彭文潘，徐 泳，韓 迪，馮凡超，顧 誠，王志超，周賢梅*，呂 紅

1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029；2太倉市中醫(yī)院呼吸科，太倉 215400

2019年底，中國湖北省發(fā)生了不明原因引起的病毒性肺炎，經(jīng)研究鑒定是由一種新型冠狀病毒所致。隨即世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將該病命名為“2019冠狀病毒疾病[1](coronavirus disease 2019，COVID-19)”；國際病毒分類委員會(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將該病毒命名為“嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型[2](severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，可見它是SARS冠狀病毒的近親[3]。臨床上COVID-19可分為輕型、普通型、重型、危重型[4]。輕型癥狀輕微，普通型主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳等，重者可出現(xiàn)氣促、呼吸困難和靜息狀態(tài)指氧飽和度下降[5]，危重型主要表現(xiàn)為ARDS、膿毒癥以及休克等，甚至危及生命。截至目前，針對COVID-19，仍無特異性治療藥物?？箵粢咔殛P(guān)鍵時期，中醫(yī)藥彰顯了防治COVID-19的優(yōu)勢，并且能夠與西醫(yī)治療互補，提高治療效果。在我國COVID-19確診病例中，中醫(yī)藥使用覆蓋率達91.5%，中醫(yī)藥總有效率達90%以上。

作為指南推薦使用的金花清感顆粒由金銀花、連翹、石膏、蜜麻黃、炒苦杏仁、黃芩、浙貝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷、甘草十二味中藥組成。該方由麻杏石甘湯和銀翹散加減化裁而來，前者是張仲景《傷寒論》用于治療“汗出而喘、無大熱”的經(jīng)典方，組方包含麻黃、苦杏仁、石膏和甘草；后者是吳鞠通《溫病條辨》用于治療“但熱不惡寒而渴者”的經(jīng)典方，組方包含連翹、金銀花、桔梗、薄荷、竹葉、鮮蘆根、甘草、荊芥穗、淡豆豉和牛蒡子。金花清感顆粒十二味中藥組方合理、配伍科學(xué)、寒熱并用，功效為“疏風(fēng)宣肺、清熱解毒”，主治風(fēng)熱感冒或肺熱感冒，以及流感。段璨等人最新臨床研究發(fā)現(xiàn)，在123例COVID-19患者中金花清感顆粒聯(lián)合常規(guī)治療相對單純常規(guī)治療，患者的患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力、咳痰臨床癥狀均有明顯的緩解[6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為多學(xué)科融合而成的新興產(chǎn)物，運用計算機模擬、數(shù)據(jù)分析、多種數(shù)據(jù)庫檢索等方法，通過多重網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索分析闡明藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)及其治療相關(guān)疾病作用機制。英國鄧迪大學(xué)Andrew L.Hopkins教授2007年首次提出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念，從整體角度系統(tǒng)地探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，同年李梢提出基于生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的方劑研究模式與實踐[7]，2013年李梢完善了中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論、方法與應(yīng)用[8]。為藥物作用機制探究提供新的策略和方向，也為多成分、多靶點、多疾病的復(fù)雜中藥作用機制研究提供了新的思路。該方法匯集了系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)以及網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)的知識，從整體角度闡釋了藥物和疾病之間的關(guān)系，這恰好與中醫(yī)的整體觀不謀而合。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討金花清感顆粒中潛在物質(zhì)基礎(chǔ)，及其治療COVID-19的可能作用機制，同時也為COVID-19的治療和金花清感顆粒的深入研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)；中藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/)；Similarity ensemble approach數(shù)據(jù)庫(http://sea.bkslab.org，SEA)；SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)；UniProt數(shù)據(jù)庫(Universal Protein，http://www.uniprot.org/)；生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)；STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)；人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)；GeneCards數(shù)據(jù)庫平臺(http://www.genecards.org)。

