王雨鑫，劉學(xué)聲，劉建軍，周富裕，馬友力，鄧燕莉*

(1.貴州大學(xué) 茶學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.湖南省茶業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖南 長沙431010；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006)

茶黃素是由兒茶素類物質(zhì)氧化縮合溶于乙酸乙酯呈橙黃色的一類茶色素物質(zhì)，被譽(yù)為茶葉中的腦黃金[1-2]。茶黃素也是紅茶中湯色亮的關(guān)鍵化學(xué)成分，主要影響紅茶茶湯滋味強(qiáng)度和鮮爽度，是形成紅茶金圈的主要構(gòu)成物質(zhì)[3]。茶黃素具有多種保健功能，在抗心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、殺菌消炎、提高免疫力等方面具有重要的醫(yī)療保健作用[4-5]?？梢?，提高紅茶中茶黃素的含量對紅茶品質(zhì)的提升及增強(qiáng)紅茶的保健功能均具有關(guān)鍵作用。目前，已有多項(xiàng)技術(shù)用于提高茶黃素含量，主要是通過改進(jìn)萎凋和發(fā)酵工藝實(shí)現(xiàn)，在紅茶加工中運(yùn)用冷凍技術(shù)增強(qiáng)細(xì)胞膜透性、促進(jìn)酶促反應(yīng)能提高紅茶產(chǎn)品茶黃素的含量[6-9]。溫度是發(fā)酵過程中最重要的因素，能影響茶葉中多酚氧化酶等酶類物質(zhì)的活性?；鸾艿萚10-15]研究表明，發(fā)酵溫度先高后低時所合成的茶黃素含量最高，且發(fā)酵溫度22℃，發(fā)酵時間100～140 min，茶黃素的含量最高，發(fā)酵溫度低于30℃有利于茶黃素的形成和累積。通過添加外源物質(zhì)來促進(jìn)紅茶加工中茶黃素的合成也是一條重要的路徑，在發(fā)酵過程中添加不同來源多酚氧化酶以及添加酶所需的金屬離子均能促進(jìn)茶黃素的整體合成[16-17]，添加不同比例兒茶素后，紅茶中茶黃素的含量隨著添加量的增加而增加[15]。在紅茶加工過程中如在萎凋、提香過程中運(yùn)用紫外光照射或黃光、遠(yuǎn)紅外線照射，均能提高成品茶中茶黃素的含量[18-20]。因此，想要獲得高茶黃素的紅茶，改進(jìn)萎凋工藝、發(fā)酵工藝、添加外源物質(zhì)或酶是目前研究的重點(diǎn)。貴州省內(nèi)當(dāng)前主要種植的茶樹品種是福鼎大白茶，貴州高海拔、低緯度、多云霧、無污染的高原生態(tài)使得夏秋季節(jié)茶樹鮮葉兒茶素類物質(zhì)含量較高且嫩度較好，但貴州茶產(chǎn)品以綠茶居多，紅茶較少。為豐富貴州茶產(chǎn)品種類，以福鼎大白夏秋茶鮮葉為研究對象，在現(xiàn)有紅茶加工技術(shù)的基礎(chǔ)上，添加茶葉外源兒茶素提取物，優(yōu)化兒茶素濃度、兒茶素添加比例、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的工藝參數(shù)，最大限度地酶促合成茶黃素，為高茶黃素紅茶的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 茶樹品種 福鼎大白(Camelliasinensiscv Fuding-dabaicha)；采摘標(biāo)準(zhǔn)：一芽1葉和一芽2葉鮮葉；采摘地點(diǎn)：貴州省六盤水市六枝特區(qū)落別鄉(xiāng)。

1.1.2 藥品 純度為50%和80%的兒茶素提取物，購于湖南三福生物科技有限公司；乙酸乙酯、正丁醇、95 %乙醇(AR)、碳酸氫鈉(AR)、草酸(AR)等分析純化學(xué)試劑，購于貴州博躍賽斯生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 6CR-40型茶葉揉捻機(jī)，浙江上洋機(jī)械有限公司；6CFX-16型茶葉發(fā)酵機(jī)，浙江紅五環(huán)制茶裝備股份有限公司；6CHZ-9B型茶葉烘焙機(jī)，福建佳友茶葉機(jī)械智能科技股份有限公司；BSA224S型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；SHZ-ш型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；DK-98-ц型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；UV-6000T型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Pacific TII 7 UV型超純水機(jī)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) 依次進(jìn)行不同濃度兒茶素提取物及其添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度的單因素試驗(yàn)，通過分析各因子對茶黃素生成量的影響，篩選較優(yōu)參數(shù)。

