高　越

復(fù)方黃芪白術(shù)藥對的發(fā)酵研究

高越

（衡水學(xué)院河北衡水053000）

復(fù)方黃芪白術(shù)是常用的中藥藥對，黃芪、白術(shù)均為補氣類中藥，都能起到免疫調(diào)節(jié)作用，在畜牧業(yè)應(yīng)用廣泛。用枯草芽孢桿菌發(fā)酵黃芪白術(shù)藥對，采用蒽酮-硫酸法測量發(fā)酵前后的多糖含量，以多糖含量為指標(biāo)設(shè)計正交試驗。試驗結(jié)果表明，發(fā)酵時間4 d、接菌量4％、含水量50％、發(fā)酵溫度32 ℃是最佳發(fā)酵條件，該條件下發(fā)酵復(fù)方黃芪白術(shù)的多糖含量為18.32％，與發(fā)酵前相比提高了44.59％。

黃芪白術(shù)藥對；中藥發(fā)酵；枯草芽孢桿菌；多糖

中草藥作為飼料添加劑在畜牧業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景，與抗生素類添加劑相比具有毒副作用小、無耐藥性、無殘留、經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)勢，在動物保健、提高畜禽生產(chǎn)性能、改善畜禽產(chǎn)品質(zhì)量和提升飼草料品質(zhì)等方面具有重要作用[1]。傳統(tǒng)中藥炮制方法效率較低，利用微生物發(fā)酵中草藥，更容易破壞植物細(xì)胞壁使細(xì)胞破裂，釋放其中的活性物質(zhì)。中藥發(fā)酵技術(shù)能夠增加中草藥有效成分的利用率，提高藥效，降低藥物毒副作用，修飾中草藥活性成分[2]。

中藥黃芪、白術(shù)為常用的補氣藥，二者配對應(yīng)用，具有較高的研究價值。黃芪、白術(shù)具有增強動物免疫力和恢復(fù)受免疫抑制動物免疫力的效用，張槐以雛雞為試驗動物，考察試驗藥物對新城疫疫苗抗體水平的影響，黃芪與白術(shù)比例為1:1時，雛雞ND抗體水平最高，具有較好的免疫增強作用[3]。本試驗用枯草芽孢桿菌對復(fù)方黃芪白術(shù)進行發(fā)酵，研究發(fā)酵后主要活性成分多糖的含量變化情況，為中藥發(fā)酵技術(shù)在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

黃芪、白術(shù)、枯草芽孢桿菌由衡水學(xué)院發(fā)酵工程實驗室提供，葡萄糖、乙醇、LB培養(yǎng)基、蒽酮、濃硫酸、鹽酸等試劑購于衡水瑞豐化玻儀器有限公司。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計、中藥粉碎機、烘箱、電子天平、水浴鍋、恒溫?fù)u床、雙人凈化工作臺等儀器由衡水學(xué)院食品學(xué)實驗室提供。

2 試驗方法

2.1 中草藥預(yù)處理

黃芪、白術(shù)烘干后粉碎過篩，按照黃芪：白術(shù)=1：1的比例配比，混合均勻后在超凈工作臺中紫外滅菌。

2.2 培養(yǎng)基的配制

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 gL、酵母提取物5 gL、氯化鈉10 gL、去離子水，在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

2.3 枯草芽孢桿菌種子液的制備

將冷凍保存的枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，得到枯草芽孢桿菌種子液。

2.4 接種發(fā)酵

在種子液中加入適量無菌水充分混合均勻，取出準(zhǔn)備好的黃芪白術(shù)中藥基質(zhì)，邊攪拌邊加入菌液中。接種完成后于恒溫培養(yǎng)箱中在一定溫度下發(fā)酵若干天。

2.5 單因素試驗

本試驗選取發(fā)酵時間、接菌量、含水量、發(fā)酵溫度4 個因素，分析各因素對黃芪白術(shù)藥對中多糖含量的影響。

2.6 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時間、接菌量、含水量、發(fā)酵溫度為試驗因素，分別取3 個水平，以發(fā)酵后黃芪白術(shù)藥對的多糖含量為指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交試驗。

2.7 多糖含量的測定

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別準(zhǔn)確吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4 mL該溶液于具塞試管中，分別加蒸餾水使體積為2 mL，加入8 mL新配制的蒽酮-濃硫酸溶液，震蕩混合均勻后，各試管同時沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫后，在625 nm處檢測其吸光度。根據(jù)測量結(jié)果以葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程：=8.301 8 x+0.014 9，相關(guān)系數(shù)2=0.999 6。

水提醇沉法提取樣品中的粗多糖，配制成多糖溶液，準(zhǔn)確吸取2 mL多糖溶液于具塞試管中，按制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作測定625 nm處的吸光度，計算樣品多糖含量。

