毋堃杰 楊瑞昕 夏 天 楊曉東

（西安市食品藥品檢驗(yàn)所 陜西西安 710000）

1 前言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要病原菌，廣泛存在于自然界中，常寄生于人和動(dòng)物的皮膚以及化膿瘡口等環(huán)境中，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），有“嗜肉菌”的別稱(chēng)，是革蘭陽(yáng)性菌的代表，也是葡萄球菌屬中對(duì)人類(lèi)致病力最強(qiáng)的一種，能引起人體局部化膿，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥，威脅人的生命安全。因此，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）[1]將金黃色葡萄球菌列為化妝品微生物檢測(cè)常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，要求不得檢出。 檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性是體現(xiàn)一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的工作能力和技術(shù)水平的關(guān)鍵，而能力驗(yàn)證是科學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和質(zhì)量控制能力的有力手段，一方面可以通過(guò)它來(lái)證明自身的檢驗(yàn)檢測(cè)能力，另一方面可以借助它發(fā)現(xiàn)和識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在的問(wèn)題與風(fēng)險(xiǎn)，并啟動(dòng)改進(jìn)措施，提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平和能力。 為提高化妝品檢驗(yàn)檢測(cè)能力，西安市食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)室參加了2019 年NIFDC-PT-188《化妝品金黃色葡萄球菌能力驗(yàn)證》，在檢驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)SN/T 2206.10—2014《化妝品微生物檢驗(yàn)方法 第10 部分：金黃色葡萄球菌PCR 法》[2]、SN/T 2206.11—2014《化妝品微生物檢驗(yàn)方法 第11部分：金黃色葡萄球菌 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 法》[3]中的方法同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行了檢驗(yàn)，并對(duì)檢驗(yàn)過(guò)程和檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比分析和探討研究。

2 材料與儀器

2.1 待測(cè)樣品

NIFDC-PT-188 化妝品金黃色葡萄球菌能力驗(yàn)證樣品2 份，編號(hào)為T(mén)C01880209 和TC01880026。

2.2 菌株

陽(yáng)性對(duì)照菌株：金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）；陰性對(duì)照菌株：表皮葡萄球菌（Staphylococcus Epidermidis）（CMCC（B）26069）。

2.3 儀器設(shè)備

VITEK2 Compact 全自動(dòng)微生物生化系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士Roche公司）；小型離心機(jī)（美國(guó)Sigma-aldrich 公司）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf 公司）；1300SERIESA2 生物安全柜（美國(guó)Thermo 公司）；LRH-250 生化培養(yǎng)箱（上海一恒公司）；SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY公司）。

2.4 培養(yǎng)基和試劑

SCDLP（Soya Casein Digest Lecithin Polysorbate Broth）培養(yǎng)基；BP（Baird-Parker）瓊脂培養(yǎng)基；血瓊脂培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基；液體石蠟；天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒；Premix Ex TaqTM（probe for qPCR）；引物（生工生物工程股份有限公司合成）。

3 方法

依據(jù)NIFDC-PT-188《化妝品金黃色葡萄球菌能力驗(yàn)證》作業(yè)指導(dǎo)書(shū)和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）的要求進(jìn)行增菌、分離和鑒定。同時(shí)，根據(jù)SN/T 2206.10—2014、SN/T 2206.11—2014、《化妝品微生物檢驗(yàn)方法》對(duì)樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和多重實(shí)時(shí)熒光PCR 的檢驗(yàn)，最終綜合以上試驗(yàn)結(jié)果出具報(bào)告，檢驗(yàn)流程詳見(jiàn)圖1。

3.1 增菌

取少量SCDLP 加至西林瓶中，使其分散混懸，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中，然后用SCDLP 潤(rùn)洗西林瓶4 次，最終試管中的SCDLP 體積為10 mL[4]。 上述樣液為供試液，將供試液接種到90 mL SCDLP 液體培養(yǎng)基中，置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24±2）h。

3.2 選擇性分離

輕輕震蕩培養(yǎng)基以混勻培養(yǎng)過(guò)的樣品混合物，分別用接種環(huán)取上述增菌液一環(huán)（10 μL 接種環(huán)），劃線于BP 瓊脂培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基及金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，陽(yáng)性對(duì)照同法操作。

