覃湘婕，孫寧與，李春堯，楊 榮，吳永寶*

（1.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，甘肅 蘭州 730010；2.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州 730010）

1885年，在霍亂流行時(shí)分離到豬霍亂沙門(mén)氏菌，定名為沙門(mén)氏菌屬（Salmonellasp.）。沙門(mén)氏菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，種類(lèi)繁多，目前已檢測(cè)出2 500多種沙門(mén)氏菌血清型[2]。沙門(mén)氏菌是一種革蘭氏陰性的腸道桿菌，不但能顯性或隱性感染動(dòng)物，而且能通過(guò)污染的動(dòng)物源性食品造成人的食物中毒，嚴(yán)重危害公共健康安全。根據(jù)歐洲食品安全局（European Food Safety Agency，EFSA）統(tǒng)計(jì)，歐洲每年有超過(guò)10萬(wàn)例的人類(lèi)沙門(mén)氏菌病[3]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）統(tǒng)計(jì)顯示，在美國(guó)每年的沙門(mén)氏菌感染已經(jīng)增加到1 200萬(wàn)人，引起大約1.9萬(wàn)人住院甚至450人死亡[3]。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)由沙門(mén)氏菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的首位。目前沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法、分子生物學(xué)方法以及近年來(lái)多學(xué)科聯(lián)合應(yīng)用的新型檢測(cè)方法，如生物傳感器技術(shù)、納米技術(shù)、基于適配體檢測(cè)技術(shù)等，這些方法為進(jìn)行沙門(mén)氏菌的準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測(cè)提供了方向。本文對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，為沙門(mén)氏菌病的檢測(cè)和防控提供參考。

1 傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法

傳統(tǒng)生理生化方法的檢測(cè)過(guò)程包括樣品預(yù)增菌、增菌、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定，具有較高的準(zhǔn)確性，是國(guó)際和國(guó)內(nèi)食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[4]。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 6579《食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)—沙門(mén)氏菌檢測(cè)的基準(zhǔn)方法》[5]、GB4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》[6]分別是目前用于食品中沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，但是在沙門(mén)氏菌病的應(yīng)急處理中經(jīng)常需要盡快得到檢測(cè)結(jié)果，傳統(tǒng)生理生化方法的檢測(cè)周期約4～7 d，操作繁瑣，更多依靠于主觀判定，并且腸桿菌科的生化鑒定具有交叉性，在檢測(cè)速度、特異性、敏感性等方面有一定的局限性。

顯色培養(yǎng)基法和添加物質(zhì)法均可以加快病原菌的分離和鑒定，其中利用顯色培養(yǎng)基法進(jìn)行檢測(cè)后結(jié)果準(zhǔn)確，并易于判定，該方法已經(jīng)被收錄于GB/T 4789.4—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》及以后版本的標(biāo)準(zhǔn)中[7]，但是具有較高的實(shí)驗(yàn)成本；添加物質(zhì)法可以縮短檢測(cè)時(shí)間至2 d[8]。疏水網(wǎng)膜法可以提高病原菌的富集效率，該方法操作更為簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間縮短至3 d[9]。以上改進(jìn)方法明顯縮短了沙門(mén)氏菌的檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)限，但是無(wú)法徹底解決傳統(tǒng)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣的問(wèn)題。因此需要研究準(zhǔn)確、方便的沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)方法。

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)技術(shù)是以免疫學(xué)為理論基礎(chǔ)利用抗原抗體的特異性反應(yīng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行放大檢測(cè)的一種方法，具有靈敏性較高、檢測(cè)時(shí)間短、高通量的優(yōu)點(diǎn)，因此在食品微生物檢測(cè)中得到普遍應(yīng)用。

