋15s，于80℃烘箱中衍生化15min，取出后暗處放置30min冷卻。衍生化完成后，加入50μL質(zhì)量濃度為50μg/mL的硬脂酸甲酯庚烷溶液，渦旋15 s。冷凍離心機(jī)中4℃下以16 099×g離心10min后取上清液90μL置于裝有支架的液相小瓶中進(jìn)行GC-MS分析。

空白樣本：取100 μL冰乙腈于1.5 mL微量離心管中，加入250 μg/mL的L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液20μL，其余操作同血液樣本。

質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本：取各溫度組內(nèi)的所有血液樣本各30μL于2.5mL微量離心管中混勻，分別制得4個(gè)溫度組的QC樣本。取100 μL QC樣本于1.5mL微量離心管中，加入250μg/mL的L-2-氯苯丙氨酸溶液20μL，混勻，加入300μL冰乙腈，其余操作同血液樣本。

1.4 GC-MS分析

1.4.1 分析條件

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250℃，輔助加熱器溫度為230℃，分流比為5∶1；起始溫度為60℃，保持1 min，以8℃/min升至300℃，最后保持7min。

質(zhì)譜條件：四極桿溫度設(shè)置為150℃，離子源溫度設(shè)置為230℃，采用電子轟擊電離（electron impact ionization，EI）方式，電離能量為 70 eV，溶劑延遲為4.5min，設(shè)置為全掃描模式，掃描范圍m/z 50～600。

1.4.2 進(jìn)樣條件和方式

檢測血液樣本前先進(jìn)行1個(gè)硬脂酸甲酯庚烷溶液樣本、1個(gè)空白樣本以及3個(gè)QC樣本進(jìn)樣，而后每8個(gè)血液樣本間安插1個(gè)QC樣本（每個(gè)溫度組樣本分析過程均進(jìn)了6個(gè)QC樣本）。硬脂酸甲酯用于觀察各色譜峰的位置是否有較大偏移，空白樣本用于排除外源性物質(zhì)的干擾，QC樣本用于監(jiān)測整個(gè)分析過程的穩(wěn)定性，并評(píng)估方法的再現(xiàn)性和穩(wěn)定性[17-18]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 預(yù)處理

整理包含樣本信息、保留時(shí)間和峰面積的數(shù)據(jù)。（1）所有樣本均扣除空白樣本中出現(xiàn)的污染物色譜峰。（2）所有剩余的代謝物通過匹配NIST 14譜庫，按匹配度>80%的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行匹配確定。（3）將所有代謝物峰面積除以L-2-氯苯丙氨酸峰面積進(jìn)行校正，得到所有代謝物的相對(duì)含量。（4）計(jì)算各代謝物在QC樣本上的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD），當(dāng)RSD>30%時(shí)[19]，將該代謝物數(shù)據(jù)作為異常值剔除。將預(yù)處理好的數(shù)據(jù)制作成Excel數(shù)據(jù)矩陣。

1.5.2 統(tǒng)計(jì)分析

將分組后的數(shù)據(jù)制成矩陣形式分別導(dǎo)入SIMCAP 14.1軟件（瑞典Umetrics公司），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）以及正交偏最小二乘（orthogonal partial least square，OPLS）分析，得到的得分圖是PCA以及OPLS分析的可視化結(jié)果。PCA用于觀察分析過程是否穩(wěn)定，OPLS分析用于差異代謝物的篩選及回歸模型的建立，并采用交叉驗(yàn)證和置換驗(yàn)證來驗(yàn)證模型的可靠性。參考以往研究[15]，將本實(shí)驗(yàn)差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：OPLS分析中變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）>1，SPSS 22.0軟件（美國IBM公司）中Kruskal-Wallis檢驗(yàn)P<0.001。利用篩選出的差異代謝物建立OPLS回歸模型用于死亡時(shí)間推斷，該回歸模型中的自變量（x）為差異代謝物相對(duì)含量的整體變化，因變量（y）為死亡時(shí)間。

