張海樅，邢雪霞，牛莉莉，魯宇童，張 林，劉 園*

(1.河南省煙草公司 南陽市公司，河南 南陽 473000； 2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450000； 3.紅云紅河集團(tuán) 昆明卷煙廠，云南 昆明 650000)

茉莉酸甲酯(MeJA)是脂質(zhì)衍生化合物，是植物應(yīng)激反應(yīng)和發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)化合物，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要的影響[1]。茉莉酸(JA)及其衍生物由在葉綠體膜的半乳糖脂中酯化的α-亞麻酸合成，物理損傷與逆境環(huán)境刺激可導(dǎo)致α-亞麻酸的產(chǎn)生與釋放，從而增加植物體內(nèi)茉莉酸的含量。LIU等[2-5]研究發(fā)現(xiàn)，噴施外源MeJA能夠增強(qiáng)植株對(duì)低溫的抗性，使植株的抗氧化酶活性提高、丙二醛含量下降，也可通過提高抗寒轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量從而提高植株的抗寒性，保護(hù)低溫下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。MeJA還參與腺毛的分泌，腺毛對(duì)植株防御干旱及低溫等逆境具有重要作用[6]。

煙草是原產(chǎn)于熱帶亞熱帶的喜溫作物，低溫環(huán)境嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育[7]。低溫下葉綠體類囊體膜通透性增強(qiáng)致使細(xì)胞脫水及離子外泄，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)受損和膜脂過氧化等不良影響。隨著低溫環(huán)境時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠體形態(tài)發(fā)生變化，光合色素含量顯著降低，進(jìn)而使細(xì)胞代謝紊亂，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)平衡被破壞時(shí)，細(xì)胞便會(huì)萎蔫，最終導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻。近年來，溫度變化趨勢(shì)使得低溫環(huán)境愈發(fā)嚴(yán)峻，已成為限制作物生長(zhǎng)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境因素[8-9]。K326和豫煙6號(hào)是河南烤煙生產(chǎn)的主栽品種，K326適應(yīng)性較強(qiáng)，產(chǎn)質(zhì)量較高，煙葉化學(xué)成分較協(xié)調(diào)[10]，但對(duì)低溫環(huán)境較為敏感[11]。豫煙6號(hào)的外觀質(zhì)量和感官質(zhì)量較好，具有一定的抗旱性和抗病性[12]，但對(duì)其低溫敏感程度未見系統(tǒng)的研究報(bào)道。為此，采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)法，研究外源MeJA對(duì)K326與豫煙6號(hào)幼苗耐冷性的影響，旨在進(jìn)一步闡明外源MeJA應(yīng)對(duì)低溫脅迫的生理機(jī)制，進(jìn)而為MeJA在煙草幼苗上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 烤煙品種 河南烤煙生產(chǎn)的主栽品種K326和豫煙6號(hào)(Y6)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院提供。

1.1.2 試劑 95%茉莉酸甲酯(MeJA)，Sigma試劑公司；過氧化氫、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、核黃素、愈創(chuàng)木酚、硫代巴比妥酸、酸性茚三酮、冰乙酸和蒽酮，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，瑞士TECAN集團(tuán)公司；臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf國(guó)際貿(mào)易有限公司；電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；便攜式Li-6400紅外氣體分析儀，Li-COR,Inc,Lincoln,NE,USA。

1.2 方法

1.2.1 播種及培養(yǎng)條件 煙草種子分別先用10%過氧化氫消毒8 h，再用純水沖洗干凈后播種。培養(yǎng)介質(zhì)為育苗盤和潮濕的工字格海綿，水培營(yíng)養(yǎng)液為Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；人工氣候培養(yǎng)箱環(huán)境：晝夜(28±2)℃/(18±2)℃，光周期為14 h/10 h循環(huán)，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度為22 000 lx。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 當(dāng)煙草長(zhǎng)至4葉一心幼苗時(shí)將其移至蛭石中生長(zhǎng)，保證其根部有足夠大的生長(zhǎng)空間。在煙草幼苗長(zhǎng)至6葉一心時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至水培盒采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，2個(gè)品種試驗(yàn)處理完全相同，試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：CK，正常溫度，噴施等量清水；處理1，MeJA噴施濃度為0 μmol/L(即噴施等量清水)，處理2，MeJA噴施濃度為10 μmol/L；處理3，噴施MeJA濃度為100 μmol/L。3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3株煙苗。處理1～3進(jìn)行3 d正常溫度預(yù)處理，然后進(jìn)行5 d低溫處理(低溫環(huán)境為晝夜11℃/8℃[13-14])，其余條件不變。在此生長(zhǎng)期間每3 d換1次營(yíng)養(yǎng)液，通氧2 h/d，在低溫處理的第5天分別選取2片真葉測(cè)定各生理生化指標(biāo)。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1) 煙草幼苗葉片鮮重、飽和重、干重及相對(duì)含水量。低溫處理第5天后稱量幼苗鮮重，然后放入清水中浸泡24 h充分吸水達(dá)到飽和后，測(cè)量其飽和重。再將幼苗先放入105℃烘箱殺青30 min，接著于70℃環(huán)境中烘干48 h至恒重后稱量其干重。通過鮮重、飽和重和干重計(jì)算葉片的含水量[15]和相對(duì)含水量。

