何貝橋，張園園，莊遠(yuǎn)杯，魏愛(ài)紅，李榕娣，張聲源2,*

1北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100049；2廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院客家藥用生物資源研究所，梅州 514031

非胰島素依賴型(2型，T2DM)糖尿病患者占90%以上，由于胰島素分泌和(或)胰島素作用缺陷以及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝紊亂，常出現(xiàn)餐后血糖持續(xù)升高癥狀[1]。持續(xù)性高血糖是引起腎病、心血管疾病等并發(fā)癥的主要原因，有效控制餐后高血糖是預(yù)防糖尿病、減少并發(fā)癥以及降低死亡率的重要措施之一[2,3]。α-葡萄糖苷酶是引起餐后血糖升高的主要酶之一，抑制α-葡萄糖苷酶活性已成為控制餐后高血糖的主要治療策略[4]。微生物來(lái)源的阿卡波糖、伏格列波糖為臨床降低餐后血糖的首選藥物，但其制備工藝繁瑣成本高，合成研究進(jìn)展緩慢，且長(zhǎng)期服藥會(huì)引發(fā)腸胃脹氣、腹部不適等不良反應(yīng)[5]。因此，開(kāi)發(fā)藥效好毒副作用低的新型天然α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為研究熱點(diǎn)[6-8]。

葫蘆茶為豆科葫蘆茶屬植物葫蘆茶Tadehagitriquetrum(L.)Ohashi 的全草，別名牛蟲(chóng)草、百勞舌、咸魚(yú)草等，主要分布于廣東、廣西、海南等地區(qū)[9]。葫蘆茶始載于《生草藥性備要》，味苦、澀，性涼，具有清熱解毒，消痰散瘀，消積殺蟲(chóng)等功效，臨床上主要用于急性扁桃體炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、小兒疳積等疾病[10,11]。現(xiàn)代研究表明，葫蘆茶具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用，富含黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、萜類(lèi)成分[12]。葫蘆茶在梅州客家地區(qū)資源豐富，民間藥用歷史悠久，但一直未得到深入研究與開(kāi)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)首次評(píng)價(jià)了葫蘆茶各溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并運(yùn)用酶動(dòng)力學(xué)探討了正丁醇萃取物對(duì)酶的抑制機(jī)制，為進(jìn)一步綜合利用葫蘆茶資源提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

葫蘆茶于2016年8月采自廣東省陰那山自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系聶華副教授鑒定為豆科葫蘆茶屬植物葫蘆茶Tadehagitriquetrum(L.) Ohashi全草，標(biāo)本存放于嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院客家藥用生物資源研究所(編號(hào)：20160866)。

1.2 試劑

對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(上海源葉科技有限公司，批號(hào)MZ1M7E15108，pNPG)；阿卡波糖(拜耳公司，德國(guó)，批號(hào) BJ31578)；α-葡萄糖苷酶(Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：1002515，EC 3.2.1.2，面包酵母，活性≥10 U/mg) ；甲醇和乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司，美國(guó))；無(wú)水碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等均為分析純。

1.3 儀器

Waters Alliance 2695 型高效液相色譜儀(Waters公司，美國(guó))；XBridge Peptide BEH C18色譜柱(Waters公司，美國(guó)，250 mm × 4.6 mm，5 μm)；PHSJ-3F型pH計(jì)(上海精科儀器有限公司)；BT125D型電子分析天平(Sartorius公司，德國(guó))。

1.4 動(dòng)物

健康昆明種小鼠80只(♂)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002，體質(zhì)量18～22 g。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)于濕度45%～75%、室溫25 ℃的動(dòng)物室內(nèi)，飼養(yǎng)期間自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究得到嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，做到減輕小鼠痛苦，增加其舒適度[13]。

2 方法

2.1 葫蘆茶不同提取物樣品的制備

干燥葫蘆茶藥材5.0 kg，粉碎，用3倍量95%乙醇超聲提取4次，合并提取液，減壓濃縮得到95%乙醇浸膏226.4 g，加適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚提取物0.1 g、乙酸乙酯提取物16.6 g、正丁醇提取物102.2 g和水提取物107.2 g。將各提取物放置于4 ℃冷藏，備用。使用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.067 mol/L、pH6.8)溶解樣品并制備成不同質(zhì)量濃度的溶液(質(zhì)量濃度均以提取物計(jì))。

