黃皆竣 莫靜燕

（揚子江藥業(yè)集團江蘇紫龍藥業(yè)有限公司（質(zhì)檢中心） 江蘇常州 213000）

1 前言

氨甲環(huán)酸是人工合成的抗纖溶藥物，研究證實該藥用于心臟手術(shù)可有效預(yù)防圍術(shù)期大量出血[1]，同時局部應(yīng)用氨甲環(huán)酸可減少全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)出血[2]。 目前，國內(nèi)外文獻報道中尚無氨甲環(huán)酸微生物限度檢查方法。為提升該原料藥質(zhì)控水平，按照USP 41 規(guī)定[3]，對氨甲環(huán)酸進行微生物限度方法學(xué)驗證，并建立該原料的微生物限度檢查法，為藥品生產(chǎn)和檢驗監(jiān)督提供可行有效的方法學(xué)參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

電子天平（PL202-L，梅特勒-托利多公司）；脈動真空滅菌器（XG1.G，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；立式滅菌器（LMQ.C，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；潔凈工作臺（SW-CJ-1CU，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；生物安全柜（1384-A2，Thermo Scientific）；生化培養(yǎng)箱（LRH-150，上海索普儀器有限公司）；霉菌培養(yǎng)箱（MJ-150-1，海索普儀器有限公司）。

2.1.2 菌株

黑曲霉（ATCC 16404）、枯草芽孢桿菌（ATCC 6633）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、白色念珠菌（ATCC 10231）、大腸埃希菌（ATCC 8739）、銅綠假單胞菌（ATCC 9027）、乙型副傷寒沙門菌（ATCC 14028）均購于ATCC 菌種保藏管理中心。

2.1.2 試液

pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京三藥科技開發(fā)有限公司）；聚山梨酯80（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）。

2.1.3 培養(yǎng)基

胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MaCc Agar）、麥康凱肉湯培養(yǎng)基（MaCc Broth）（北京三藥科技開發(fā)有限公司）。

2.1.4 供試品

氨甲環(huán)酸批號為F0021103021、F0021103022、F0021102023。

2.2 方法

2.2.1 對酵母菌、 霉菌以及需氧菌計數(shù)方式實施實用性試驗

制作供試液：向無菌錐形瓶內(nèi)添加10 g 氨甲環(huán)酸原料藥，并添加少許pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液達到溶解的效果，隨后添加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，直到無菌錐形瓶內(nèi)溶液達到100 mL。控制力度搖晃直至其混合均勻。

試驗菌株菌液制備：將沙門菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌接種于TSB 內(nèi)，在33.0℃培養(yǎng)24 h；在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物， 在23.0℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，隨用將pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液按照10 倍梯度將培養(yǎng)物稀釋，直到菌懸液達到10 000 cfu/mL，留作后續(xù)使用。 向SDA 內(nèi)接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，控制溫度為23℃，培養(yǎng)7 d 至長出豐富的黑色孢子，加入3 mL pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，用玻璃棒輕輕攪拌，將黑曲霉孢子洗脫，然后用管口能過濾菌絲的移液槍吸取孢子懸液至無菌試管內(nèi)，采取pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，且含0.05%（v/v）聚山梨酯80 溶液10 倍梯度稀釋至孢子數(shù)含量在10 000 cfu/mL 以下的孢子懸液，留作后續(xù)使用。

2.2.2 試驗組

需氧菌總數(shù)：取1∶10 供試液9.9 mL，分別加入適宜濃度的試驗菌液0.1 mL（黑曲霉孢子懸液、白色念珠菌菌懸液、沙門菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、大腸埃希菌菌懸液），充分混勻。 取1 mL 供試液添加至無菌平皿，并加入溫度在45℃以下熔化的TSA 20 mL，將其均勻混合直至凝固，將混有細菌懸液的TSA 平板于33.0℃倒置培養(yǎng)3 d，混有真菌懸液的TSA 平板于33.0℃倒置培養(yǎng)5 d，逐日點計菌落數(shù)。

