吳 云，陳 薇，田文慧，楊永晶,2*

1青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院；2青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016

樹莓(RubusidaeusL.)是一類薔薇科植物，進(jìn)一步分類后，屬于懸鉤子屬，從分布情況來看，北半球溫帶分布的樹莓較多[1]。據(jù)研究，樹莓中能夠檢測出多種活性成分，如多糖、氨基酸、酚類等。這些活性成分使得樹莓在抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降糖降脂、抗菌、抗紫外[2]等方面效果突出。樹莓廣泛的生物活性使其在功能性食品開發(fā)、美容美體和藥物研發(fā)等諸多方面均展示出極為廣闊的開發(fā)前景。

多糖是植物重要的生物活性成分[3]，植物多糖也早已成為研究的熱點(diǎn)之一。樹莓果實(shí)中多糖含量較高，是多糖提取的理想原料。關(guān)于樹莓多糖已有一些相關(guān)報(bào)道，主要涉及多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征、藥理活性和應(yīng)用。如Yu[4]從樹莓中分離得到一種新型水溶性多糖RCP-II，其具有良好的抗氧化能力和非酶糖基化抑制活性。本團(tuán)隊(duì)前期在樹莓果肉多糖體內(nèi)抗腫瘤活性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有顯著的免疫增強(qiáng)活性，在荷瘤小鼠模型中表現(xiàn)出良好的抑制黑色素瘤活性，且能明顯增強(qiáng)化療藥物多西他賽的體內(nèi)抗腫瘤效果，有望用作免疫增強(qiáng)劑或化學(xué)治療輔助劑以治療惡性黑色素瘤[5]。此外，Mierczynska[6]用檸檬酸從樹莓中提取到富含果膠的餾分，并發(fā)現(xiàn)該果膠可在食品工業(yè)中作為增稠劑和膠凝劑使用。相信隨著研究的不斷拓展和深入，樹莓多糖也將成為一種極具開發(fā)前景的純天然植物多糖。

研究和優(yōu)化提取工藝對(duì)很多生物活性物質(zhì)的規(guī)模開發(fā)和利用具有重要促進(jìn)作用。本文利用響應(yīng)面法對(duì)樹莓多糖的超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為其規(guī)模化提取提供參考。此外，關(guān)于樹莓多糖的抗疲勞活性研究尚未見報(bào)道。故本文采用小鼠游泳實(shí)驗(yàn)研究樹莓果肉多糖的體內(nèi)抗疲勞作用，并通過測定小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和游泳后肝糖原、血糖、血清尿素氮及肌酸激酶等多項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)一步闡明樹莓果肉多糖的抗疲勞機(jī)理，進(jìn)一步拓展樹莓多糖的活性研究內(nèi)容，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

樹莓冷凍果，購自青海樹莓農(nóng)林產(chǎn)業(yè)化有限公司(青海湟源)；共于甘肅中醫(yī)學(xué)院購買小白鼠80只，體重處于19～21 g之間；糧食酒精、濃硫酸(兩者質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95%和98%)、分析純的苯酚、葡萄糖、氟乙酸(TFA)及氯仿等均采購于青海天順化學(xué)試劑公司；多種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，如木糖、半乳糖等全部在中國藥品生物制品檢定所采購；測試生理生化指標(biāo)的測試盒，于南京建成生物工程中心采購。

1.2 儀器與設(shè)備

高速連續(xù)型超微粉碎機(jī)(CLF-30B，浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、低速臺(tái)式離心機(jī)、紫外-可見分光光度計(jì)、冷凍干燥機(jī)、常溫離心機(jī)(RE-2000A、TDL-50C、UV-759、FD10、TDL-50C，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(DZKW-D-4，河南鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；超聲清洗儀(KQ-100VDB，昆山市超聲儀器有限公司)；傅里葉變換紅外光譜分析儀(Bruker Tensor 27，天津市金貝爾科技有限公司)；凝膠滲透色譜(LC-20AT，島津)；渦旋混合儀(TD-RS-1，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；掃描電鏡(JSM-7500，深圳瑞盛科技有限公司)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975c，Agilent Technology)；超高溫型電熱恒溫干燥箱(202-3，沅澤科技有限公司)；安瓿瓶(如皋市天豐包裝材料廠)；酒精噴燈(北京鑫骉騰達(dá)儀器設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(RT-6000，北京裕天醫(yī)療技術(shù))；冷凍離心機(jī)(4-5R，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)；組織勻漿儀(FSH-2A，金壇市友聯(lián)儀器研究所)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樹莓果肉多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 樹莓果肉多糖的提取

2.1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在105 ℃溫度下對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行干燥，并在保證重量穩(wěn)定后，通過天平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稱量，精準(zhǔn)稱量0.1 g，并轉(zhuǎn)到量杯中，進(jìn)一步采用純水定容到1 L，以此得到濃度為0.1 g/L的葡萄糖溶液，依次吸取該溶液，吸取量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，并分別加入試管，通過加入純水，使最終的體積達(dá)到2 mL。再取出濃度為5%的苯酚，各加入1 mL，再于所有試管中加入濃硫酸，加入量為5 mL，振蕩混合，保證充分混合后于室溫下靜置，時(shí)長30 min，再測定所有試管490 nm波長下的吸光值，取一支空試管，向其中加入2 mL純水，以此得到空白對(duì)照。橫縱坐標(biāo)分別設(shè)置為多糖濃度(C，g/mL)以及吸光值(A)，以此得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)一步明確回歸方程A=1.82C(R2=0.999)。

2.1.1.2 樹莓果肉多糖的提取及含量測定

得到樹莓果粉后，向其中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇(W∶V=1∶4)，再進(jìn)行加熱回流，溫度設(shè)置為60 ℃，以此除去果粉中存在的色素、單糖以及寡糖，重復(fù)2次。稱取揮干乙醇的樹莓果粉0.1 g放于錐形瓶中，之后完成超聲提取，在這個(gè)過程中，保證提取溫度、時(shí)間、功率等參數(shù)的適宜，提取完畢之后進(jìn)行離心，離心速度設(shè)置為3 500 rpm，時(shí)間設(shè)置為15 min，再將得到的上清中含有的蛋白去除，該步驟通過Sevag法來實(shí)現(xiàn)，反復(fù)進(jìn)行3次此項(xiàng)操作。將水溶液置于60 ℃，通過減壓濃縮，從而能夠得到原體積1/4的溶液，再向其中加入4體積95%的糧食酒精，再進(jìn)行沉淀，沉淀溫度為4 ℃，在沉淀24 h之后進(jìn)行離心。后將樹莓果肉多糖沉淀、冷凍、干燥，可獲得淺粉色樹莓果肉多糖粉末，并按如下公式計(jì)算樹莓果肉多糖提取得率：樹莓果肉多糖提取得率=(樹莓果肉多糖含量/樹莓果粉質(zhì)量)×100%。此外，采用硫酸-蒽酮法和考馬斯亮藍(lán)法分別測定樹莓果肉多糖中的多糖含量與蛋白質(zhì)含量。

2.1.2 樹莓果肉多糖提取工藝的優(yōu)化

2.1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

選擇料液比、超聲提取時(shí)間、溫度和超聲功率四項(xiàng)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，當(dāng)其中一項(xiàng)因素改變時(shí)，其它因素恒定，單次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.1.2.2 響應(yīng)面法及數(shù)據(jù)分析方法

通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出明顯影響樹莓果肉多糖提取得率的幾個(gè)主要因素，而后遵循Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以影響較顯著的因子作自變量進(jìn)行組合，并分別以-1、0、+1表示各個(gè)自變量的低、中、高3個(gè)水平。通過運(yùn)用Design expert 8.0軟件完成實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的處理和分析，從而得到如下二次多項(xiàng)式方程。

在該方程中，Y所代表的含義是預(yù)測響應(yīng)值，由此可以明確提取得率；Xi以及Xj所代表的含義是自變量編碼水平(i≠j)；k所代表的是變量個(gè)數(shù)；A0、Ai、Aij所代表的含義分別是常數(shù)項(xiàng)、線性回歸系數(shù)以及二次項(xiàng)回歸系數(shù)。