圖1 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)流程圖

3.3 生化反應(yīng)試驗(yàn)

從BP 平板及金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基上選取典型菌落，劃線至大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）斜面和胰蛋白胨大豆瓊脂平板上于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，涂片，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，并分別進(jìn)行甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)。

3.4 分子學(xué)檢驗(yàn)

DNA 模板提取：使用天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取模板DNA。

PCR 鑒定：（1）PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s；58℃退火30 s；72℃延伸20 s；40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保溫。 （2）凝膠電泳試驗(yàn)：取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，分別與1 μL 上樣緩沖液混合進(jìn)行點(diǎn)樣，用DNA 分子量標(biāo)記物做參照物。 3～5 V/cm恒壓電泳20～40 min。

多重實(shí)時(shí)熒光PCR 試驗(yàn)：檢測(cè)化妝品中金黃色葡萄球菌采用多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)的反應(yīng)體系，詳見(jiàn)表1。

表1 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)的反應(yīng)體系

多重實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s；60℃復(fù)性30 s；45 個(gè)循環(huán)。

3.5 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）鑒定

分別從胰蛋白胨大豆瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落，用GN 鑒定卡，按照VIDAS 法的檢測(cè)步驟，采用VITET2-Compact 菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定[5]。

4 結(jié)果與分析

4.1 增菌和選擇性分離結(jié)果

分離選擇性平板上的菌落特征詳見(jiàn)表2。

從表2 可知，所有樣品的SCDLP 增菌液在（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h 后均渾濁，說(shuō)明樣品TC01880209、TC01880026 中含有可在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物，通過(guò)劃線于選擇性培養(yǎng)基，從樣品編號(hào)TC01880209、TC01880026 中得到了3 種不同形態(tài)的菌落。 編號(hào)TC01880209 劃線分離后，在血瓊脂平板、BP 平板和金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)了2 種菌落形態(tài)，而編號(hào)TC01880026 劃線分離后除在金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基呈現(xiàn)2 種菌落形態(tài)外，在其他2 種培養(yǎng)基上均只呈現(xiàn)了1 種菌落形態(tài)；對(duì)所有3 種菌落進(jìn)行了革蘭染色，具體描述見(jiàn)表2。從BP 平板、血瓊脂平板和金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況以及結(jié)合染色結(jié)果可知，TC01880209 可能檢出金黃色葡萄球菌，而TC01880026 盡管含有革蘭陽(yáng)性球菌，但其菌落在BP 平板上無(wú)混濁帶，血瓊脂平板上無(wú)溶血圈，是金黃色葡萄球菌的可能性偏低，需進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定[6]。

表2 分離選擇性平板上的菌落特征

4.2 生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)3 種不同形態(tài)的菌株進(jìn)行了生化反應(yīng)鑒定，從TC01880209 分離出的革蘭陽(yáng)性球菌甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，與金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照完全一致，初步判斷檢出金黃色葡萄球菌，而從TC01880026 分離出的革蘭陽(yáng)性球菌甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陰性，初步判斷未檢出金黃色葡萄球菌，詳見(jiàn)表3。

表3 革蘭陽(yáng)性球菌的生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

4.3 PCR 試驗(yàn)結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖詳見(jiàn)圖2，1 號(hào)泳道為500 bp 的DNA Maker 條帶，2 號(hào)泳道為空白對(duì)照，3 號(hào)泳道為編號(hào)TC01880026 樣品，4 號(hào)泳道為編號(hào)TC1880209 樣品， 5 號(hào)泳道為陽(yáng)性對(duì)照，6 號(hào)泳道為陰性對(duì)照。 樣品編號(hào)TC01880209 樣品PCR 反應(yīng)擴(kuò)增出247 bp 的產(chǎn)物，且陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出同目的片段，編號(hào)TC01880026 樣品、陰性對(duì)照與空白對(duì)照未檢測(cè)到247 bp 目的片段。按照SN/T 2206.10—2014 標(biāo)準(zhǔn)要求，編號(hào)TC1880209 樣品報(bào)告為檢出金黃色葡萄球菌，編號(hào)TC01880026 樣品報(bào)告為未檢出金黃色葡萄球菌。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖

4.4 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 試驗(yàn)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)2 條典型擴(kuò)增曲線，Ct 值＜30，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，Ct 值≥40。 編號(hào)TC1880209 樣品Ct 值≤35，并且分別出現(xiàn)2 條典型擴(kuò)增曲線，則判為陽(yáng)性，詳見(jiàn)圖2；編號(hào)TC01880026 樣品Ct 值≥40，并無(wú)典型擴(kuò)增曲線，則判為陰性，詳見(jiàn)圖3。 按照SN/T 2206.11—2014 要求，編號(hào)TC1880209 樣品報(bào)告為檢出金黃色葡萄球菌，編號(hào)TC01880026 樣品報(bào)告為未檢出金黃色葡萄球菌。

圖3 TC1880209 樣品多重實(shí)時(shí)熒光PCR 試驗(yàn)結(jié)果

圖4 TC01880026 樣品多重實(shí)時(shí)熒光PCR 試驗(yàn)結(jié)果

4.5 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）鑒定結(jié)果

革蘭陽(yáng)性球菌的生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 革蘭陽(yáng)性球菌的生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

從表4 可以看出，從TC01880209 分離出的革蘭陽(yáng)性球菌與金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照的鑒定結(jié)果完全一致， 確定該樣品檢出金黃色葡萄球菌， 而從TC01880026 分離出的革蘭陽(yáng)性球菌檢測(cè)結(jié)果為表皮葡萄球菌，未檢出金黃色葡萄球菌。分離出的其他菌株鑒定結(jié)果為英諾克李斯特菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌。

4.6 各鑒定方法的結(jié)果比較

為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)分離純化的菌株采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）鑒定、PCR 法、多重實(shí)時(shí)熒光PCR 法進(jìn)行了鑒定。 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的鑒定主要靠傳統(tǒng)的微生物生化法，其結(jié)果易受人員操作及判定的影響[7]；分子學(xué)鑒定及VITEK2 鑒定采用了不同的原理對(duì)樣品進(jìn)行鑒定，在縮短檢驗(yàn)時(shí)間的同時(shí)也減少了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中人為因素的影響，但對(duì)儀器設(shè)備及試劑有更高的要求[8]。 各方法具體結(jié)果詳見(jiàn)表5。

從表5 的鑒定結(jié)果可以看出，樣品TC01880209中檢出金黃色葡萄球菌，樣品TC01880026 未檢出金黃色葡萄球菌，所列鑒定方法所得結(jié)果均一致。

表5 各種檢驗(yàn)方法所得結(jié)果比較

5 討論

檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)能力是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室能力的重要條件[9]。 本次能力驗(yàn)證中為使檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、高效、可靠，實(shí)驗(yàn)室采用了VITEK2、分子生物學(xué)檢驗(yàn)等多種檢驗(yàn)方法，在一定程度上縮短了試驗(yàn)周期，且多種方法結(jié)合避免了假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

從整個(gè)試驗(yàn)可以看出VITEK2 是在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上幫助試驗(yàn)人員鑒定出篩選到的干擾菌株，使其有能力在鑒別目標(biāo)菌株的同時(shí)鑒定出樣品中所篩選到的所有菌株，提升了實(shí)驗(yàn)室鑒別干擾菌株的能力。而分子生物學(xué)檢驗(yàn)則不然，其耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快，能夠直接對(duì)增菌液進(jìn)行檢測(cè)，36 h 左右便可得到檢驗(yàn)結(jié)果，大大縮短了檢驗(yàn)周期，且不易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，省去了傳統(tǒng)方法分離鑒定的步驟，使后續(xù)鑒別的靶向性更加明確，由此可知分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法更適合用于對(duì)樣品的快速篩查。

綜上所述，可根據(jù)不同的試驗(yàn)條件、試驗(yàn)周期，采用多種鑒定手段相結(jié)合的方法來(lái)準(zhǔn)確、高效地滿足實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)需要，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的競(jìng)爭(zhēng)力。