模型對(duì)于預(yù)測組的預(yù)測結(jié)果與實(shí)際死亡時(shí)間之間的比較用均方根誤差（root mean square error，RMSE）表示，代表預(yù)測值與真實(shí)值之間的偏差，可用于比較不同模型之間的預(yù)測能力。同時(shí)，為了考察環(huán)境溫度對(duì)于推斷偏差的影響，采用t檢驗(yàn)分別對(duì)5℃模型預(yù)測其他溫度（15℃、25℃、35℃）預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差與5℃預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

將4個(gè)溫度組共同差異代謝物的信息導(dǎo)入GraphPad Prism 6.0軟件（美國GraphPad Software公司）制作其相對(duì)含量變化趨勢(shì)圖，用于觀察變化趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 代謝產(chǎn)物的鑒定

4個(gè)溫度組的血液樣本經(jīng)GC-MS分析后得到的全代謝物為：5℃組67種，15℃組68種，25℃組72種，35℃組78種。這些物質(zhì)包括有機(jī)酸、氨基酸、糖類、脂質(zhì)以及部分其他代謝物等。

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 PCA分析

PCA分析結(jié)果如圖1所示，各組的QC樣本聚集在一起，說明GC-MS本身以及樣本在進(jìn)樣前、進(jìn)樣中和進(jìn)樣后都保持相對(duì)穩(wěn)定，通過該儀器獲得的數(shù)據(jù)也穩(wěn)定可靠。

圖1 4個(gè)溫度組樣本的PCA得分圖Fig.1 PCA score plots of samples in 4 temperature groups

2.2.2 OPLS分析篩選差異代謝物

OPLS分析篩選出各溫度組大鼠血液代謝物中與死亡時(shí)間相關(guān)的差異代謝物。5℃組共有18種差異代謝物，其中有機(jī)酸3種（琥珀酸、?；撬帷?-羥基丁酸），氨基酸5種（賴氨酸、丙氨酸、5-羥脯氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸），糖類1種（山梨糖醇），脂質(zhì)2種（磷酸甘油、甘油）以及其他類物質(zhì)7種（黃嘌呤、丙二醇、丙胺、肌醇、次黃嘌呤、煙酰胺、胸腺嘧啶）。15℃組共有15種差異代謝物，其中有機(jī)酸1種（泛酸），氨基酸4種（異亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸），脂質(zhì)4種（甘油、花生四烯酸、磷酸甘油、花生酸）以及其他類物質(zhì)6種（黃嘌呤、乙醇胺、丙二醇、腺嘌呤、次黃嘌呤、尿酸）。25℃組共有24種差異代謝物，其中有機(jī)酸3種（泛酸、琥珀酸、4-羥基丁酸），氨基酸8種（酪氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、氨基丙二酸、丙氨酸），糖類2種（山梨糖醇、甘露糖），脂質(zhì)4種（二十二碳四烯酸、甘油、磷酸甘油、膽固醇）以及其他類物質(zhì)7種（黃嘌呤、胸腺嘧啶、乙醇胺、尿嘧啶、尿酸、次黃嘌呤、煙酰胺）。35℃組共有30種差異代謝物，其中有機(jī)酸4種（泛酸、琥珀酸、4-羥基丁酸、丙酮酸），氨基酸12種（異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸），糖類2種（山梨糖、甘露糖），脂質(zhì)3種（膽固醇、甘油、磷酸甘油）以及其他類物質(zhì)9種（胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤、丙二醇、次黃嘌呤、乙醇胺、腺嘌呤、多巴胺、肌醇）。其中，黃嘌呤、次黃嘌呤、甘油、磷酸甘油、丙氨酸以及異亮氨酸為4個(gè)溫度組所共有的差異代謝物，這6種物質(zhì)的相對(duì)含量隨死亡時(shí)間的變化趨勢(shì)見圖2。