2.2 小鼠小腸黏膜α-葡萄糖苷酶的提取

此部分方法參照本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道方法[13]。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

將樣品(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物)分別配制成不同質(zhì)量濃度的樣品液，其中石油醚提取物為100、200、300、400、500、600 μg/mL，乙酸乙酯提取物為100、150、250、350、450、500 μg/mL，正丁醇提取物為5、10、15、20、25、30 μg/mL，水提取物為10、20、30、40、50、60 μg/mL。陽(yáng)性對(duì)照品阿卡波糖制備成質(zhì)量濃度分別為100、150、200、250、500、1 000、2 000、3 000、4 000 μg/mL[13]。參考文獻(xiàn)[13,14]方法并作適當(dāng)調(diào)整，采用基于HPLC的pNPG體外評(píng)價(jià)模型進(jìn)行檢測(cè)，具體如下：先將0.067 mol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液500 μL、待測(cè)樣品100 μL和0.1 U/mLα-葡萄糖苷酶(酵母來(lái)源和小鼠小腸來(lái)源)600 μL振蕩混勻，37 ℃恒溫孵育20 min，再加入4.0 mmol/L pNPG 400 μL，振蕩混勻，37 ℃恒溫反應(yīng)30 min后，最后加入200 mmol/L Na2CO3溶液1 600 μL終止反應(yīng)。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，通過(guò)HPLC檢測(cè)對(duì)硝基苯酚(pNP)的變化，確定α-葡萄糖苷酶的活性。色譜條件[13]：色譜柱為XBridge Peptide BEH C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B含0.1%甲酸的水溶液。梯度洗脫條件為：0～8 min，20%→30% A；8～13 min，30%→80% A；13～15 min，80%→20% A；15～25 min，20% A。流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為315 nm。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，抑制率計(jì)算公式[13]如下：

抑制率=[1-(A樣品-A樣品對(duì)照)/A陰性]×100%

式中，A陰性指在相同條件下以等體積磷酸鹽緩沖溶液(PBS)代替樣品測(cè)得的pNP峰面積，A樣品對(duì)照指在相同條件下以等體積PBS代替α-葡萄糖苷酶測(cè)得的pNP峰面積。

葫蘆茶不同溶劑提取物和阿卡波糖對(duì)酵母來(lái)源、小鼠小腸來(lái)源α-葡萄糖苷酶抑制活性的結(jié)果見(jiàn)圖1～3和表1。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)研究

因葫蘆茶正丁醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的能力最強(qiáng)，本研究選用葫蘆茶正丁醇提取物探究α-葡萄糖苷酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)。參考文獻(xiàn)[13,15]并做適當(dāng)調(diào)整，具體方法如下：固定pNPG濃度為2.5 mmol/L，在葫蘆茶正丁醇提取物質(zhì)量濃度為0、20、30、40 μg/mL的條件下，測(cè)定不同α-葡萄糖苷酶濃度(0.1、0.15、0.2、0.25 U/mL)時(shí)的酶促反應(yīng)初速度作圖。橫坐標(biāo)表示酶濃度(U/mL)，縱坐標(biāo)表示反應(yīng)初速度(μmol/L·min)，并利用圖的特征推斷酶的結(jié)合方式。再將pNPG濃度分別稀釋成0.125、0.25、0.5、1 mmol/L，固定α-葡萄糖苷酶濃度為0.2 U/mL，依次測(cè)定正丁醇提取物(質(zhì)量濃度為0、20、40 μg/mL，以乙醇提取物計(jì))的反應(yīng)速率。以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)(1/S)為橫坐標(biāo)和反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk曲線，經(jīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Vmax、Km)來(lái)推斷其抑制類(lèi)型。葫蘆茶正丁醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 α-葡萄糖苷酶的抑制活性

