陳 洋 邱海源 朱曉穎 馬 沖 戴世堯

（廣東省惠州市職業(yè)病防治院 廣東惠州 516001）

1 前言

阻斷微核法（CB 微核法）是在細胞進入第一次有絲分裂前，向培養(yǎng)液中加入能阻斷胞質分裂但不影響細胞核分裂的胞質分裂劑—松胞素-B（Cyt-B）的方法，Cyt-B 可以使細胞有絲分裂為特殊形態(tài)的雙核細胞，未發(fā)生細胞核分裂的細胞則會維持單核細胞形態(tài)。

通過檢測致突變因素作用后的雙核細胞的微核細胞率和雙核細胞微核率，可同時獲得致突變因素對細胞的遺傳毒性損害和對細胞周期的影響[1-6]。 本文分析了CB 微核法試驗在全自動微核掃描分析系統(tǒng)上的應用。

2 材料與方法

2.1 對象

近期無明顯用于診斷和治療的醫(yī)療照射史和化學接觸史，不吸煙25 歲健康男性志愿者5 名。

2.2 材料與設備

材料：注射用環(huán)磷酰胺：用規(guī)格為0.2 g 的生理鹽水配成20 mg/mL，置于冰箱4℃保存；Cyt-B：先溶于二甲基亞砜（DMSO）中，于-20℃保存，用前融化，用生理鹽水稀釋成300 μg/mL；固定液：甲醇∶乙酸=3∶1。

設備：RPMI 1640 培養(yǎng)基；MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)；AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)；生物顯微鏡。

2.3 CB 法微核試驗樣本的制備

取0.5 mL 靜脈血中加入4 mL 經(jīng)不同濃度環(huán)磷酰胺處理過的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，混勻，37℃恒溫培養(yǎng)40 h 加300 μg/mL Cyt-B，終濃度為6 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)至70 h 后終止培養(yǎng)。將培養(yǎng)基倒入15 mL 尖底離心管中，1 200 r/min 離心7 min，吸去上清液加入4 mL 0.075 mol/L 氯化鉀低滲溶液，混勻靜置1 min后加入1 mL 固定液，1 200 r/min 離心7 min，去上清液后加入固定液8 mL，混勻靜置20 min，1 200 r/min離心7 min，去上清液后再次加入5 mL 固定液固定20 min，1 200 r/min 離心7 min，去上清液，余下0.5 mL混勻制成細胞懸液，滴片，氣干，Giemsa 染色。 觀察到的細胞大部分即為處于第一次有絲分裂時期的雙核淋巴細胞。

2.4 常規(guī)培養(yǎng)法微核試驗的樣本制備

取0.5 mL 靜脈血中加入4 mL 經(jīng)不同濃度環(huán)磷酰胺處理過的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，混勻，37℃恒溫培養(yǎng)72 h 后終止培養(yǎng)。將培養(yǎng)基倒入15 mL 尖底離心管中，1 200 r/min 離心7 min，吸去上清液加入4mL 0.075 mol/L 氯化鉀低滲溶液， 混勻靜置1 min 后加入1 mL 固定液，1 200 r/min 離心7 min， 去上清液后加入固定液8 mL， 混勻靜置20 min，1 200 r/min 離心7 min，去上清液后再次加入5 mL 固定液固定20 min，1 200 r/min 離心7 min，去上清液，余下0.5 mL混勻制成細胞懸液，滴片，氣干，Giemsa 與瑞氏染液2∶1 比例混合，染色。

3 結果

樣本經(jīng)AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems圖像分析系統(tǒng)掃描后，分析雙核細胞數(shù)和疑似陽性雙核細胞，檢測人員根據(jù)識別標準去除假陽性雙核細胞，并在陽性雙核細胞中識別微核的數(shù)量做好記錄。樣本經(jīng)由檢測人員顯微鏡鏡下盲法閱片，只觀察雙核細胞，識別其中的陽性雙核細胞數(shù)及微核個數(shù)并做好記錄。 雙核細胞的識別標準：（1）雙核細胞具有2 個獨立且核膜完整的細胞核，若細胞壞死、凋亡或細胞中為單核、3 或3 以上個多核均應舍棄。（2）同一細胞中的雙核大小接近、色度深淺相同。 （3）如果雙核之間有1 個或多個核質橋連接，橋寬不應寬于其核直徑的1/4。 （4）理想的雙核邊界可以相連，但不應該交疊，若交疊必須能識別各自的界限。（5）1 個雙核細胞胞質與臨近細胞的胞質之間的界限要清楚。微核的識別標準：（1）微核存在于完整的胞漿中，為圓形或橢圓形，邊緣光滑。 （2）直徑小于主核直徑的1/3。（3）微核沒有折光性。（4）微核與主核完全分開，若有相交或相切則應該看到各自的核膜。 （5）微核的結構與主核相同，嗜色性與主核一致或略淺[7，8]。其中以成熟的檢測人員人工盲法閱片得到的微核細胞率及微核率的數(shù)據(jù)作為近似真實值，計算誤差，允許誤差為20%。 對于得到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，因細胞遺傳學中微核細胞率符合二項分布，當n 逐漸增大時二項分布就漸漸接近于正態(tài)分布。 微核率符合泊松分布，x 逐漸增大的時，泊松分布逐漸接近于正態(tài)分布[9-11]，詳見表1。

表1 CB 微核法試驗自動識別與人工盲法閱片結果

4 討論

本試驗中，將CB 法微核試驗應用在自動分析系統(tǒng)上，通過自動分析系統(tǒng)掃描樣片獲得圖像，復核結果快速準確，解決了檢測人員用眼過度，實驗室差異以及操作人員個人識別的差異問題。 應用AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)掃描樣片，對收獲細胞后的制片過程要求比較高，為確保制片背景的清晰，固定液選擇甲醇與乙酸，比例為3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配。制備的細胞懸液濃度不要太高，滴片時每張玻片上細胞數(shù)目不能過多，細胞間要分散良好，彼此不能重疊。 染液著色要盡可能淺，這樣掃描的圖片才有層次感，易于觀察及識別微核。 從CB法微核試驗的自動化檢測中可以發(fā)現(xiàn)，相比微核試驗的常規(guī)培養(yǎng)法及直接涂片法，對照組（即培養(yǎng)基中無添加環(huán)磷酰胺）觀察到的微核細胞率及微核率明顯高于兩者的其他實驗室正常值范圍[13]。 AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)與人工盲法閱片觀察到的微核細胞率及微核率的比較結果說明，人工盲法閱片觀察到的微核細胞率及微核率略高于AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)上最后得出的數(shù)據(jù)，分析可能存在的原因是雙核細胞中的微核與主核相疊加或相切時，AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)是無法捕捉到的。雙核細胞的判斷上也存在誤差，在觀察的過程中發(fā)現(xiàn)AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)對于出現(xiàn)核質橋情況的判斷并不準確。 本實驗室對于觀察到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，檢測出的各組微核細胞率符合二項分布，微核率符合泊松分布。

CB 微核法試驗因為是選擇處于第一個細胞周期的雙核細胞，所以能夠盡可能的捕捉到產(chǎn)生的微核，因而更接近損傷的真實情況，所以CB 微核法試驗的準確性是優(yōu)于其他方法的微核試驗的。