通過計(jì)算R2能夠明確所得方程的擬合可靠性，若該數(shù)值越趨近于1，則表示可靠性越好；通過進(jìn)行F值檢驗(yàn)，能夠得到兩變量之間的相關(guān)性程度，并且F值與相關(guān)性顯著之間為正比關(guān)系；通過進(jìn)行P值檢驗(yàn)，能夠得到線性效應(yīng)、平方效應(yīng)、交互效應(yīng)的顯著性，并且P值與顯著性之間呈現(xiàn)出反比關(guān)系[7]，P<0.05時(shí)影響顯著，P<0.01時(shí)影響極顯著。

2.2 樹莓果肉多糖結(jié)構(gòu)初步分析

2.2.1 樹莓果肉多糖的紅外光譜分析

取適量光譜級(jí)的溴化鉀粉末，將其加入到樣品中，并將二者完全混合，之后置于紅外光譜儀，進(jìn)而完成測定，掃描范圍設(shè)置在400～4 000 cm-1之間，分辨率設(shè)置為4 cm-1，共進(jìn)行64次掃描。

2.2.2 樹莓果肉多糖表面結(jié)構(gòu)觀察

用真空鍍膜儀在樹莓果肉多糖樣品表面薄薄地鍍一層金，并將樣品放到掃描電鏡下進(jìn)行觀察，以詳細(xì)明確其表面結(jié)構(gòu)，將加速電壓設(shè)置為5 kV，放大倍數(shù)為10 000、5 000、2 000和1 000。

2.2.3 樹莓果肉多糖其單糖組分分析

借助于GC-MS分析，可以對(duì)樣品的單糖組分進(jìn)行明確，具體分析方法參照Yang等[8]的實(shí)驗(yàn)。

2.3 樹莓果肉多糖的抗疲勞作用

2.3.1 動(dòng)物分組及給藥方案

購買后正常喂養(yǎng)小鼠，在1周后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且在喂養(yǎng)期間，應(yīng)保證室溫在22 ℃左右，濕度在45%左右，保證供水和食物充足。1周之后，對(duì)參與實(shí)驗(yàn)的80只小鼠基于平均和隨機(jī)的原則進(jìn)行分組，共分為4組，各小組中包含了20只小鼠，四個(gè)小組有空白對(duì)照組(完全為生理鹽水)以及樹莓果肉多糖高(RPP-H：200 mg/kg)、中(RPP-M：100 mg/kg)、低(RPP-L：50 mg/kg)劑量組，樹莓果肉多糖用生理鹽水配制。所有的小鼠每日接受一次灌胃，并保證每日灌胃的時(shí)間、劑量固定，持續(xù)28天。

2.3.2 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

在灌胃28天之后，即可從所有分組內(nèi)隨機(jī)選取小鼠完成負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，在各小組取10只，通過于小鼠尾部增添鉛皮來完成負(fù)重處理，重量為小鼠體重的5%，保證游泳水溫為25±0.5 ℃。若小鼠沉入水底后時(shí)長不低于9 s，則為游泳終止時(shí)間，以此對(duì)游泳時(shí)長進(jìn)行測定和記錄。

2.3.3 血糖、血清中乳酸、乳酸脫氫酶、尿素氮和肌酸激酶的測定

剩余的40只小鼠在水溫為25±0.5 ℃的水中進(jìn)行游泳，時(shí)長為90 min，再休息1 h之后摘眼球完成血液采集，并將其放于室溫下靜置，時(shí)長為30 min，靜置完畢后離心，3 000 rpm，4 ℃，10 min，從而得到血清樣本。依據(jù)于測試盒中的說明書完成相關(guān)生理生化指標(biāo)的檢測，如乳酸、葡萄糖等。

2.3.4 肝糖原與肌糖原的測定

通過脫頸椎處死血液采集后的小鼠，并在最短時(shí)間內(nèi)分離出肝臟以及股四頭肌。肝臟與肌肉組織稱重后分別在冰浴中用事先預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH7.4、Tris-HCl、EDTA-2Na以及蔗糖的濃度分別為0.01、0.000 1、0.01 mol/L、0.8% NaCl溶液)充分混合之后得到10%勻漿液。再進(jìn)行離心，3 000 rpm，4 ℃，10 min后取上清備用。肝糖原和肌糖原的分析均按照其測試說明書進(jìn)行。