1.2 獲取藥物活性成分和潛在靶點

分別以“金銀花”、“石膏”、“麻黃”、“苦杏仁”、“黃芩”、“連翹”、“浙貝母”、“知母”、“牛蒡子”、“青蒿”、“薄荷”、“甘草”為關(guān)鍵詞，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索各中藥的活性成份，借助人體ADME/Tox預(yù)測，整合器官水平的PBPK模型計算活性成分的口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18%作為活性成分的篩選條件。將篩選的化合物導(dǎo)入PubChem獲取對應(yīng)的SMILES文件，并輸入到SEA和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，綜合TCMSP、SEA和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果，獲取上述中藥活性成分對應(yīng)的潛在作用靶點。

圖1 金花清感顆粒所含活性成分信息Fig.1 Information of active ingredients of Jinhua Qinggan Granules

1.3 COVID-19相關(guān)靶點獲取

分別在OMIM和GeneCards Suite數(shù)據(jù)庫中，以“COVID-19”為檢索詞，將兩個數(shù)據(jù)庫結(jié)果合并，去除重復(fù)，獲取COVID-19相關(guān)的潛在靶點。

1.4 獲取疾病和藥物相交靶點

使用R語言(Version3.6.1)VennDiagram數(shù)據(jù)包，將金花清感顆粒潛在作用靶點映射到COVID-19相關(guān)靶點中，并制作韋恩圖。將兩者交集作為金花清感顆粒治療COVID-19的潛在作用靶點。

1.5 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖

通過運行腳本將上述信息生成三個文件，分別是節(jié)點之間的連線網(wǎng)絡(luò)文件、節(jié)點分類文件、1.4中獲得相交靶點對應(yīng)的化合物文件。將上述三個文件導(dǎo)入Cytoscape軟件制作“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，并對其進行拓撲學(xué)分析。

1.6 獲取PPI圖

將1.4中獲得的基因信息輸入到STRING數(shù)據(jù)庫，種屬選擇“Homo sapiens”，獲取“蛋白-蛋白”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，置信度設(shè)置為0.9。并將文件“string_interactions.tsv”導(dǎo)入cytoscape軟件進行拓撲學(xué)分析，通過介值中心度(betweenness centrality)和度值(degree)篩選核心靶點。

1.7 GO和KEGG富集分析

為了對靶基因的功能進行描述和注釋，以及探究其作用的信號通路。通過DAVID數(shù)據(jù)庫將1.5中篩選出來的核心靶點進行GO和KEGG富集分析，選擇物種“Homo sapiens”。GO富集分析包括分析生物學(xué)功能(molecular function，MF)、生物學(xué)過程(biological process，BP)、細胞學(xué)組分(cellular components，CC)三個部。進行KEGG富集分析，篩選出金花清感顆粒治療新冠肺炎的潛在作用信號通路。GO和KEGG富集分析均以校正P值(FDR)<0.05作為篩選條件。

1.8 分子對接

從pubchem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物SDF結(jié)構(gòu)，調(diào)用OpenBabel2.4.1轉(zhuǎn)化為mol2格式，并使用AutodockTools1.5.6打開配體小分子，并加氫、加電荷、檢測配體的root、進行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義，并保存為pdbqt文件。ACE2、Spike protein、Mpro、RdRp蛋白三維結(jié)構(gòu)由2019-nCoV藥物靶標(biāo)結(jié)構(gòu)信息共享平臺提供(http://ncovtarget.qnlm.ac/web/mg/hm)；TMPRSS6蛋白三維結(jié)構(gòu)從RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org)下載獲得，在AutodockTools1.5.6中打開，通過添加氫原子、計算Gasteiger電荷、合并非極性氫后，將其定義為受體并保存成pdbqt文件。采用Autodock vina 1.1.2進行半柔性對接，選取affinity最佳構(gòu)象，作為最終的對接構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 金花清感顆?；钚猿煞趾蜐撛诎悬c