2.1 酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）最早是于1977年首次應(yīng)用以檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌，目前已經(jīng)成為沙門(mén)氏菌檢測(cè)中的常用免疫分析技術(shù)，它是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶的催化作用相結(jié)合來(lái)檢測(cè)特異性抗原[10]。ELISA主要包括直接ELISA、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA及競(jìng)爭(zhēng)ELISA等[7]。ELISA法的檢測(cè)效率高于傳統(tǒng)檢測(cè)法，但也需要長(zhǎng)時(shí)間增菌，操作中會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，并且ELISA難以檢測(cè)多種病原。該技術(shù)目前需要研究具有高特異性的重組抗原，并能進(jìn)行多種標(biāo)記的全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)。伍燕華等[11]用抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體和抗沙門(mén)氏菌單克隆抗體C1359建立了沙門(mén)氏菌的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，可以快速檢測(cè)A、B、C、D、E等五種典型沙門(mén)氏菌，最低可以檢測(cè)的沙門(mén)氏菌純培養(yǎng)液濃度為1×104CFU/mL。WILANEE C等[12]將具有大表面積和良好生物相容性的SWCNT作為鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的載體，建立成一個(gè)Ab/SWCNTs/HRP結(jié)構(gòu)的信號(hào)放大探針，以此探針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法的靈敏度是傳統(tǒng)ELISA法的1 000倍。方一臻[13]將外膜蛋白PagC進(jìn)行重組純化，經(jīng)過(guò)各條件優(yōu)化建立了檢測(cè)沙門(mén)氏菌抗原的間接ELISA方法，該方法重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、可以應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的主要血清型中。何一欣[14]經(jīng)過(guò)篩選得到了腸炎沙門(mén)氏菌的納米抗體，并建立了檢測(cè)牛奶樣品中腸炎沙門(mén)氏菌的雙抗體夾心ELISA方法，靈敏度為1～10 CFU/mL，為快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌提供了技術(shù)支持。

2.2 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique，IFT）的基本原理是將熒光色素標(biāo)記在抗體（抗原）上，與對(duì)應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下發(fā)出可見(jiàn)熒光，從而定性檢測(cè)抗原（抗體）。熒光物種類(lèi)一般有異硫氰酸熒光素、羅丹明熒光素、二氯三嗪基氨基熒光素等。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，特異性好，但缺點(diǎn)是會(huì)產(chǎn)生非特異性染色[8]，敏感性較低[7]。WANG B B等[15]建立了一種檢測(cè)蛋殼上沙門(mén)氏菌的高特異性免疫熒光法，該方法將熒光強(qiáng)度高、水溶性好的CdTe量子點(diǎn)作為標(biāo)記物與沙門(mén)氏菌抗體結(jié)合，量子點(diǎn)標(biāo)記抗體與沙門(mén)氏菌發(fā)生特異性反應(yīng)，最低檢出限為1×102CFU/mL。PANDEY S K等[16]建立了一個(gè)檢測(cè)傷寒沙門(mén)氏菌的新型夾心熒光免疫分析方法，以抗Vi莢膜多糖抗體為捕獲劑，以陽(yáng)離子受體分子多黏菌素B為粘結(jié)劑，檢出限為10 CFU/mL。夏圣等[17]以納米熒光碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）這一新型納米材料作為免疫示蹤材料來(lái)檢測(cè)樣品中乙型副傷寒沙門(mén)氏菌。該方法將抗沙門(mén)氏菌Ha因子抗體與CDs耦聯(lián)制備出免疫納米熒光碳點(diǎn)，并將抗沙門(mén)氏菌O4因子抗體與磁珠粒耦聯(lián)進(jìn)行樣品中乙型副傷寒沙門(mén)氏菌的富集后，再與免疫熒光碳點(diǎn)產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，形成抗O4-磁珠-細(xì)菌-抗Ha-CD免疫復(fù)合物。使用免疫親和分離液從復(fù)合物中除去磁珠粒，通過(guò)檢測(cè)分離液中CDs的熒光強(qiáng)度來(lái)推算樣品中病原菌的量。此方法的檢測(cè)下限為103CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間約2 h。