3 結(jié)果分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 不同發(fā)酵時間對多糖含量的影響

發(fā)酵時間分別3 d、4 d、5 d、6 d、7 d時，發(fā)酵黃芪白術(shù)藥對的多糖含量分別為16.21%、17.50%、16.94%、16.03%、15.57%。發(fā)酵時間3 d時多糖含量達到最高，之后隨時間降低，試驗得到最佳發(fā)酵時間為3 d。

3.1.2 不同接菌量對多糖含量的影響

接菌量分別2%、4%、6%、8%、10%時，多糖含量分別為15.23%、17.78%、17.11%、16.64%、16.04%。接菌量為4%時多糖含量最高，之后隨接菌量的增加而降低，試驗得到最佳接菌量為4%。

3.1.3 不同含水量對多糖含量的影響

含水量分別30%、40%、50%、60%、70%時，多糖含量分別為16.83%、17.10%、17.66%、16.83%、15.82%。含水量為50%時多糖含量最高，之后隨含水量的增加而降低，最佳含水量為50%。

3.1.4 不同發(fā)酵溫度對多糖含量的影響

發(fā)酵溫度分別28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃時，多糖含量分別為14.87%、15.92%、17.45%、17.02%、16.08%。發(fā)酵溫度為32 ℃時多糖含量最高，之后隨發(fā)酵溫度的升高而降低，最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

3.2 正交試驗結(jié)果

以多糖含量為指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵黃芪白術(shù)藥對的工藝。正交試驗的測定結(jié)果見表1，顯著性分析見表2。

表1　正交試驗對多糖含量測定結(jié)果的影響分析

表2　正交實驗對多糖含量測定結(jié)果影響的顯著性分析

分析表1、表2可知，發(fā)酵時間、接菌量、含水量對多糖含量均有顯著性影響，各因素對多糖含量影響的強弱順序為：發(fā)酵時間＞接菌量＞含水量＞發(fā)酵溫度。確定各因素的最優(yōu)組合為A3B2C2D2，即優(yōu)化的發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時間4 d、接菌量4％、含水量50％、發(fā)酵溫度32 ℃。

3.3 驗證試驗

以最優(yōu)發(fā)酵工藝組合A3B2C2D2進行三組驗證試驗，三次結(jié)果取平均值，測得發(fā)酵后復(fù)方黃芪白術(shù)藥對的多糖含量為18.32％，與正交試驗的最高值17.56％相比提高了4.33%。與未經(jīng)發(fā)酵的復(fù)方黃芪白術(shù)多糖含量12.67％相比提高了44.59％。

4 討論

通過正交試驗確定了枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方黃芪白術(shù)的最佳條件為：發(fā)酵時間4 d、接菌量4％、含水量50％、發(fā)酵溫度32 ℃。在該條件下發(fā)酵復(fù)方黃芪白術(shù)，測得多糖含量為18.32％，與發(fā)酵前相比提高了44.59％。結(jié)果表明，通過微生物發(fā)酵技術(shù)可以有效提高復(fù)方黃芪白術(shù)藥對的多糖含量。發(fā)酵中草藥應(yīng)用在畜牧業(yè)中，具有無殘留、低毒性、經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)勢。黃芪多糖和白術(shù)多糖具有增強動物機體免疫力、提高動物生長性能、調(diào)節(jié)機體代謝的作用，在動物生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[4-5]。應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵復(fù)方黃芪白術(shù)藥劑，可以有效提高其主要活性成分多糖的含量，從而達到提高藥效及利用率的效果。

[1]池永寬,劉旭光,熊康寧,等.中草藥飼料添加劑應(yīng)用研究進展[J].中國野生植物資源,2020(9):57-63.

[2]艾素,湯偉,郭若琳,等.微生物發(fā)酵中草藥及其活性物質(zhì)的研究進展[J].中國中藥雜志,2019(6):1110-1118.

[3]張槐.復(fù)方芪術(shù)顆粒的研制及其免疫增強作用研究[D].揚州:揚州大學(xué),2019.

[4]史洪濤.黃芪-枯草芽孢桿菌發(fā)酵制劑的制備及其在肉雞上的應(yīng)用研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[5]胡曉蕾,胡迎利,汪以真.白術(shù)及白術(shù)多糖對SD大鼠生長性能和免疫功能的影響[J].中國獸醫(yī)雜志,2016(1):2-6.

衡水市科技計劃項目，復(fù)方黃芪白術(shù)藥對微生物發(fā)酵研究（NO：2019014029Z）

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.12.11

R289.1

A

2095-1205(2020)12-22-02