通過TCMSP檢索金銀花、石膏、麻黃、苦杏仁、黃芩、連翹、浙貝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷、甘草中符合條件化合物共有227個。其中23個來自金銀花，23個來自麻黃，19個來自苦杏仁，36個來自黃芩，23個來自連翹，7個來自浙貝母，15個來自知母，8個來自牛蒡子，22個來自青蒿，10個來自薄荷，92個來自甘草；通過PubChem獲得石膏的活性成分1個(圖1)。26個化合物所分布的藥物不止一種，如山奈酚分布于牛蒡子、麻黃、知母、金銀花、青蒿、連翹、甘草7味中藥中，豆甾醇分布于苦杏仁、黃芩、麻黃、青蒿、知母、金銀花6味中藥中，β-谷甾醇分布于牛蒡子、黃芩、麻黃、金銀花、連翹、浙貝母6味中藥中(表1)。12味中藥共獲得720個潛在靶點。

表1 重復(fù)化合物信息Table 1 Information of duplicate compound

2.2 金花清感顆粒新冠肺炎相交靶點

共獲得疾病相關(guān)靶點253個，其中Genecard數(shù)據(jù)庫251個，OMIM數(shù)據(jù)庫2個。將疾病相關(guān)靶點映射到藥物潛在靶點中，共獲得79個公共靶點(圖2)，靶點詳細信息見表2。

2.3 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)中可見共250個節(jié)點，包括活性成份169個、靶點79個、疾病和藥物節(jié)點各一個；共974條相互作用的線。網(wǎng)絡(luò)密度為0.031，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為2.314。對網(wǎng)絡(luò)圖進行拓撲學(xué)分析，其中節(jié)點連線的多少代表節(jié)點度值的高低，介值中心度大小代表節(jié)點在治療該疾病的核心度，兩者是描述節(jié)點的重要指標(biāo)。在活性成分節(jié)點中介值中心度和度值均大于均值的有27個；在靶點的節(jié)點中介值中心度和度值均大于均值的有4個節(jié)點(表3)。

圖2 藥物和疾病靶點交集Fig.2 The intersection of drug and disease targets

表2 共有靶點信息Table 2 The information of shared targets

續(xù)表2(Continued Tab.2)

圖3 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 "Ingredient-Target" network diagram注：粉紅色節(jié)點為活性成分;藍色節(jié)點為靶點。Note:The pink node represents the active ingredient;The blue node represents the target.

表3 網(wǎng)絡(luò)圖中核心節(jié)點Table 3 Core nodes in the network diagram

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.4 PPI圖

將79個靶點信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進行分析，物種選擇“Homo sapiens”，最低置信度設(shè)置為0.9，共保留了74個節(jié)點。將生成的文件“string_interactions.tsv”導(dǎo)入cytoscape軟件生成PPI圖，通過拓撲學(xué)分析篩選出節(jié)點度值和介值中心度大于均值的靶點，并將篩選出的18個核心靶點用作后續(xù)的富集分析(圖4)。

圖4 PPI圖節(jié)點拓撲篩選過程Fig.4 Topology selection process of target node注：A：74個節(jié)點，333條連接線；B：18個節(jié)點，84條連接線。Note:A:74 nodes,333 connecting lines;B:18 nodes,84 connecting lines.

2.5 GO和KEGG富集分析

將2.4中獲取的核心靶點信息輸入DAVID分析平臺，物種選擇“Homo sapiens”，進行在線GO和KEGG富集分析。GO富集分析共獲得936個條目，F(xiàn)DR小于0.05的共有274個條目；其中BP共260條，CC共5條，MF共9條(圖5，圖中BP取FDR最小的前20條)。涉及細胞增殖、凋亡和程序性死亡的調(diào)控、以及免疫應(yīng)答和白細胞分化。KEGG富集分析中，F(xiàn)DR小于0.05的共有35個條目(圖6)。其中的Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、T細胞受體信號通路和病毒感染關(guān)系密切，而FDR最小的是Toll樣受體信號通路(圖7)。

2.6 分子對接

篩選“2.3”中度值排名前10的化合物分別與SARS-CoV-2關(guān)鍵蛋白進行分子對接驗證，由圖8可知，與Mpro對接效能最高的化合物是quercetin(MOL000098)，效能值為-7.4 kcal/mol；與ACE2和RdRp蛋白結(jié)合效能最高的均是arctiin(MOL000522)，效能值分別為-9.6 kcal/mol和-9.7kcal/mol；與Spike蛋白結(jié)合效能最高的化合物是luteolin(MOL000006)，效能值為-6.7 kcal/mol；與TMPRSS6蛋白結(jié)合效能最高的是beta-sitosterol，效能值為-7.2 kcal/mol。圖9列出了上述結(jié)合模式圖。