霉菌和酵母菌總數(shù)：取1∶10 供試液9.9 mL，加入適宜濃度的試驗菌液0.1 mL（白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液），充分混勻。 取1 mL 注入無菌平皿，加入45℃熔化的SDA20 mL，將其均勻混合直至凝固，置于23.0℃培養(yǎng)5 d，逐日點計菌落數(shù)。

供試品對照組：取1∶10 供試液9.9 mL，以稀釋液代替菌液，同法操作。

菌液對照組：供試液可以選用稀釋液pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，根據(jù)試驗組相同方法進行操作，添加試驗菌液同時實施微生物回收試驗。

稀釋劑對照組：稀釋劑對照組試驗前提為供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理[4]。 本驗證方法采用直接接種法，沒有處理過程，故無需進行本組試驗。

上述方法獨立平行試驗3 次。

2.2.3 回收率計算

回收率公式如式（1）：

2.2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

在3 次獨立的平行試驗中，若試驗組的菌回收率均在0.5～2，說明該檢測方法適合該供試品的需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定，可按該檢測方法測定供試品的需氧菌、霉菌和酵母菌數(shù)。若任一次試驗中試驗組的菌回收率不在0.5～2 內(nèi)，應(yīng)重新建立方法，消除供試品的抑制菌活性，并重新進行方法驗證結(jié)果詳見表1。

2.3 控制菌的檢查方法驗證

2.3.1 大腸埃希菌

陽性對照組：取1∶10 稀釋級氨甲環(huán)酸供試液10mL（相當(dāng)于氨甲環(huán)酸1 g），接種至100 mL 的TSA 中，同時接種含菌數(shù)小于100 cfu 的大腸埃希菌菌懸液混勻，置于33.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取上述培養(yǎng)物1 mL，接種至100 mL MaCc Broth 中，置于43.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，劃線接種于MaCc Broth 上，置于33.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)驗證結(jié)果（n=3）

供試品對照組：取制備好的1∶10 供試液，以稀釋液pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，操作同陽性對照組。

陰性對照組：以稀釋液pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液和菌液，操作同陽性對照組。

2.4 試驗結(jié)果

由表2 可知，在麥康凱瓊脂平板中陽性對照組出現(xiàn)鮮桃紅色的典型菌落，同時通過分離純化和采取革蘭染色鏡檢平板上的單菌落，明確得出其就是大腸埃希菌，在陰性對照組以及供試品對照組內(nèi)均沒有檢出。

表2 大腸埃希菌控制菌方法驗證結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 供試液稀釋級別的確定

氨甲環(huán)酸作為抗纖溶藥，能夠保護纖維蛋白不被溶解，有效減少出血。 結(jié)合其化學(xué)結(jié)構(gòu)，初步判斷本品無抑菌性，為明確其稀釋倍數(shù)不影響微生物的檢出，本研究對1∶10 稀釋級別的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗回收比值試驗， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)本品1∶10 稀釋級別的供試液回收比值均在0.5～2 內(nèi)。 故綜合考慮考察結(jié)果的穩(wěn)定性以及操作的易行性，確認采用平皿法可作為本品的微生物計數(shù)方法。

3.2 菌液和供試液混合時間點的確定

2015 年版《中國藥典》四部通則非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法和國際標(biāo)準(zhǔn)基本相同，實現(xiàn)了與國際ICH 要求的統(tǒng)一協(xié)調(diào)。2015 年版藥典中修改了添加菌液的時間點，明確規(guī)定了向供試液混勻中添加的試驗菌液體積需要小于供試液體積的1%，該條款的修訂體現(xiàn)了方法的科學(xué)性和嚴(yán)謹性，同時提高了試驗結(jié)果的可靠性。

4 結(jié)語

藥品微生物限度檢查的操作步驟煩瑣、 檢測周期長，對檢驗環(huán)境以及檢測人員等環(huán)節(jié)要求高，結(jié)果受多方面的影響，檢驗過程需確認培養(yǎng)基適用性和檢測人員資質(zhì)等環(huán)節(jié)，確保方法的準(zhǔn)確性和完整性[5]。本研究通過對氨甲環(huán)酸微生物限度進行適用性試驗，確認了該原料藥日常微生物限度的檢測方法，通過此方法能夠給此品種制劑的微生物檢查方法提供一定的指導(dǎo)意義。