張 欣，盧聲潔，程宇豪，王坤英，張金峰，周玉鋒*

(1.貴州省農業(yè)科學院 生物技術研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州大學 茶學院，貴州 貴陽 550025； 3.貴州省農業(yè)科學院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006)

茶樹〔Camelliasinensis(L.) O. Ktze.〕是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)多年生灌木或喬木植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。茶樹主要的經(jīng)濟價值在于茶葉，其含有豐富的茶多酚、茶氨酸、茶色素和茶多糖等生物活性物質，對調節(jié)人體代謝[1]、降血糖[2]、防癌抗癌[3]、抗氧化及增強免疫力[4]具有重要作用。為助力鄉(xiāng)村振興，打贏脫貧攻堅總決戰(zhàn)，貴州大力發(fā)展茶產(chǎn)業(yè)[5]。據(jù)統(tǒng)計，截止2019年底，貴州茶園面積已達46.56萬hm2，位居全國第二。隨著茶樹種植面積不斷擴大，茶樹病害發(fā)生呈逐年上升趨勢。

近年來，我國對茶輪斑病病原菌鑒定有陸續(xù)報道，發(fā)現(xiàn)引起該病的病原菌具有多樣性。CHEN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，重慶茶區(qū)茶輪斑病病原為P.chamaeropis；WANG等[7]分離出P.chamaeropis、P.kenyana、P.rhodomytus、P.sichuanenbsis及P.camelliae等病原菌均能引起茶輪斑病。茶輪斑病是一種主要危害成葉和老葉，在嫩葉和葉梢也常有發(fā)生的嚴重影響茶葉產(chǎn)量和質量的病害[10-11]，在高溫高濕等氣候影響下，茶輪斑病容易大面積發(fā)生[8-11]。對于該病的防控，主要采取化學藥劑和拮抗菌的防治方法。郭世保等[12]通過室內藥劑篩選發(fā)現(xiàn)，藥劑阿米西達和世高對茶輪斑病具有較好的田間防控效果；洪永聰?shù)萚13]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌(Bacillussp.)可抑制茶輪斑病病原菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)。

2020年7月，筆者在貴州省銅仁市石阡縣進行田間調查時發(fā)現(xiàn)茶樹上一種葉片病害，該病害主要表現(xiàn)為在成葉和老葉上常形成同心輪紋病斑，黃褐色，輪紋中央散生黑色圓形顆粒。為明確該病的病原菌并為其防控提供參考，采用單孢分離法從病葉上分離、純化病原菌，結合形態(tài)學和分子生物學方法對其進行鑒定及致病性測試。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶樹病害標本 2020年7月采自貴州省銅仁市石阡縣五德鎮(zhèn)長興村茶場。標本置于信封，貼上標簽(注明采集時間、地點、經(jīng)緯度、采集人等)后密封，帶回實驗室進行分離鑒定。

1.1.2 試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，燕麥瓊脂(OA)培養(yǎng)基，滅菌后備用[14]；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；引物ITS4(5’-TCCTCCGCTT

ATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAA

GTCGTAACAAGG-3’)[15]，EF1-526F(5’-GTCGT

YGTYATYGGHCAYGT-3’)和EF1-1567R(5’-ACHGTRCCRATACCACCRATCT T-3’)[16-17]，BT2A(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’)和BT2B(5’-ACCCTCAGTGTA GTGACCC TTGGC-3’)[17-18]，均由重慶擎科生物技術有限公司合成。

1.1.3 儀器設備 GL100DP立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，致徽(廈門)儀器有限公司；SJ-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺，蘇潔醫(yī)療機械(蘇州)有限公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司；LEICA DM4B光學顯微鏡，北京瑞科中儀科技有限公司；T100 Thermal Cycling PCR 儀，BIORED；WGL-65B電熱鼓風干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用單孢分離法對病原菌進行分離[19]；將菌絲接種至PDA培養(yǎng)基中進行菌絲純化。研究標本及分離所得菌株均保存于貴州省農業(yè)科學院生物技術研究所。

1.2.2 致病性測定 對分離的菌株SQ-20-1采用針刺法進行致病性測定。菌株在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，用直徑6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅回接至刺傷的福鼎大白茶葉片上，菌絲面接觸葉片，外蓋一層無菌水浸泡的無菌脫脂棉用以保濕。以接種無菌PDA培養(yǎng)基作空白對照。將接種后的葉片置于25℃光照培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，3 d后去掉菌餅和無菌脫脂棉并記錄發(fā)病情況。每個處理3次重復。

1.2.3 形態(tài)學觀察 將供試菌株轉接至PDA和OA培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，待菌落產(chǎn)孢后，制作合格玻片放于光學顯微鏡觀察分生孢子梗及產(chǎn)孢細胞等的形態(tài)結構。測量30個產(chǎn)孢細胞及40～50個分生孢子的大小并取平均值。

1.2.4 DNA的提取與PCR擴增及測序 先用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌的DNA。然后采用ITS4/ITS5、EF1-526F/EF1-1567R和BT2A/BT2B進行PCR擴增。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度。最后送樣至重慶擎科生物技術有限公司進行DNA測序。