圖1和表1結(jié)果顯示，阿卡波糖對(duì)酵母來(lái)源、小鼠小腸來(lái)源α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，并呈量效關(guān)系，其IC50分別為5 012.62±18.49、3217.17±7.27 μg/mL。葫蘆茶各溶劑提取物抑制酵母來(lái)源、小鼠小腸來(lái)源α-葡萄糖苷酶的效果均顯著優(yōu)于阿卡波糖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。葫蘆茶各提取物對(duì)酵母來(lái)源α-葡萄糖苷酶的抑制活性強(qiáng)弱為正丁醇提取物(IC50= 13.08±1.23 μg/mL)>水提取物(IC50= 33.73±2.21 μg/mL)>乙酸乙酯提取物(IC50= 237.37±3.24 μg/mL)>石油醚提取物(IC50= 253.53±3.42 μg/mL)；對(duì)小鼠小腸來(lái)源酶的抑制活性強(qiáng)弱則為正丁醇提取物(IC50= 221.21±3.75 μg/mL)>水提取物(IC50= 291.91±2.49 μg/mL)>乙酸乙酯提取物(IC50= 352.52±4.78 μg/mL)>石油醚提取物(IC50= 539.39±3.34 μg/mL)(圖2、圖3)。葫蘆茶各提取物對(duì)酵母來(lái)源、小鼠小腸來(lái)源α-葡萄糖苷酶抑制活性強(qiáng)弱一致，且與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相比均具有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.1 α-Glucosidase inhibitory activity of acarbose

圖2 葫蘆茶不同溶劑提取物對(duì)酵母 源α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.2 Yeast α-glucosidase inhibitory activity of extracts from different solvents of T.triquetrum

圖3 葫蘆茶不同溶劑提取物對(duì)小鼠小腸 來(lái)源α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.3 Mice intestine α-glucosidase inhibitory activity of extracts from different solvents of T.triquetrum

3.2 葫蘆茶正丁醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制

結(jié)果顯示，葫蘆茶正丁醇提取物(20、30、40 μg/mL)的酶濃度-反應(yīng)初速率圖是一組近似通過(guò)原點(diǎn)的直線，且直線斜率低于未加提取物的直線斜率，由此可推斷正丁醇提取物與α-葡萄糖苷酶和(或)酶底物復(fù)合物進(jìn)行可逆性結(jié)合(圖4)。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖為一組相交于縱軸一點(diǎn)的線，Km(0.90、2.41、5.80 mmol/L)隨著葫蘆茶正丁醇提取物質(zhì)量濃度(0、20、40 μg/mL)增大而增大，但Vmax(0.028 1 mmol/L/min)保持不變，表明正丁醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制(圖5)。

表1 葫蘆茶提取物和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用IC50值比較Table 1 Comparison of extracts and acarbose IC50 values of inhibition on α-glucosidase

圖4 酶濃度-反應(yīng)初速率圖Fig.4 Picture of enzyme concentration-initial velocity

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用基于HPLC的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性評(píng)價(jià)模型比較葫蘆茶不同溶劑提取物對(duì)小鼠小腸來(lái)源、酵母來(lái)源α-葡萄糖苷酶抑制活性的差異，綜合篩選有效活性提取物并確定其抑制類(lèi)型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葫蘆茶各溶劑提取物對(duì)酵母來(lái)源、小鼠小腸來(lái)源的α-葡萄糖苷酶均有不同程度的抑制活性且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖(P<0.05)。從整體上看，各提取物對(duì)兩種來(lái)源的α-葡萄糖苷酶抑制作用強(qiáng)弱趨勢(shì)相同，但抑制酵母來(lái)源酶的活性明顯強(qiáng)于小鼠小腸來(lái)源，可能與小鼠小腸來(lái)源的α-葡萄糖苷酶包含蔗糖酶、麥芽糖酶、海藻糖酶和異麥芽糖酶等有關(guān)[16,17]。同時(shí)，葫蘆茶各溶劑提取物中，正丁醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的能力明顯優(yōu)于葫蘆茶其他提取物(P<0.05)，結(jié)果提示葫蘆茶中抑制α-葡萄糖苷酶的藥效物質(zhì)主要集中在大極性部位，可能與該部位富含黃酮類(lèi)、酚類(lèi)等極性較大的化學(xué)成分有關(guān)[12]。此外，經(jīng)葫蘆茶正丁醇提取物的酶促動(dòng)力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其能有效地競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶，研究結(jié)果將有利于明確葫蘆茶提取物的具體降糖機(jī)理。

圖5 葫蘆茶正丁醇提取物的Linweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.5 Lineweaver -Burk plot of n-butanol extract from T.triquetrum

本研究證實(shí)葫蘆茶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶有良好的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，是天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑資源，后續(xù)應(yīng)深入開(kāi)展葫蘆茶特別是極性較大的提取物化學(xué)成分研究，并進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)驗(yàn)證，有望從中發(fā)現(xiàn)高效、新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑。