王耀華 劉家棟 王梓諾 莊 潔 唐毓萍 黃天懌 趙 毅

（華熙生物科技股份有限公司上海研發(fā)中心 上海 200120）

1 前言

透明質(zhì)酸是由葡萄糖醛酸和氨基葡糖雙糖重復(fù)單位組成的多糖。透明質(zhì)酸鋅是透明質(zhì)酸的鋅鹽，通過鋅離子與透明質(zhì)酸鈉羧基上的鈉離子進(jìn)行離子交換制得[1]。 有研究表明，透明質(zhì)酸鋅具有抗微生物、抗氧化損傷等作用，目前在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛，如制成凝膠等劑型，作為傷口敷料用于皮膚和眼外科，可促進(jìn)創(chuàng)面自然愈合[2]。 透明質(zhì)酸作為優(yōu)質(zhì)的保濕原料在化妝品中應(yīng)用極其廣泛，而透明質(zhì)酸鋅同樣具有保濕的功效。 透明質(zhì)酸鋅的抗微生物特性使其可作為具有抑菌防腐效能的活性原料。 為了解不同分子量透明質(zhì)酸鋅的抑菌作用，本文采用防腐劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)方法對(duì)其抑菌防腐效果進(jìn)行研究。

2 材料及方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 試驗(yàn)樣品

3 種分子量的濃度為0.5%透明質(zhì)酸鋅水溶液：低分子量10 KDa、中分子量200～400 KDa、高分子量500～1 000 KDa。

2.1.2 試驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

菌株：大腸桿菌（ATCC8739）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、表皮葡萄球菌（ATCC12228）、白色念珠菌（ATCC10231）、黑曲霉菌（ATCC16404）（廣東省微生物菌種保藏中心）。

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（美國BD 公司）；D/E 中和肉湯（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

2.1.3 主要儀器

菌落計(jì)數(shù)器（scan100，法國interscience 公司）；高壓蒸汽滅菌器（MLS-3781L-PC，日本PHcbi 公司）；生物安全柜（1300 系列II 級(jí)A2 型，美國賽默飛公司）；生化培養(yǎng)箱（BD720&KB400，德國BINDER 公司）。

2.2 試驗(yàn)方法

防腐劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)參考美國藥典USP35＜51＞“抗菌效能實(shí)驗(yàn)方法”[3]進(jìn)行，單次分別接種一定量的菌種于被測樣品中，然后定期量取一部分被測樣品至培養(yǎng)基中培養(yǎng)測試，并統(tǒng)計(jì)計(jì)算菌種的后續(xù)生長情況。

2.2.1 菌液制備

取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌及白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用10 mL無菌生理鹽水洗下菌苔，并將其稀釋成含菌量為1×107～1×108cfu/mL 的菌懸液。

黑曲霉菌：用含有0.05%吐溫80 的生理鹽水洗下斜面上的菌落及孢子，用無菌棉紗布或尼龍網(wǎng)過濾洗下的菌液，濾液于3 500（±10%）r/min 的速度下離心約20 min，棄去上層溶液，加生理鹽水溶解沉淀后的孢子用作接種用菌懸液，菌懸液的濃度控制在1×107～1×108cfu/mL。

2.2.2 試驗(yàn)步驟

樣品微生物檢測：以無菌操作技術(shù)在生物安全柜中用滅菌玻棒或無菌接種環(huán)蘸取少許透明質(zhì)酸鋅樣品劃線于TSA 及SDA 上，將TSA 平板在（32.5±2.5）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，SDA 平板在（22.5±2.5）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d 后觀察結(jié)果。如有微生物生長，則該批樣品不能用于防腐劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)。

分別吸取20 mL 透明質(zhì)酸鋅樣品至無菌瓶中，每種分子量的透明質(zhì)酸鋅樣品各準(zhǔn)備6 瓶。 于旋渦振蕩器上振蕩菌懸液試管約15 s，然后在含20 mL 樣品的無菌瓶中接種0.2 mL 菌懸液，使樣品中的最終含菌量為1×105～1×106cfu/mL，每種試驗(yàn)菌懸液各接種1 瓶樣品。