2.3.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 超聲提取溫度對(duì)樹莓果肉多糖提取得率的影響

改變超聲提取溫度，并保證其他參數(shù)的固定，來完成超聲提取溫度與樹莓果肉多糖提取得率相關(guān)性的探究，在進(jìn)行溫度設(shè)置時(shí)，分別在40～80 ℃之間設(shè)置五個(gè)梯度，時(shí)間、功率以及料液比分別為40 min、70 W、1∶20。結(jié)果如圖1所示，樹莓果肉多糖提取得率在40～60 ℃之間隨溫度的升高而增加，在提取溫度60 ℃時(shí)，多糖提取得率最大。之后多糖提取得率隨提取溫度的升高而逐漸下降。因此，將60 ℃設(shè)定為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中超聲提取溫度的中間水平值。

圖1 溫度與樹莓果肉多糖提取得率之間的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between temperature and extraction rate of RPP

3.1.2 超聲功率對(duì)樹莓果肉多糖提取得率的影響

改變超聲功率，并保證其他參數(shù)的固定，來完成超聲功率與樹莓果肉多糖提取得率相關(guān)性的探究，分別設(shè)置六個(gè)超聲功率，分別為50、60、70、80、90以及100 W。時(shí)間、溫度以及料液比分別為40 min、50 ℃、1∶20。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)超聲功率在50～60 W時(shí)，樹莓果肉多糖的提取得率不斷增加，到60 W時(shí)達(dá)到峰值。之后隨超聲功率的加大開始逐漸下降。因此，將60 W設(shè)定為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中超聲提取功率的中間水平值。

圖2 超聲功率與樹莓果肉多糖提取得率的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between ultrasonic power and extraction rate of RPP

3.1.3 超聲提取時(shí)間對(duì)樹莓果肉多糖提取得率的影響

改變提取時(shí)間，并保證其他參數(shù)的固定，來完成提取時(shí)間與樹莓果肉多糖提取得率相關(guān)性的探究，采用五個(gè)提取時(shí)間，即20、40、60、80以及100 min。功率、溫度以及料液比分別為70 W、50 ℃、1∶20。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間在20～60 min時(shí)，提取得率呈現(xiàn)出緩慢升高的趨勢。當(dāng)時(shí)間高于60 min之后，提取得率出現(xiàn)劇烈上升趨勢，并且當(dāng)時(shí)間為80 min時(shí)，提取得率最高，80 min之后，提取得率出現(xiàn)劇烈降低趨勢。因此，將80 min設(shè)定為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中超聲提取時(shí)間的中間水平值。

圖3 提取時(shí)間與樹莓果肉多糖提取得率的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between extraction time and extraction rate of RPP

3.1.4 料液比對(duì)樹莓果肉多糖提取得率的影響

料液比是影響多糖提取得率的重要因素之一，過小的料液比不能充分提取材料中的多糖，過大的料液比則會(huì)造成提取耗時(shí)長、耗能多，成本高等諸多不便。改變料液比，并保證其他參數(shù)的固定，來完成料液比與樹莓果肉多糖提取得率相關(guān)性的探究，采用五個(gè)不同的料液比，即1∶10、1∶15、1∶20、1∶25以及1∶35。時(shí)間、溫度以及功率分別為40 min、50 ℃、70 W。最終測定結(jié)果見下圖4，料液比在1∶10～1∶20之間，則二者為正相關(guān)，而高于1∶20后，提取得率不再有明顯改變。從時(shí)間和能耗方面考慮，最終選擇1∶20作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的恒定料液比。

圖4 料液比與樹莓果肉多糖提取得率的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between material liquid ratio and extraction rate of RPP

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化樹莓果肉多糖提取工藝

3.2.1 Box-Benhnken設(shè)計(jì)因素水平及編碼

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)中所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果，分別將超聲提取溫度、時(shí)間以及功率設(shè)置為三因素，將60 ℃、80 min、60 W設(shè)定為中間水平值、進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，具體因素水平及編碼詳見表1。