圖2 4個(gè)溫度組共有差異代謝物隨死亡時(shí)間的變化Fig.2 Changes of common differential metabolites with postmortem interval in 4 temperature groups

2.2.3 OPLS回歸模型及模型驗(yàn)證

利用差異代謝物建立的OPLS得分圖見圖3。從圖中可見，5℃組大鼠死后3h與6h的分離度較差，其余各組各死亡時(shí)間點(diǎn)之間基本分離。在各溫度組模型中，死后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h的樣本在圖中分布大致為從左到右的順序，表明分布位置與死亡時(shí)間具有一定的相關(guān)性。

圖3 4個(gè)溫度組樣本的OPLS得分圖Fig.3 OPLS score plots of samples in 4 temperature groups

利用差異代謝物建立各溫度組的OPLS回歸模型方程，分別為：5 ℃，y=x+3.893×10-7（R2=0.915 4）；15℃，y=x-3.623×10-7（R2=0.8943）；25℃，y=x+3.149×10-7（R2=0.974 0）；35℃：y=x-5.639×10-7（R2=0.992 1）?？梢姴町惔x物的整體變化與死亡時(shí)間之間具有一定的線性相關(guān)。

4個(gè)溫度組OPLS回歸模型的交叉驗(yàn)證以及置換驗(yàn)證結(jié)果見表1。結(jié)果表明，各溫度組模型的擬合程度和預(yù)測能力均較好，未出現(xiàn)過擬合的情況。

表1 4個(gè)溫度組OPLS回歸模型的交叉驗(yàn)證及置換驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Cross validation and permutation validation results of OPLS regression models in 4 temperature groups

2.3 OPLS回歸模型用于預(yù)測組樣本的預(yù)測結(jié)果

首先將24只預(yù)測組大鼠樣本數(shù)據(jù)分別代入所建立的5℃、15℃、25℃、35℃組模型中，然后將環(huán)境溫度為10℃、20℃的預(yù)測組樣本分別代入與其溫度最接近的模型中進(jìn)行預(yù)測，即分別代入5℃組和15℃組模型進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測組樣本的預(yù)測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，5℃模型相對(duì)其他組預(yù)測偏差較大，其余各組預(yù)測結(jié)果較為理想。

表2 預(yù)測組樣本的預(yù)測結(jié)果Tab.2 Prediction results of samples in prediction groups（n=3，時(shí)間/h）

為了探究溫度造成的偏差與組內(nèi)偏差之間的關(guān)系，將15℃、25℃、35℃預(yù)測組樣本均代入5℃模型中進(jìn)行預(yù)測，采用t檢驗(yàn)分別對(duì)5℃模型預(yù)測15℃、25℃、35℃預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差與5℃預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，利用5℃組模型預(yù)測其他溫度預(yù)測組樣本的偏差與5℃預(yù)測組樣本的偏差之間，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 5℃模型對(duì)不同溫度預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差比較Tab.3 Error comparison of prediction results of different temperature prediction groups using 5℃model（n=3，時(shí)間/h）

3 討 論

本研究基于GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，分別篩選出5℃、15℃、25℃、35℃環(huán)境溫度下窒息死大鼠心血中與死亡時(shí)間相關(guān)的差異代謝物，并利用這些差異代謝物建立了4種環(huán)境溫度下的OPLS回歸模型用于推斷窒息死大鼠的早期死亡時(shí)間，同時(shí)設(shè)置了預(yù)測組樣本考察各溫度組模型的預(yù)測能力。與以往利用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)推斷死亡時(shí)間的研究[13-15，20]相比，本研究對(duì)環(huán)境溫度進(jìn)行了細(xì)化和分組，一定程度上提高了代謝組學(xué)推斷死亡時(shí)間的準(zhǔn)確性。在模型建立過程中，PCA分析用于觀察整個(gè)過程是否穩(wěn)定，結(jié)果顯示，各組QC樣本在PCA得分圖中均聚集，說明整個(gè)分析過程穩(wěn)定、可靠[14-15]，排除了儀器等不穩(wěn)定因素對(duì)數(shù)據(jù)造成的干擾。OPLS法由TRYGG等[21]于2002年提出，是一種多因變量對(duì)多自變量的回歸建模方法，其首要特點(diǎn)是排除了自變量（x）與分類變量（y）無關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使分類信息集中在一個(gè)或某幾個(gè)主成分中，從而使模型變得簡單、易于解釋，使得各組之間的判別效果以及多元統(tǒng)計(jì)分析得分圖的可視化效果更加明顯。OPLS回歸模型交叉驗(yàn)證結(jié)果中的R2值反映模型的擬合程度，R2值越接近1表明模型擬合性越好；Q2值反映模型的預(yù)測能力，Q2值>0.9說明模型具有很好的預(yù)測能力，并且R2值與Q2值越接近說明模型建立的效果越好，一般認(rèn)為R2值與Q2值相差不能超過0.5[22]。模型置換驗(yàn)證結(jié)果中的R20值（R2在Y軸上的截距）及Q20值（Q2在Y軸上的截距）用于評(píng)估模型是否出現(xiàn)過擬合，一般認(rèn)為R20<0.4和Q20<0.05，模型擬合較好[23]。本研究所建立的模型驗(yàn)證結(jié)果表明所建立的4個(gè)溫度組模型成功、可靠，擬合程度好，未發(fā)生過擬合，說明模型的預(yù)測結(jié)果客觀、可信。從OPLS得分圖（圖3）可以看出，各溫度組各死亡時(shí)間點(diǎn)在圖中呈現(xiàn)一定的從左至右的分布趨勢(shì)，這反映了代謝物的整體變化呈現(xiàn)時(shí)間相關(guān)性。圖中還可見5℃模型死后3h、6h兩個(gè)組區(qū)分度較差，這可能與較低環(huán)境溫度下死后尸體內(nèi)相關(guān)代謝物含量變化緩慢有關(guān)，導(dǎo)致5℃模型推斷結(jié)果準(zhǔn)確性的下降。

本研究所設(shè)置的4個(gè)溫度組模型所篩選出的差異代謝物分別為5℃組18種、15℃組15種、25℃組24種、35℃組30種，可以看出差異代謝物種類隨溫度升高呈增多趨勢(shì)，而WU等[14]和DAI等[15]所建立的單一溫度下的推斷模型，差異代謝物種類分別僅為13種和20種。因此，當(dāng)預(yù)測樣本所處環(huán)境溫度高于模型所建立條件時(shí)，模型所涵蓋的代謝物信息會(huì)出現(xiàn)缺失，導(dǎo)致預(yù)測結(jié)果產(chǎn)生較大誤差。本研究4個(gè)溫度組模型中篩選出6種共有的差異代謝物，分別為黃嘌呤、次黃嘌呤、甘油、磷酸甘油、丙氨酸和異亮氨酸。黃嘌呤和次黃嘌呤是嘌呤分解代謝的中間產(chǎn)物，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下分解產(chǎn)生黃嘌呤，而黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下繼續(xù)分解生成尿酸。本研究中黃嘌呤和次黃嘌呤含量的不斷增高可能與機(jī)體死后細(xì)胞內(nèi)核苷酸不斷分解以及別嘌呤醇和黃嘌呤氧化酶活性不斷降低有關(guān)，因此無法形成最終的代謝產(chǎn)物尿酸。同時(shí)，有研究表明，細(xì)胞的死亡是不同步的[24]，特別是在低溫環(huán)境下核苷酸降解較慢[25]，因此，其含量變化呈現(xiàn)溫度相關(guān)性的遞進(jìn)式增加。甘油是機(jī)體重要的能源物質(zhì)，也是合成脂肪的主要來源。機(jī)體死后，由于合成作用停止，隨著死亡時(shí)間的延長，脂肪逐漸分解成甘油和其他游離的脂肪酸。本研究中甘油含量隨死亡時(shí)間的延長而逐步增加，該結(jié)果與既往死后代謝組學(xué)研究結(jié)果[26]相吻合。磷酸甘油是甘油在甘油激酶的作用下轉(zhuǎn)變而來的，磷酸甘油還可以轉(zhuǎn)化成磷酸二羥丙酮參與糖酵解和糖異生。磷酸甘油也是脂質(zhì)合成的重要原料，因此，在死后早期其含量因脂質(zhì)合成停止而相對(duì)增高，后期含量減少可能與微生物活動(dòng)逐漸增強(qiáng)有關(guān)[13]。在死后24h內(nèi)，丙氨酸和異亮氨酸的含量在不同溫度下隨死亡時(shí)間的延長不斷增高，這與相關(guān)研究[13]報(bào)道的結(jié)果一致。在較早期的研究中，也有學(xué)者[27]發(fā)現(xiàn)，腦組織中的丙氨酸和異亮氨酸等氨基酸也都隨著死亡時(shí)間的延長而增加，本研究進(jìn)一步證明了這種氨基酸含量的變化規(guī)律。丙氨酸及異亮氨酸在大鼠死后的含量增加，可能有以下幾個(gè)原因[28]：（1）死后組織、蛋白在不同細(xì)菌以及細(xì)胞自身所含有的各種酶的影響下，不斷發(fā)生降解而形成丙氨酸、異亮氨酸；（2）由于機(jī)體死亡，蛋白質(zhì)合成停止，導(dǎo)致原本存在于血液中的丙氨酸及異亮氨酸等氨基酸無法形成肽鏈、蛋白等；（3）隨著細(xì)胞的裂解，細(xì)胞內(nèi)本身含有的一些氨基酸被釋放出來[29]，這也包括丙氨酸和異亮氨酸。因此，丙氨酸及異亮氨酸的含量在大鼠死后一段時(shí)間內(nèi)會(huì)隨著死亡時(shí)間的延長而逐漸增加。從圖2可以看出，不論是哪種代謝物，環(huán)境溫度為35℃時(shí)，代謝物相對(duì)含量變化幅度較其他溫度組大（各溫度組的溫度差均為10℃），可能是由于當(dāng)環(huán)境溫度接近體溫（或更高）時(shí)，微生物的活動(dòng)更加活躍，有研究[30-31]指出，體內(nèi)某些氨基酸和糖類等物質(zhì)含量會(huì)受到微生物活動(dòng)的明顯影響。

利用5℃模型對(duì)15℃、25℃、35℃預(yù)測組樣本進(jìn)行預(yù)測并對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，5℃模型對(duì)其他溫度預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差與5℃預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且預(yù)測組環(huán)境溫度與模型溫度相差越大，預(yù)測結(jié)果偏差也越大。因此，當(dāng)所需預(yù)測的樣本所處環(huán)境溫度與已建立模型的溫度條件不完全相同時(shí)，可以將其代入與其溫度相近的模型中進(jìn)行預(yù)測，如預(yù)測樣本環(huán)境溫度為10℃、20℃時(shí)，可以嘗試將其分別代入與其溫度相近的5℃組模型以及15℃組模型中進(jìn)行預(yù)測，以提高推斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由于本研究還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，應(yīng)用于實(shí)際工作尚有一定的難度。在未來，應(yīng)當(dāng)收集人血液等組織類樣本建立推斷模型并進(jìn)行預(yù)測，達(dá)到運(yùn)用于實(shí)際的目的。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上設(shè)立了不同的環(huán)境溫度條件，納入了新的研究因素，嘗試模擬實(shí)際情況中不同的環(huán)境溫度。從研究結(jié)果來看，在利用代謝組學(xué)技術(shù)推斷死亡時(shí)間的研究中，進(jìn)行環(huán)境溫度的考察、細(xì)化并建立不同環(huán)境溫度下的推斷模型，有望提高死亡時(shí)間推斷的準(zhǔn)確性。