樣品接種后立即充分混合約1min，確?；旌暇鶆?。

測試期間已接種的樣品應(yīng)放置在20℃～25℃的環(huán)境中保存。

分別于接種后2、7、14、28 d 時(shí)進(jìn)行取樣回收測定活菌數(shù)，取1.0 mL 接種樣品加入9 mL D/E 中和肉湯中，用D/E 中和肉湯進(jìn)行1∶10 連續(xù)稀釋，稀釋完成后澆板測定活菌數(shù)，細(xì)菌澆TSA 在（32.5±2.5）℃培養(yǎng)3～5 d，酵母菌和霉菌澆SDA 在（22.5±2.5）℃培養(yǎng)5～7 d。

計(jì)算挑戰(zhàn)試驗(yàn)控制計(jì)數(shù)（起始點(diǎn)每毫升樣品的接種濃度）的log 值與不同時(shí)間點(diǎn)殘存計(jì)數(shù)（測試時(shí)間點(diǎn)每毫升樣品的回收值）的log 值，二者相減即為每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的log 減少值，詳見表1。

表1 USP-35＜51＞參考標(biāo)準(zhǔn)：log 減少值要求a

3 試驗(yàn)結(jié)果

不同分子量透明質(zhì)酸鋅水溶液的防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果詳見表2、表3、表4。

由表2、表3、表4 試驗(yàn)結(jié)果可知：3 種不同分子量的透明質(zhì)酸鋅水溶液，濃度為0.5%時(shí)，防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果最終都能達(dá)到USP-35＜51＞的要求（表1）。

通過接種后2 d 得到的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，透明質(zhì)酸鋅的分子量越高，其對(duì)部分細(xì)菌及白色酵母菌的抑菌能力就越強(qiáng)。

表2 0.5%低分子量(10 KDa)透明質(zhì)酸鋅防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

表3 0.5%中分子量（200～400 KDa）透明質(zhì)酸鋅防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

表4 0.5%高分子量（500～1 000 KDa）透明質(zhì)酸鋅防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

在透明質(zhì)酸鋅持續(xù)作用下，14 d 時(shí)3 種分子量透明質(zhì)酸鋅水溶液中的4 種細(xì)菌和白色念珠菌數(shù)量均減少至＜10 cfu/mL，相應(yīng)的log 減少值均達(dá)到最大值。 這個(gè)試驗(yàn)結(jié)果充分證明透明質(zhì)酸鋅水溶液對(duì)于這4 種細(xì)菌和白色念珠菌有較強(qiáng)的抑菌防腐效能。

不同分子量的透明質(zhì)酸鋅水溶液對(duì)于黑曲霉菌的抑制能力大致相當(dāng)，僅能控制黑曲霉菌的數(shù)量不再增加，卻無法像滅菌那樣使黑曲霉菌的數(shù)量大幅減少[4]。

4 討論

以上試驗(yàn)結(jié)果證明濃度為0.5%的透明質(zhì)酸鋅具有抑菌防腐效能，可以作為一款具有自身防腐功效的多功能活性物應(yīng)用在化妝品配方中。 如果產(chǎn)品包裝形式恰當(dāng)且產(chǎn)品生產(chǎn)過程符合生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP），產(chǎn)品配方構(gòu)建時(shí)可以考慮不添加常規(guī)防腐劑，僅靠透明質(zhì)酸鋅的自身防腐功能就能保證產(chǎn)品從生產(chǎn)、銷售使用的全生命周期免受微生物污染[5]。 如果產(chǎn)品的生產(chǎn)過程GMP 欠缺，包裝形式、使用方式也存在二次污染的可能，那么可以將透明質(zhì)酸鋅與具有防腐功效尤其是具有高效抑制霉菌功效的其他成分復(fù)配增效，共同構(gòu)建一個(gè)更加強(qiáng)力的防腐體系，以達(dá)到防止微生物污染的目的。