圖5 GO富集分析結(jié)果Fig.5 The results of GO enrichment analysis

圖6 KEGG富集分析結(jié)果Fig.6 The results of KEGG enrichment analysis

3 討論

國際權(quán)威醫(yī)學(xué)期刊《內(nèi)科學(xué)年鑒》曾刊登了由王辰院士領(lǐng)銜、11家醫(yī)院共同完成的關(guān)于奧司他韋和傳統(tǒng)中藥湯劑金花清感顆粒治療甲型H1N1流感的多中心臨床研究[9]。證實金花清感顆?？梢钥s短流感病毒引起的發(fā)熱時間和改善癥狀，從高級別的循證醫(yī)學(xué)層面證實了該方的有效性，并獲得中藥抗甲流國家科技進步一等獎。與甲流同屬流感病毒的SARS-CoV-2引起的COVID-19，其典型臨床表現(xiàn)主要以發(fā)熱、乏力、干咳為主，少數(shù)伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉，重癥患者多在一周以后出現(xiàn)呼吸困難和低氧血癥，甚至危及生命。目前，針對COVID-19尚無有效治療藥物，COVID-19屬于中醫(yī)瘟疫病范疇，中醫(yī)治療瘟疫病不是單純與病毒對抗，而是注重驅(qū)邪與扶正并重，攻補兼施，使邪有出路，正氣得復(fù)。

通過對金花清感顆粒治療COVID-19的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可知，該方的核心化合物是甘草查爾酮A、芒柄花黃素、蘆薈大黃素、薯蕷皂苷元、荷包牡丹堿、紫杉堿、柚皮苷、木蝴蝶素A、黃芩甙、漢黃芩素、金合歡素、異鼠李素、槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇和β-胡蘿卜素，這17個化合物中53%同時存在2味或者多味中藥中。在KEGG富集分析結(jié)果中，Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、T細胞受體信號通路和病毒感染以及感染后的免疫關(guān)系密切。巨噬細胞對微生物的識別是由細胞膜表面的受體介導(dǎo)的，被稱為模式識別受體(PRR)，包括各種類型的Toll樣受體(TLR)[10]。病毒感染后，TLR募集下游銜接子分子，激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)[11]，上調(diào)了基因轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生促炎分子。在炎癥反應(yīng)中，花生四烯酸可通過PTGS2途徑代謝為前列腺素(PG)[12]。PG在炎癥過程中可使血管擴張、血管通透性升高而導(dǎo)致組織器官水腫；促進微靜脈、毛細血管釋放淋巴因子；另外PG還具有致熱作用，這也是大部分感染性疾病出現(xiàn)發(fā)熱的原因，故金花清感顆粒能夠縮短發(fā)熱時間可能是通過PTGS2起作用的。研究表明，PTGS2與各種炎性毛細血管后微靜脈的通透性、白細胞的趨化作用、T淋巴細胞產(chǎn)生及疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[13]。NOD樣受體(NLR)家族成員NLRC5在各種類型的感染中調(diào)節(jié)主要組織相容性復(fù)合體I類(MHC-1)，Christopher R Lupfer在動物實驗發(fā)現(xiàn)NLRC5在抑制流感病毒復(fù)制，促進病毒清除方面起到了重要作用[14]。同時有學(xué)者發(fā)現(xiàn)小鼠中NLRP5，ASC或Caspase-1的遺傳缺陷會導(dǎo)致支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清中IL-1β和IL-18的濃度降低，減少白細胞向肺部的浸潤并增加病毒滴度[15]。早在2017年已有研究表明，山奈酚通過滅活TLR-髓樣分化因子88(MyD88)介導(dǎo)的NF-κB和MAPK信號通路消除H9N2豬流感病毒引起的急性肺損傷[16]，其中明確指出，山奈酚顯著抑制TLR4、MyD88、IκBα和核因子-κB(NF-κB)p65亞基的磷酸化、MAPK的結(jié)合活性和磷酸化水平，綜上可知，金花清感顆粒通過多途徑多靶點的方式達到抗COVID-19目的，這與中醫(yī)的整體觀不謀而合。

圖7 Toll樣受體信號通路Fig.7 Toll-like receptor signaling pathway注：圖中紅色節(jié)點為金花清感顆粒的潛在作用靶點。Note:The red nodes in the figure indicate the potential targets of Jinhua Qinggan Granules.