1) 兒茶素提取物濃度及添加量。采摘福鼎大白茶樹一芽1葉和一芽2葉鮮葉置于萎凋槽中萎凋至適度，將萎凋葉充分揉捻至適度即破損率在90%以上、成條率在80%以上，將揉捻好的揉捻葉分別稱取11份、每份等量600 g，分別編號處理1～11，處理1～5分別按揉捻葉重量的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%添加濃度為50%的兒茶素提取物(兒茶素提取物統(tǒng)一用70 mL 35℃純凈水溶解，下同)，處理6～10分別按揉捻葉重量的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%添加濃度為80%的兒茶素提取物。處理11不添加兒茶素，添加等體積的35℃ 純凈水作空白對照。設(shè)定發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵濕度99%，發(fā)酵3 h 后毛火110℃烘至6～7成干，攤涼1 h，足火80℃烘至足干。

2) 發(fā)酵時間。采摘福鼎大白茶樹一芽1葉和一芽2葉鮮葉置于萎凋槽中萎凋至適度，將萎凋葉充分揉捻至適度即破損率在90 %以上、成條率在80 %以上，按最佳條件的兒茶素提取物濃度及添加量添加兒茶素，將揉捻好的揉捻葉分別稱取6份，每份等量600 g，處理12～17分別按1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h設(shè)定發(fā)酵時間，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵濕度99%發(fā)酵，發(fā)酵完后毛火110℃烘至6～7成干，攤涼1 h，足火80℃烘至足干。

3) 發(fā)酵溫度。采摘福鼎大白茶樹一芽1葉和一芽2葉鮮葉置于萎凋槽中萎凋至適度，將萎凋葉充分揉捻至適度即破損率在90%以上、成條率在80%以上，將揉捻好的揉捻葉分別稱取5份，每份等量600 g，按最佳條件的兒茶素提取物濃度及添加量添加兒茶素，處理18～22分別于20℃、24℃、28℃、32℃和36℃的發(fā)酵溫度下，發(fā)酵濕度99 %，按照最佳發(fā)酵時間進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完后毛火110℃烘至6～7成干，攤涼1 h，足火80℃烘至足干。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)獲得較優(yōu)值的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)兒茶素提取物添加量(A)、發(fā)酵時間(B)、發(fā)酵溫度(C)的3因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化篩選外源兒茶素提取物添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等。其因素水平見表1。

表1 添加外源兒茶素制備高茶黃素紅茶的正交試驗(yàn)因素及水平

1.2.3 最佳工藝的驗(yàn)證 對正交試驗(yàn)中所得的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證，為工藝優(yōu)化提供指導(dǎo)。

1.3 理化指標(biāo)的測定

1.3.1 含水量 按照GB/T 8304-2013《茶水分測定》120℃快速烘干法進(jìn)行測定。

1.3.2 茶黃素含量 參照《茶葉生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》中茶黃素的系統(tǒng)分析法[21]進(jìn)行檢測分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均做3次重復(fù)，用WPS Office 2019整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用DPS7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對試驗(yàn)中樣品的茶黃素含量進(jìn)行多重比較分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為最后結(jié)果。在數(shù)據(jù)分析結(jié)果中，P<0.05表示差異顯著，差異性用小寫字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對茶黃素生成量的影響