含水量=(鮮重-干重)/鮮重×100%

相對(duì)含水量=(鮮重-干重)/(飽和重-干重)×100%

2) 抗氧化酶活性。取相同葉位葉片0.5 g，加入預(yù)冷的5 mL pH 7.8的磷酸緩沖液進(jìn)行冰浴研磨，并冷凍離心20 min，上清液即酶活性提取液，于4℃冰箱中低溫保存。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)參照文獻(xiàn)[16]的方法測(cè)定。

3) 丙二醛、脯氨酸和可溶性糖。稱取相同葉位煙草葉片0.5 g測(cè)定不同滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[17]測(cè)定，脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮比色法[18]測(cè)定，可溶性糖(WSS)含量采用蒽酮比色法[19]測(cè)定。

4) 光合作用參數(shù)。使用便攜式Li-6400紅外氣體分析儀在低溫處理5 d時(shí)，從9:00-11:00對(duì)煙株自上而下第3片完全展開葉進(jìn)行光合數(shù)據(jù)的測(cè)定，保持葉室溫度維持在26～29℃，光強(qiáng)為 800 μmol/(m2·s)，CO2濃度為 400 μmol/mol。直接測(cè)定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)，并計(jì)算葉片水分利用率(WUE)和氣孔限定值(Ls)。

WUE=Pn/Tr

Ls=1-Ci/Co

式中，Co為CO2的設(shè)定濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MeJA處理低溫下2個(gè)煙草品種幼苗的生物量及相對(duì)含水量

從表1可知，不同處理低溫下K326和Y6的鮮重、干重和相對(duì)含水量的變化。K326：鮮重、干重和相對(duì)含水量均以CK最大，分別為24.14 g、2.33 g和87.96%；處理1最小，分別為10.35 g、1.54 g和78.55%；鮮重CK顯著大于其余處理，其余處理間差異顯著；干重CK顯著大于其余處理，處理1與處理2間和處理2與處理3間差異不顯著；相對(duì)含水量CK顯著大于其余處理，處理1顯著小于其余處理，處理2與處理3間差異不顯著。Y6：鮮重、干重和相對(duì)含水量均以CK最大，分別為25.41 g、2.22 g和88.86%；處理1最小，分別為11.72 g、1.55 g和79.37%；鮮重CK顯著大于其余處理，其余處理間差異顯著；干重和相對(duì)含水量CK均顯著大于其余處理，處理1顯著小于其余處理，處理2與處理3間差異不顯著。

表1 不同濃度外源 MeJA處理低溫下2個(gè)烤煙品種幼苗的生物量及相對(duì)含水量

2.2 外源 MeJA處理低溫下2個(gè)煙草品種幼苗的抗氧化酶活性

從圖1看出，不同處理低溫下K326和Y6幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的變化。

2.2.1 K326 SOD，處理3最高，為204.35 U/g FW；CK最低，為51.92 U/g FW；處理3>處理2>處理1>CK；各處理間差異顯著。POD，處理2最高，為41.95 U/(g·min FW)；CK最低，為27.74 U/(g·min FW)；處理2>處理3>處理1>CK；CK顯著低于其余處理，處理2與處理3顯著高于處理1，二者間差異不顯著。CAT，處理2最高，為33.76 U/(g·min FW)；CK最低，為9.50 U/(g·min FW)；處理2>處理3>處理1>CK；各處理間差異顯著。

2.2.2 Y6 SOD、POD和CAT均以處理2最高，分別為212.54 U/g FW、47.03 U/(g·min FW)和35.85 U/(g·min FW)；CK最低，分別為55.55 U/g FW、30.15 U/(g·min FW)和10.45 U/(g·min FW)；均為處理2>處理3>處理1>CK；SOD、POD和CAT的各處理間差異顯著，CK顯著低于各處理，處理2顯著高于其余處理。

2.3 外源 MeJA處理低溫下2個(gè)煙草品種幼苗可溶性糖(WSS)、丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量的影響

從圖2看出，不同處理低溫下K326和Y6幼苗的可溶性糖(WSS)、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的變化。

2.3.1 K326 WSS和MDA均以處理1最高，分別為1.79%和2.89 μg/g Fw；CK最低，分別為0.29%和0.03 μg/g Fw；均為處理1>處理2>處理3>CK；各處理間差異顯著。Pro處理1最高，為1.58 μmol/g FW；CK最低，為0.09 μmol/g FW；處理1>處理3>處理2>CK；處理1顯著高于其余處理，CK顯著低于其余處理，處理2與處理3差異不顯著。

2.3.2 Y6 WSS、Pro和MDA均以處理1最高，分別為1.66%、1.41 μg/g Fw和2.63 μmol/g FW；CK最低，分別為0.31%、0.09 μg/g和0.03 μmol/g FW；均為處理1>處理3>處理2>CK；各處理間差異顯著。

2.4 外源 MeJA處理低溫下2個(gè)煙草品種幼苗光合作用參數(shù)的變化

從表2看出，不同處理低溫下K326和Y6幼苗的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度等光合作用參數(shù)的變化。凈光合速率：K326和Y6分別為11.85～21.96mmol/(m2·s)和12.89～21.99 mmol/(m2·s)，均為CK>處理2>處理3>處理1；各處理間差異顯著。氣孔導(dǎo)度：K326和Y6分別為0.23～0.50mmol/(m2·s)和0.25～0.51 mmol/(m2·s)，均為CK>處理2>處理3>處理1；各處理間差異顯著。胞間CO2濃度：K326和Y6分別為326.26～357.47 μmol/mol和325.67～354.17 μmol/mol，均為處理1>處理3>處理2>CK；K326各處理間差異顯著，Y6處理2與處理3間差異不顯著，二者與其余處理間差異顯著。蒸騰速率：K326和Y6分別為3.67～5.26 mmol/(m2·s)和3.68～5.31 mmol/(m2·s)，均為CK>處理2>處理3>處理1；各處理間差異顯著。水分利用效率：K326和Y6分別為3.23～4.17 μmol/mol和3.50～4.14 μmol/mol，均為CK>處理2>處理3>處理1；K326各處理間差異顯著，Y6處理2與處理3間差異不顯著，二者與其余處理間差異顯著。氣孔限定值：K326和Y6分別為0.11～0.18和0.11～0.19，均為CK>處理2>處理3>處理1；K326各處理間差異顯著，Y6處理2與處理3間差異不顯著，二者與其余處理間差異顯著。

表2 不同濃度外源處理 MeJA低溫下2個(gè)煙草品種幼苗光合作用參數(shù)的變化

3 結(jié)論與討論

茉莉酸甲酯(MeJA)作用的主要機(jī)理是提高抗氧化酶的活性降低低溫造成的活性氧積累，進(jìn)而使細(xì)胞保持完整性。研究結(jié)果表明，MeJA是響應(yīng)脅迫環(huán)境的信號(hào)分子，能夠有效地抑制K326和Y6幼苗在低溫環(huán)境下的損傷，低溫下2個(gè)品種幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育均會(huì)受到不同程度的抑制，Y6抵御低溫的能力略好于K326。K326和Y6的鮮重、干重和相對(duì)含水量均以正常溫度處理最大，分別為24.14 g、2.33 g、87.96%和10.35 g、1.54 g、78.55%；低溫MeJA 0 μmol/L最小，分別為10.35 g、1.54 g、78.55%和11.72 g、1.55 g、79.37%。K326的超氧化物歧化酶(SOD)為低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L>正常溫度，過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)均為低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L>正常溫度；Y6的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性均為低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>MeJA 0 μmol/L>正常溫度。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物逆境脅迫中占有重要位置，其指標(biāo)含量表示對(duì)逆境的反應(yīng)程度[20]。丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，用于表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對(duì)逆境反映的強(qiáng)弱。研究結(jié)果表明，K326的可溶性糖(WSS)和丙二醛(MDA)含量均為低溫MeJA 0 μmol/L>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>正常溫度，Pro為MeJA 0 μmol/L>MeJA 100 μmol/L>MeJA 10 μmol/L>正常溫度。Y6的WSS、Pro和MDA均為MeJA 0 μmol/L>MeJA 100 μmol/L>MeJA 10 μmol/L>正常溫度。表明，茉莉酸甲酯能夠促進(jìn)低溫下煙草對(duì)可溶性糖和脯氨酸的積累，減少丙二醛的積累。

研究結(jié)果表明，K326和Y6幼苗在低溫環(huán)境下的SOD、POD和CAT含量都顯著上升，并且在10 μmol/L MeJA處理時(shí)二者的抗氧化酶系統(tǒng)含量達(dá)最高。即外源MeJA的噴施會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)，使得抗氧化酶含量迅速上升，以減少脂膜過氧化的產(chǎn)生。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也是緩解逆境的重要組成成分[21]?？扇苄蕴?、脯氨酸能夠維持酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和細(xì)胞滲透勢(shì)的水平，陳璇等[22]研究表明，短時(shí)間的低溫脅迫下，植物細(xì)胞組織液滲透濃度越高，其對(duì)寒冷的響應(yīng)速度越快，抗寒性越強(qiáng)。丙二醛是衡量植物脅迫情況下生長(zhǎng)狀況重要的生理指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫下外源MeJA處理能夠提高可溶性糖和脯氨酸的積累，使其含量維持在較高的水平，增加細(xì)胞的持水力，防止植物組織受到冷害，也減少其MDA含量，有利于植物維持一定的滲透勢(shì)進(jìn)而提高煙草幼苗的耐冷性。

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育、積累干物質(zhì)和產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，低溫環(huán)境會(huì)對(duì)光合作用產(chǎn)生不良影響。徐田軍等[23]研究表明，在低溫環(huán)境下導(dǎo)致光合作用降低的原因有兩方面：一是在輕度低溫脅迫時(shí)，氣孔因素導(dǎo)致植物光合作用降低，主要是植株葉片氣孔擴(kuò)散的阻力增加，氣孔導(dǎo)度降低，進(jìn)而吸收的二氧化碳含量降低，使產(chǎn)物運(yùn)輸途徑受阻，最終導(dǎo)致凈光合速率下降；二是在重度脅迫時(shí)，非氣孔因素導(dǎo)致植物光合作用降低，具體表現(xiàn)為當(dāng)光化學(xué)活性和RUBP羧化等受到限制時(shí)，阻礙二氧化碳的利用，從而造成細(xì)胞中的二氧化碳含量積累，而凈光合速率、氣孔導(dǎo)度仍然呈下降趨勢(shì)。胞間二氧化碳濃度的變化趨勢(shì)隨著脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短而變化，通常呈先降后升趨勢(shì)。研究結(jié)果表明，在低溫環(huán)境處理5 d后，K326和Y6不同處理凈光合速率分別為11.85～21.96 mmol/(m2·s)和12.89～21.99 mmol/(m2·s)，均為正常溫度>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L；胞間CO2濃度分別為326.26～357.47 μmol/mol和325.67～354.17 μmol/mol，均為低溫MeJA 0 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 10 μmol/L>正常溫度；蒸騰速率分別為3.67～5.26 mmol/(m2·s)和3.68～5.31 mmol/(m2·s)，均為正常溫度>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L；水分利用效率分別為3.23～4.17 μmol/mol和3.50～4.14 μmol/mol，均為正常溫度>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L；氣孔限定值分別為0.11～0.18和0.11～0.19，均為正常溫度>低溫MeJA 10 μmol/L>低溫MeJA 100 μmol/L>低溫MeJA 0 μmol/L。氣孔的關(guān)閉雖然也是低溫造成葉片光合速率降低的原因，但胞間CO2濃度的上升和氣孔限定值的下降表明，煙草葉片光合速率下降的主要原因是葉肉細(xì)胞光合活性降低以及非氣孔因素所致，與衛(wèi)丹丹等[24-25]的研究一致。說明經(jīng)低溫脅迫后，2個(gè)品種的光合作用降低，而外源MeJA能夠?qū)煵萦酌绲墓夂蠙C(jī)構(gòu)起保護(hù)作用；MeJA能夠抵抗低溫脅迫。K326在外源MeJA濃度為100 μmol/L時(shí)光合參數(shù)最接近正常溫度處理，Y6在外源MeJA濃度為10 μmol/L時(shí)光合參數(shù)最接近正常溫度處理。2個(gè)品種的光合參數(shù)與生物量、相對(duì)含水率變化程度一致，說明不同的品種對(duì)外源物質(zhì)存在劑量效應(yīng)。