表1 Box-Benhnken設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Box benhnken design factor level and coding

3.2.2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

響應(yīng)面詳細(xì)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and the response values

由表3可見，三個(gè)因素的交互項(xiàng)、線性及平方項(xiàng)對(duì)樹莓果肉多糖的提取得率都呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性(P<0.05)，并且是極為明顯的線性關(guān)系。計(jì)算R2的結(jié)果為0.998 9，該數(shù)值在一定程度上說明所構(gòu)建的模型具有較好的擬合度，以此也能夠證實(shí)可以采用該方程來進(jìn)行實(shí)際分析。除此之外，通過計(jì)算F值能夠發(fā)現(xiàn)，可以基于相關(guān)性的顯著程度對(duì)三個(gè)因素進(jìn)行排序，其中提取時(shí)間與提取得率之間的相關(guān)性最為顯著，超聲功率居中，提取溫度相關(guān)性相對(duì)較小。

基于擬合模型，進(jìn)一步得到三維響應(yīng)面圖以及等高線圖，通過兩圖能夠使響應(yīng)面的最高點(diǎn)更加直觀地呈現(xiàn)出來，即極值及三因素的相互作用與響應(yīng)值的相關(guān)性，以此能夠使最佳提取工藝參數(shù)范圍得到明確[9]。圖5顯示出超聲提取功率為58.38 W時(shí)，提取時(shí)間及溫度與提取得率間的相關(guān)性。當(dāng)超聲提取溫度為50～60 ℃時(shí)，樹莓果肉多糖提取得率維持在11.46%以上。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Result of ANOVA analysis

圖5 超聲提取時(shí)間與溫度對(duì)樹莓果肉多糖提取得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time (X2) and temperature (X1) on extraction rate of RPP注：A：3D響應(yīng)面圖；B：等高線圖,下同。Note:A:Response surface plot;B:Contour plot,the same below.

圖6顯示了超聲提取時(shí)間為84.32 min時(shí)不同超聲提取功率和溫度對(duì)樹莓果肉多糖提取得率的影響。由圖可知，在超聲功率設(shè)置為55～60 W之間，溫度設(shè)置為50～65 ℃之間的情況下，樹莓果肉多糖提取得率維持在頂峰水平。

圖7顯示了超聲提取溫度為58.63 ℃時(shí)不同超聲提取功率和時(shí)間對(duì)樹莓果肉多糖提取得率所產(chǎn)生的影響。由圖可見，時(shí)間設(shè)置在80～90 min之間，功率設(shè)置在50～65 W之間，樹莓果肉多糖提取得率達(dá)到最高。

圖6 超聲提取功率與溫度對(duì)樹莓果肉多糖產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power (X3) and temperature (X1) on extraction rate of RPP

圖7 超聲提取功率和時(shí)間對(duì)樹莓果肉多糖提取得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power (X3) and time (X2) on extraction rate of RPP

3.2.3 樹莓果肉多糖最優(yōu)提取工藝的確定

3.3 樹莓果肉多糖的紅外光譜分析

通過進(jìn)行紅外光譜分析后得到光譜圖如下圖8所示，對(duì)該圖進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，3 300～3 500 cm-1范圍內(nèi)得到了O-H的吸收峰，而于2 900～2 940 cm-1范圍內(nèi)得到了C-H吸收峰[10]。1 740 cm-1以及1 600～1 650 cm-1分別為糖醛酸結(jié)構(gòu)和C=O的吸收峰[11]。1 485～1 350 cm-1之間的一系列吸收峰是-CH(O-CH2)結(jié)構(gòu)的變性吸收峰，1 000～1 200 cm-1的范圍內(nèi)得到的是吡喃糖基團(tuán)的吸收峰[12]。850～810 cm-1之間得到C-O-S的吸收峰。350～600 cm-1的吸收峰為吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)[13]。

3.4 樹莓果肉多糖電鏡下的表面結(jié)構(gòu)