2.1.1 兒茶素提取物濃度及添加量 從表2可知，添加相同兒茶素濃度但不同添加量時，茶黃素生成量均呈先增后降趨勢。在兒茶素濃度為50%時，添加量為2.5% 的茶黃素生成量最大，為4.11 mg/g，與添加量分別為1.0%、1.5%和2.0%的差異顯著，與添加量3.0%的無顯著差異；在兒茶素濃度為80%時，添加量為2.0% 的茶黃素生成量最大，為3.82 mg/g，與添加量分別為1.0%、2.5%和3.0%的差異顯著，與添加量1.5%的無顯差異。對所有兒茶素提取物添加處理組比較分析可知，當(dāng)兒茶素濃度為50%、添加量為2.5%時，茶黃素生成量最大，為4.11mg/g。表明，從茶黃素生成量看，兒茶素最佳添加濃度為50%、最佳添加量為2.5%。

表2 不同兒茶素提取物濃度及其添加量的茶黃素生成量

2.1.2 發(fā)酵時間 由圖1可知，各處理組間茶黃素生成量無顯著差異，隨著發(fā)酵時間的延長，茶黃素生成量呈先升后降趨勢，且發(fā)酵時間2.5 h時茶黃素生成量最大，為3.79 mg/g，可見2.5 h是最佳的發(fā)酵時間。

2.1.3 發(fā)酵溫度 由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，茶黃素的生成量呈下降趨勢，且在發(fā)酵溫度20℃時，茶黃素的生成量最大，為5.36 mg/g，與其他處理差異顯著；其余各處理間差異不顯著，可見20℃是最佳發(fā)酵溫度。

2.2 外源兒茶素制備高茶黃素紅茶的正交試驗(yàn)結(jié)果

從表3可知，以茶黃素生成量為考察指標(biāo)時，兒茶素添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等3個因素對茶黃素生成量的影響依次為發(fā)酵溫度>兒茶素添加量>發(fā)酵時間，理論最優(yōu)組合為A3B1C2，即兒茶素濃度50%、添加量3.0%、發(fā)酵時間2 h、發(fā)酵溫度24℃。正交試驗(yàn)9個處理組中，處理4(A2B1C2)即兒茶素濃度50%、添加量2.5%、發(fā)酵時間2 h、發(fā)酵溫度 24℃時，茶黃素生成量最高，為6.72 mg/g，且與其他處理組間差異顯著；茶黃素生成量次高的為處理9(A3B3C2)即兒茶素濃度50%、添加量3.0%、發(fā)酵時間3 h、發(fā)酵溫度 24℃時，其茶黃素生成量為5.52 mg/g；茶黃素生成量最低的是處理1(A1B1C1)

表3 外源兒茶素制備高茶黃素紅茶的正交試驗(yàn)結(jié)果

即兒茶素濃度50%、添加量2.0%、發(fā)酵時間2 h、發(fā)酵溫度 20℃時，其茶黃素生成量為 1.51 mg/g。因此選取正交試驗(yàn)中的理論最優(yōu)組合A3B1C2和實(shí)踐中最優(yōu)組合A2B1C2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.3 外源兒茶素制備高茶黃素紅茶的最佳工藝條件

對A3B1C2和A2B1C2處理進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)表明，以茶黃素生成量為參考指標(biāo)時，采用A3B1C2工藝組合得到的茶黃素生成量為5.62 mg/g，采用A2B1C2工藝組合得到的茶黃素生成量為6.75 mg/g。所以，試驗(yàn)最終得到的最優(yōu)組合為A2B1C2，即兒茶素濃度50%，兒茶素添加量2.5%，發(fā)酵時間2 h，發(fā)酵溫度24℃。