1.2.5 多基因系統(tǒng)學分析 用Bioedit檢測和拼接基因序列，拼接后的序列上傳至美國國立生物技術信息中心(NCBI)進行比對，確定其屬的劃分。從GenBank中下載相關序列(表1)，用Bioedit 7.0.9.0和ClustalX 1.81將序列進行對齊(Alignment)以及必要的手工比對[20-21]。采用最大簡約法(Maximum Parsimony，MP)[22]和最大似然法 (Maximum Likelihood，ML)[23]聯(lián)合ITS、β-tubulin和tef1的擴增基因片段進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

表1 用于構建系統(tǒng)進化樹的菌株及 GenBank 登錄號

續(xù)表1

2 結果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學鑒定

田間調查發(fā)現(xiàn)，該病害主要危害茶樹的成葉和老葉。從圖1看出，該病原菌多由葉緣或葉尖開始侵染，病斑初期呈黃褐色小斑，后漸擴展成圓形或橢圓形褐色病斑，病斑中央隆起并產(chǎn)生輪紋，灰白色至褐色，沿輪紋產(chǎn)生黑色圓形小顆粒。病原菌在25℃下培養(yǎng)7 d，菌落直徑達8 cm；菌落初期毛絨狀/絮狀，白色，背面白色至淡黃色。菌落中央散生黑色、圓形分生孢子盤，其上產(chǎn)生墨汁滴狀黏液。產(chǎn)孢細胞呈棍棒狀，透明，大小為(10.4～18.3) μm×(1.2～4.2) μm。分生孢子由5個細胞組成，大小(18.5～25.0) μm×(4.5～6.2) μm，梭形或紡錘形，兩端細胞無色，倒錐形，中間3個細胞淺褐色至暗褐色，13.1～17.5 μm；分生孢子具4隔膜，分隔處稍縊縮，顏色亦深；分生孢子頂端著生2～3根附著絲，長9.0～17.8 μm，基部著生1根附著絲，長3.8～14.0 μm。根據(jù)以上形態(tài)學特征，鑒定該菌為擬盤多毛孢屬真菌(P.trachicarpicola)。

2.2 致病性測定

從圖2看出，將分離所得菌株SQ-20-1直徑6 mm的菌餅回接至刺傷的茶葉片上，3 d后可見明顯黑褐色病斑，隨后病斑擴大，7 d后病斑處產(chǎn)生分生孢子盤。刺傷接種PDA培養(yǎng)基餅的對照葉片在 7 d后僅出現(xiàn)機械損傷。將發(fā)病的茶樹葉片進行病原菌再分離，獲得的分離菌株與原病原菌株形態(tài)特征一致。因此，根據(jù)柯赫式法則可以確定，供試菌株SQ-20-1是引起茶輪斑病的病原菌。

2.3 分子生物學鑒定

對分離所得菌株SQ-20-1的DNA的ITS、tef1及β-tubulin序列進行PCR擴增和測序，獲得長度分別為526 bp、552 bp和460 bp的片段。利用NCBI中BLAST進行同源性比對，菌株SQ-20-1與P.trachiaarpicola具有較高同源性，二者ITS、tef1、β-tubulin序列的同源性分別達99.8%、100%

和100%。聯(lián)合ITS、β-tubulin及tef1共3個基因片段構建最大簡約/最大似然樹形圖(圖3)，供試菌株SQ-20-1與P.trachicarpicola(菌株號OP068、MFLUCC 12-0264、MFLUCC 12-0265、MFLUCC 12-0267)聚集為1支，自舉支持率高達66/97。因此，結合形態(tài)學和分子生物學特征，確定菌株SQ-20-1為棕櫚擬盤多毛孢(P.trachicarpicola)。

3 結論與討論

擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)是一種常見且分布廣泛的植物病原菌，可引起多種植物病害，如小孢擬盤多毛孢(P.microspora)可引起核桃、白術葉枯病[24-25]；P.Neglecta引起樟子松針黑斑病[26]；棒形孢擬盤多毛孢(P.clavispora)可引起藍莓葉斑病[27]；茶擬盤多毛孢(P.theae)可引起茶輪斑病[28]；棕櫚擬盤多毛孢(P.trachicarpicola)可引起葡萄枝干病害和果實軟腐病[29]。對于擬盤多毛孢屬的分類地位，在傳統(tǒng)的分類鑒定中，僅依據(jù)形態(tài)特征和ITS單基因序列對其分析鑒定[30]。MAHARACHCHIKUMBUR等[31]研究發(fā)現(xiàn)，ITS基因無法很好地區(qū)分擬盤多毛孢屬內的近似及其親源種，聯(lián)合ITS、β-tubulin和tef1基因可有效區(qū)分屬內種的親源關系；聯(lián)合此3個基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對擬盤多毛孢屬的分類地位進行修訂，并從此屬內劃分出新擬盤多毛孢屬和假擬盤多毛孢屬真菌。

該研究通過單孢分離、菌株純化及致病性試驗，結合形態(tài)學分析及聯(lián)合ITS、β-tubulin和tef1基因的分子生物學分析確定，從茶樹病斑處分離得到的菌株為棕櫚擬盤多毛孢(P.trachicarpicola)，且其是引起茶輪斑病的病原菌。