圖9為使用掃描電鏡在10 000倍、5 000倍、2 000倍和1 000倍下觀察到的樹莓果肉多糖超微結(jié)構(gòu)。從圖中可以看出，樹莓果肉多糖表面比較粗糙，且分布著大小不一的卵圓形顆粒。該結(jié)果與蟲草多糖在電鏡下的超微結(jié)構(gòu)非常類似，這種卵圓形顆?？赡芘c多糖的分支和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)關(guān)系密切[14]。

圖9 掃描電鏡下觀察到的樹莓果肉多糖表面結(jié)構(gòu)Fig.9 SEM images of RPP

3.5 樹莓果肉多糖的單糖組成

3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)，橫縱坐標(biāo)分別設(shè)置為濃度和衍生產(chǎn)物，再實(shí)現(xiàn)各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸，設(shè)置線性范圍是25～400 μg/mL。最終得到的結(jié)果如下表5。

3.5.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品乙?；苌锏腉C-MS圖譜

乙?；苌a(chǎn)物的分析結(jié)果見下圖10，通過對(duì)該圖進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，分離效果較佳，無明顯雜質(zhì)產(chǎn)生，并進(jìn)一步分析后得到如下表6中的結(jié)果，就目前所采用的多糖衍生方法來看，硅烷化以及乙酰化的應(yīng)用頻率相對(duì)較高。前者的優(yōu)點(diǎn)眾多，如耗時(shí)短、操作簡便等，但是其缺點(diǎn)也是不可忽視的，即多峰以及重疊峰等現(xiàn)象出現(xiàn)可能性較高，使得后續(xù)的分析工作極為困難[8,15]。所以本實(shí)驗(yàn)選取了鹽酸羥胺肟化以及乙酸酐乙酰化衍生法，以此能夠最大可能地減少副衍生物的產(chǎn)生，有效防止多峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，不同類型的單糖對(duì)應(yīng)單一的色譜峰，使得后續(xù)分析能夠順利進(jìn)行[16]。

3.5.3 樹莓果肉多糖的單糖組成分析

通過對(duì)樹莓果肉多糖進(jìn)行乙?；苌?，能夠得到GC-MS圖譜，即圖11所示。基于單糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間以及離子碎片，能夠進(jìn)一步分析得到樹莓果肉多糖中的單糖組成，即半乳糖(含量為40.57 μg/mL)、鼠李糖(32.06 μg/mL)、葡萄糖(127 μg/mL)、木糖(15.13 μg/mL)、甘露糖(19.63 μg/mL)以及阿拉伯糖(298.49 μg/mL)，進(jìn)一步得到摩爾比為2.3∶2.0∶7.1∶1.0∶1.1∶19.9，該圖譜中并未發(fā)現(xiàn)果糖。從該結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，含量較高的有阿拉伯糖以及葡萄糖。這與本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)樹莓多糖的單糖組成研究結(jié)果一致[8]，但Yu[4]、Teng[17]對(duì)單糖結(jié)果的研究結(jié)果中并未檢測到甘露糖，其樹莓果實(shí)樣品產(chǎn)地為哈爾濱，Yang與本實(shí)驗(yàn)的樹莓樣品產(chǎn)地為青海湟源，推測可能是受到樹莓生長地光照與氣候等環(huán)境條件的影響。

表5 7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)Table 5 The standard curve equation and correlation coefficient of seven monosaccharide standards

圖10 7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的乙?；苌颎C-MS圖譜Fig.10 The acetyl derivatives of seven monosaccharide standards

表6 7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間及特征離子Table 6 The retention time and characteristic ion of seven monosaccharide standards

圖11 樹莓果肉多糖水解衍生產(chǎn)物GC-MS色譜圖Fig.11 The acetyl derivatives of RPP

3.6 樹莓果肉多糖對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

通過相關(guān)數(shù)據(jù)整理得到下表7，對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，樹莓果肉多糖與游泳時(shí)間之間有著顯著相關(guān)性，并且所應(yīng)用的濃度越高，小鼠力竭游泳時(shí)間越長。樹莓果肉多糖低劑量組小鼠的平均力竭游泳時(shí)間為647.3±85.4 s，空白對(duì)照組的游泳時(shí)間為477.5±102.1 s，將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，二者差異顯著(P<0.05)；樹莓果肉多糖中、高劑量組小鼠的平均力竭游泳時(shí)間分別為872.9±95.7 s和1 072±111.5 s，與空白組相比較，存在極顯著性差異(P<0.01)。