2.3 免疫磁性分離技術(shù)

由于食品樣品經(jīng)常為固液多相混合態(tài)，采用傳統(tǒng)方法難以分離出少量致病菌。免疫磁性分離技術(shù)（immunomagnetic separation technique，IST）是將磁性顆粒與抗體特異性偶聯(lián)，偶合物與樣品中致病微生物進(jìn)行特異性結(jié)合，結(jié)合了致病微生物的磁珠在磁場(chǎng)的作用下向磁極方向移動(dòng)，與樣品處理液分開(kāi)，得到濃集的致病菌。此技術(shù)提高了病原的濃縮效率，經(jīng)常與免疫學(xué)、生物學(xué)等技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，具有更高的靈敏度和特異性，并且不需要前增菌步驟，檢測(cè)時(shí)間縮短至僅為幾小時(shí)[18]。申靜等[19]將結(jié)合了沙門(mén)氏菌單抗的羧基磁珠作為免疫磁珠，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）納米探針，建立一種快速方法來(lái)進(jìn)行樣品中沙門(mén)氏菌的特異性檢測(cè)。李亞茹等[20]用納米磁珠結(jié)合抗沙門(mén)氏菌多克隆抗體，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化建立了免疫磁珠分離方法。并根據(jù)沙門(mén)氏菌ttr基因合成引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）方法。將這兩種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了高效、靈敏地檢測(cè)蝦中沙門(mén)氏菌。免疫磁性技術(shù)具有選擇性分離、快速濃縮的優(yōu)點(diǎn)，是綜合磁載體技術(shù)和免疫學(xué)的一項(xiàng)重要檢測(cè)技術(shù)。

2.4 免疫層析法

免疫層析法（immunochromatography assay，ICA）的原理是將抗體固定在硝酸纖維素膜的某區(qū)域，再將樣品浸入干燥的硝酸纖維素膜一端，樣品在毛細(xì)管的作用下沿該膜移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中的抗原會(huì)特異性地結(jié)合抗體，采用酶染色或膠體金使發(fā)生免疫反應(yīng)的區(qū)域顯色，來(lái)進(jìn)行病原體的特異性檢測(cè)。該技術(shù)以免疫滲透為基礎(chǔ)，具有簡(jiǎn)單快速、成本低廉、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)[7]，但也存在靈敏度較低、無(wú)法定量的問(wèn)題。劉志科等[21]建立了一種雞白痢沙門(mén)氏菌抗體檢測(cè)的膠體金免疫層析法，該方法將invA基因進(jìn)行原核表達(dá)并純化，將山羊抗體IgY用30 nm膠體金溶液標(biāo)記，分別包被于NC膜上作為檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)。該方法準(zhǔn)確度高、方便快速。李倩茹等[22]建立了以熒光微球?yàn)闃?biāo)記物的熒光微球免疫層析檢測(cè)法，將抗體與羧基化的磁性微球偶聯(lián)，再將熒光微球免疫層析法與抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠相結(jié)合以濃縮和檢測(cè)食品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌。該法具有快速、特異、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。