3 結(jié)論與討論

茶黃素是一類在紅茶加工過程中由兒茶素類化合物氧化形成的物質(zhì)，是紅茶的主要品質(zhì)成分之一，是使紅茶呈現(xiàn)湯色亮及金圈的主要物質(zhì)，也是紅茶強(qiáng)度和鮮爽度的重要呈味物質(zhì)。目前，用傳統(tǒng)工藝加工出來的紅茶中茶黃素含量較低，通過加工技術(shù)改良來提高紅茶中茶黃素的含量是當(dāng)前形勢所需。提高茶黃素的途徑有多種，如增加發(fā)酵過程中多酚氧化酶、過氧化物酶等酶的活性；在加工過程中引入冷凍處理，提高細(xì)胞膜的透性促進(jìn)酶促氧化[7-8]；發(fā)酵中添加外源酶增強(qiáng)酶促反應(yīng)的氧化能力[22-23]；兒茶素是生成茶黃素的酶促氧化反應(yīng)的底物，在酶促反應(yīng)中增加底物的量可有效促進(jìn)反應(yīng)，提高其含量[24-25]。研究旨在改良加工工藝，在紅茶的發(fā)酵中按一定比例添加外源兒茶素提取物，增加底物的濃度，同時研究發(fā)酵溫度和時間以促進(jìn)茶黃素的形成。試驗(yàn)以35℃的溫水溶解兒茶素提取物，確保兒茶素完全溶解使其與揉捻葉充分混勻[26]。試驗(yàn)中添加不同濃度和不同添加量的兒茶素處理組的茶黃素生成量均顯著高于空白處理，說明添加兒茶素提取物能有效提高紅茶中茶黃素的含量。在同一兒茶素濃度中隨著添加量的增加，茶黃素的生成量呈先增后降趨勢；在不同濃度條件下，試驗(yàn)中兒茶素濃度為50%、添加量為2.5%時茶黃素生成量最大，為4.11 mg/g；兒茶素濃度為80%，添加量為2.0%時茶黃素生成量最大，為3.82 mg/g；這一結(jié)果與曹冰冰等[15]的研究結(jié)果相符。在生成茶黃素的酶促反應(yīng)中，兒茶素是底物，在一定范圍內(nèi)增大底物的濃度可有效提高反應(yīng)生成物的含量，但在兒茶素氧化生成茶黃素的同時茶黃素也會發(fā)生進(jìn)一步的氧化，茶黃素的生成量增大后會促進(jìn)茶黃素的進(jìn)一步氧化，且茶黃素的含量達(dá)一定值時會抑制氧化酶類的活性，使之含量降低[27-28]，可見底物濃度過大時，會抑制氧化酶類等的活性且促進(jìn)茶黃素產(chǎn)物的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化[28-29]。溫度是發(fā)酵工藝中重要的影響因素之一，直接影響酶促反應(yīng)中酶的活性。研究表明，隨著發(fā)酵溫度的升高，茶黃素的生成量呈下降趨勢，且在發(fā)酵溫度20℃時，茶黃素的生成量最大，為5.36 mg/g，主要是隨溫度的升高，兒茶素與茶黃素類物質(zhì)的穩(wěn)定性降低進(jìn)而發(fā)生降解[30]，且超過一定溫度范圍酶活性會降低[31-32]，而低溫有利于茶黃素的保留[33-34]，適當(dāng)降低發(fā)酵溫度可以提高紅茶的品質(zhì)，提高茶黃素的含量[35-36]。發(fā)酵時間是提升紅茶品質(zhì)的重要條件，發(fā)酵時間過短，酶促反應(yīng)不充分，發(fā)酵時間過長，酶促反應(yīng)氧化過度。研究表明，隨著發(fā)酵時間的延長，茶黃素的生成量呈先升后降趨勢，且發(fā)酵時間2.5 h時茶黃素生成量最大，為3.79 mg/g，這是由于發(fā)酵前期酶促反應(yīng)為氧化生成茶黃素，在發(fā)酵適度后繼續(xù)發(fā)酵使氧化過度，茶黃素發(fā)生酶促氧化生成茶紅素、茶褐素類物質(zhì)，發(fā)酵時間越長，茶黃素降解和轉(zhuǎn)化的越多，適當(dāng)縮短發(fā)酵時間，可以獲得高濃度的茶黃素[36-37]。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對茶黃素生成量的影響最大，兒茶素添加量的影響次之，發(fā)酵時間對生成量的影響最弱，考慮正交試驗(yàn)與驗(yàn)證試驗(yàn)中各處理組茶黃素的生成量與生產(chǎn)過程中的成本問題，高茶黃素紅茶加工生產(chǎn)中的最佳工藝為兒茶素提取物濃度50%，兒茶素提取物添加量2.5%(重量比)，發(fā)酵時間2 h，發(fā)酵溫度24℃。該條件下，可獲得高含量茶黃素，達(dá)6.75 mg/g，與傳統(tǒng)工藝相比，該工藝可有效增加紅茶產(chǎn)品中茶黃素的含量，對紅茶生產(chǎn)加工有一定參考價值。