在持續(xù)高強(qiáng)度勞動(dòng)之后，工作能力呈現(xiàn)出短時(shí)間內(nèi)的降低，這種生理現(xiàn)象即疲勞[18]。力竭游泳時(shí)長可以在一定程度上代表運(yùn)動(dòng)能力。本研究表明，與空白對(duì)照相比，樹莓果肉多糖在50～200 mg/kg的濃度下能顯著提高負(fù)重游泳小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

表7 樹莓果肉多糖對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Table 7 Effect of RPP on loaded-swimming time of mice

3.7 樹莓果肉多糖對(duì)小鼠血糖、肝糖原和肌糖原的影響

如表8所示，樹莓果肉多糖處理過的小鼠運(yùn)動(dòng)后血清葡萄糖濃度比空白對(duì)照組高，且葡萄糖濃度隨樹莓果肉多糖的濃度增加而升高。其中，樹莓果肉多糖低劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后的平均血清葡萄糖濃度為8.85±0.71 mmol/L，空白對(duì)照組的結(jié)果為9.50±0.70 mmol/L，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，差異較??；但樹莓果肉多糖中、高劑量組的小鼠運(yùn)動(dòng)后平均血清葡萄糖濃度分別為10.55±0.70 mmol/L和12.65±0.68 mmol/L，極顯著地高于空白組(P<0.01)。

此外，樹莓果肉多糖也能較好地維持小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原和肌糖原的水平，且兩種糖原的濃度與兩種樹莓果肉多糖的濃度成正比。如表8所示，樹莓果肉多糖低劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后的平均肝糖原的量為6.43±0.31 mg/g，空白對(duì)照組的結(jié)果為6.12±0.39 mg/g，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，差異較小。樹莓果肉多糖中、高劑量組小鼠的運(yùn)動(dòng)后平均肝糖原極顯著地高于空白對(duì)照組(P<0.01)。樹莓果肉多糖低、中和高劑量組與空白對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)后平均肌糖原水平更高，且差異均極其顯著(P<0.01)。

血糖的含量除了可以用來評(píng)估機(jī)體的糖代謝水平，還可以反映出中樞系統(tǒng)的疲勞情況。多數(shù)情況下，機(jī)體處于高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)狀態(tài)時(shí)，依靠糖類物質(zhì)實(shí)現(xiàn)能量的供給，肝糖原和肌糖原水平迅速降低，因此通過明確機(jī)體內(nèi)糖原具體的儲(chǔ)備量，能夠進(jìn)一步得到機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力。所以在運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生的疲勞恢復(fù)時(shí)，糖原的合成以及儲(chǔ)備起著關(guān)鍵作用[19]。在本研究中，樹莓果肉多糖在100～200 mg/kg濃度時(shí)能顯著增加運(yùn)動(dòng)小鼠的血糖濃度和肝糖原含量，在50～200 mg/kg濃度時(shí)能明顯增加運(yùn)動(dòng)小鼠的肌糖原水平。說明樹莓果肉多糖能通過提高小鼠的血糖和糖原水平，為小鼠運(yùn)動(dòng)提供充足的能量，從而有效提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

表8 樹莓果肉多糖對(duì)小鼠血糖、肝糖原和肌糖原的影響Table 8 Effect of RPP on blood glucose,liver glycogen and muscle glycogen of mice

3.8 樹莓果肉多糖對(duì)小鼠血清中乳酸和乳酸脫氫酶活性的影響

由表9可知，樹莓果肉多糖低、中和高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后血清中的平均乳酸含量分別為10.83±0.18、10.30±0.05、9.13±0.23 mmol/L，與空白對(duì)照組的11.74±0.10 mmol/L相比差異極顯著(P<0.01)，且樹莓果肉多糖組小鼠運(yùn)動(dòng)后血清中的平均乳酸含量隨多糖濃度呈負(fù)相關(guān)。相反，樹莓果肉多糖能明顯提高運(yùn)動(dòng)后小鼠血清中乳酸脫氫酶的活性，樹莓果肉多糖中、高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后血清中乳酸脫氫酶的活性分別為37 967.21±15 729.42和97 180.33±2 191.45 U/L，空白對(duì)照組的結(jié)果為4 524.59±2 712.61 U/L，分析兩組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，差異極大(P<0.01)，且小鼠的運(yùn)動(dòng)后血清中乳酸脫氫酶的活性與樹莓果肉多糖濃度呈正相關(guān)。