圖8 分子對接效能熱圖Fig.8 The heat map of molecular docking efficiency

圖9 與病毒關(guān)鍵蛋白對接效能最高的模式圖Fig.9 Pattern of the most efficient docking with the key protein of the virus

Spike蛋白含有兩個亞基S1和S2，其中S1主要包含有受體結(jié)合區(qū)(RBD)，負責(zé)識別細胞的受體，使讓病毒與細胞相連[17]。Stefan P?hlmann教授研究發(fā)現(xiàn)在COVID-19中ACE2可以促進SARS-CoV-2進入宿主細胞[18]，同時細胞絲氨酸蛋白酶TMPRSS2和內(nèi)體組織蛋白酶CatB/L能夠協(xié)同激活SARS-2-S入侵細胞，而蛋白酶TMPRSS2的作用更為關(guān)鍵。RdRp(也稱為nsp12)能夠催化病毒RNA的合成，是冠狀病毒復(fù)制/轉(zhuǎn)錄機制的關(guān)鍵組成部分，以RNA聚合酶為核心，病毒會利用其它輔助因子(如nsp7、nsp8等)進行自我復(fù)制[19]。Mpro是一種高度保守的、在冠狀病毒復(fù)制過程中必不可少的蛋白酶，是開發(fā)廣譜抗病毒藥物的一個有希望的靶點[20]。上述五個關(guān)鍵蛋白涉及了病毒與靶細胞的結(jié)合、侵入靶細胞、病毒RNA的復(fù)制和病毒封裝，通過分子對接的驗證，發(fā)現(xiàn)金花清感顆粒對SARS-CoV-2從感染到致病的所有關(guān)鍵環(huán)節(jié)靶點都有較高的結(jié)合能，從側(cè)面印證了該方的有效性。

COVID-19疫情給全球的經(jīng)濟帶來了一定的影響，也給全世界的疫情防控工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)和壓力。在醫(yī)務(wù)工作者的共同努力下，我國疫情已得到明顯控制。目前，研發(fā)可用于抗COVID-19藥物已經(jīng)成為廣大醫(yī)藥科研工作者的重要任務(wù)。國內(nèi)外多家科研機構(gòu)開展藥物研發(fā)主要分為兩個方向。第一，疫苗研發(fā)；第二，特效藥物，主要為中和抗體的研發(fā)。雖已有近百項與COVID-19相關(guān)的臨床試驗在國家臨床試驗注冊中心注冊，但截至目前，仍未有特效治療藥物，同時疫苗的研發(fā)又有其滯后性。因此本研究將重點轉(zhuǎn)向指南推薦使用且已被列為非處方藥的金華清感顆粒，在王辰院士研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對金花清感顆粒治療COVID-19的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)金花清感顆粒主要通過Toll樣受體信號通路等，作用于PTGS2、TNF-α、NF-κB、IL-6和CASP8等多途徑，多靶點的方式發(fā)揮抗COVID-19作用，為金花清感顆粒的深入研究和防治COVID-19的藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。

中醫(yī)藥對于COVID-19的治療起到了重要作用，在湖北確診病例救治中，傳統(tǒng)中醫(yī)藥參與度在70%以上，全國其他地區(qū)更是高達90%以上。本研究主要是通過查閱已有藥材成分從而進行相關(guān)分析，并篩選出了差異性最大的幾條信號通路。但是本研究僅通過現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和相關(guān)軟件篩選金花清感顆粒的有效成分和靶點，未考慮藥物產(chǎn)地、炮制、中藥劑量等因素，故本研究存在一定的局限性，本研究的結(jié)果尚待進一步基礎(chǔ)實驗驗證。