機(jī)體在進(jìn)行高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，但是借助于乳酸脫氫酶的作用，可以將所產(chǎn)生的乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，從而在一定程度上降低乳酸含量。本研究表明，樹莓果肉多糖在50～200 mg/kg濃度時(shí)能明顯減少運(yùn)動(dòng)小鼠血清中乳酸的產(chǎn)生，同時(shí)，在100～200 mg/kg濃度時(shí)能顯著增加運(yùn)動(dòng)小鼠血清中乳酸脫氫酶的活性。說明樹莓果肉多糖能通過加速乳酸的清除緩解小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞。

表9 樹莓果肉多糖對(duì)小鼠血清中乳酸和乳酸脫氫酶的影響Table 9 Effects of RPP on lactic acid and lactic dehydrogenase in serum of mice

3.9 樹莓果肉多糖對(duì)小鼠血清中尿素氮和肌酸激酶的影響

由表10可見，樹莓果肉多糖處理過的小鼠運(yùn)動(dòng)后血清中的平均尿素氮含量和肌酸激酶活性較空白對(duì)照組都有明顯的下降，且兩者與樹莓果肉多糖的濃度呈負(fù)相關(guān)。樹莓果肉多糖低劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后平均血清尿素氮含量和肌酸激酶活性分別為0.773±0.068 mmol/L和1.393±0.176 U/mL，與對(duì)照相比無顯著性差異。樹莓果肉多糖中、高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)后平均血清尿素氮含量和空白對(duì)照的結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，存在差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)，基于肌酸激酶活性進(jìn)行對(duì)比分析，同血清尿素氮含量的結(jié)果。

血清中含有尿素氮以及肌酸激酶，有研究發(fā)現(xiàn)二者含量能夠顯著影響到運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性，含量越低，則機(jī)體的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性越強(qiáng)[20]。在本研究中，與空白對(duì)照相比，樹莓果肉多糖在100～200 mg/kg濃度時(shí)能顯著降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血清中尿素氮含量和肌酸激酶活性。說明樹莓果肉多糖能通過增強(qiáng)小鼠的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性達(dá)到抗疲勞效果。

表10 樹莓果肉多糖對(duì)小鼠血清中尿素氮和肌酸激酶的影響Table 10 Effects of RPP on urea nitrogen and creatine kinase in serum of mice

以上研究結(jié)果與很多植物多糖抗疲勞的研究結(jié)果相似，如魔芋多糖可以明顯延長游泳時(shí)間，顯示出良好的抗疲勞作用[21]；又如巴戟天多糖能降低NIH小鼠體內(nèi)的尿素氮和乳酸含量，升高肝糖原含量，達(dá)到抗疲勞的效果[22]。

4 結(jié)論

樹莓果肉多糖超聲提取的最佳工藝條件為提取溫度58 ℃、提取時(shí)間84 min、超聲功率58 W、料液比1∶20，其平均提取得率為11.75%。初步結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)樹莓果肉多糖含有半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖以及阿拉伯糖6種單糖類型，阿拉伯糖和葡萄糖含量較高；其具有典型的多糖紅外光譜吸收峰，在電鏡下表面粗糙，呈大小不一的卵圓形顆粒。抗疲勞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樹莓果肉多糖能有效提高游泳小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力和運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性，維持血糖及糖原水平，減少乳酸產(chǎn)生，加速其清除，顯示出較好的抗疲勞活性。下一步我們將進(jìn)一步從細(xì)胞和分子水平揭示其抗疲勞的深層機(jī)理，為樹莓多糖的開發(fā)應(yīng)用夯實(shí)理論基礎(chǔ)。