2.5 免疫組織化學(xué)法

免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）也稱(chēng)為免疫細(xì)胞化學(xué)法，是指特異性抗體經(jīng)過(guò)顯色劑標(biāo)記后與組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行特異性結(jié)合并產(chǎn)生呈色反應(yīng)，以對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性、定量檢測(cè)的一種方法。此方法通過(guò)利用熒光顯微鏡、電子顯微鏡對(duì)細(xì)胞、亞細(xì)胞水平的抗原物質(zhì)（病原體、多肽、蛋白質(zhì)、激素、酶等）進(jìn)行顯像和放大來(lái)檢測(cè)各種抗原，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、適用廣泛的優(yōu)點(diǎn)。免疫組織化學(xué)技術(shù)主要包括免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)。黃策等[23]利用紅細(xì)胞吸附免疫熒光技術(shù)解決了熒光免疫快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌中雜菌的干擾，但是該技術(shù)中的紅細(xì)胞使用前必須先用抗體致敏，并且紅細(xì)胞上由于抗體少，針對(duì)病原菌含量少的樣品可能會(huì)出現(xiàn)假陰性。他們后來(lái)建立了玻片固相抗體吸附免疫熒光技術(shù)，此技術(shù)是在顯微鏡載玻片上固定抗菌抗體和未致敏紅細(xì)胞，其中抗體吸附病原菌，紅細(xì)胞僅作為熒光顯微鏡鏡檢的指示物。該技術(shù)與紅細(xì)胞吸附免疫熒光法相比敏感性更高，并且配制試劑更簡(jiǎn)便，易于在基層單位推廣。

2.6 免疫擴(kuò)散法

免疫擴(kuò)散法（immunodiffusion，ID）是在抗原抗體的免疫沉淀反應(yīng)基礎(chǔ)上將瓊脂作為惰性載體，通過(guò)比較沉淀與抗原濃度的關(guān)系，可以定量檢測(cè)樣品中抗原（蛋白質(zhì)）含量。免疫擴(kuò)散法包括環(huán)狀免疫單擴(kuò)散法和雙向擴(kuò)散法。FELDSINE P T等[24]將改良免疫擴(kuò)散法與《細(xì)菌分析手冊(cè)》中方法進(jìn)行比較來(lái)檢測(cè)生肉和高污染食品中的沙門(mén)氏菌，此改良免疫擴(kuò)散法是加拿大農(nóng)業(yè)部建立的方法，目的是在保持檢測(cè)時(shí)間為2 d的同時(shí)，在42 ℃四硫磺酸鈉煌綠肉湯中添加高溫選擇性富集步驟。在所檢測(cè)的320個(gè)樣品中，使用改良免疫擴(kuò)散法和《細(xì)菌分析手冊(cè)》培養(yǎng)方法的假陰性率分別為5.2%和3.5%，總體一致性達(dá)96.9%。GAST R K等[25]分別用熒光偏振和側(cè)向流免疫擴(kuò)散法來(lái)檢測(cè)孵化的雞蛋內(nèi)容物中腸炎沙門(mén)氏菌，結(jié)果顯示兩種方法在雞蛋內(nèi)容物中檢出限均為108CFU/mL（大多數(shù)為107CFU/mL），雖然快速檢測(cè)的靈敏度明顯低于培養(yǎng)法，但是用10 CFU腸炎沙門(mén)氏菌感染10個(gè)雞蛋并在25 ℃孵育72 h時(shí)，快速檢測(cè)法和培養(yǎng)法都可以檢測(cè)到病原菌。

2.7 免疫傳感器法

免疫傳感器法（immunosensor assay，IA）是根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)，將抗原（抗體）作為感應(yīng)元件與信號(hào)傳導(dǎo)器相結(jié)合，通過(guò)反應(yīng)待測(cè)抗體（抗原）的濃度來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的一種方法。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高。陳晨等[26]在納米金和石墨烯共沉積的絲網(wǎng)印刷碳電極表面用雙抗體夾心法建立了一個(gè)電化學(xué)免疫傳感器來(lái)進(jìn)行沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)，該傳感器具有特異、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，檢出限為1.18×102CFU/mL。胡雨欣[27]采用免疫磁納米粒子進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌的高效富集，并和雙通道等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器偶合起來(lái)，建立了一種以SPR傳感器進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)的新方法，該方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，檢測(cè)限為1.4 CFU/mL。馬駿爽等[28]將納米金、氧化石墨烯、氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料、氧化石墨烯/離子液體以電沉積方法分別修飾到絲網(wǎng)印刷電極上，并與酶標(biāo)抗體結(jié)合制備成四種免疫傳感器，綜合比對(duì)后結(jié)果顯示在免疫傳感器的各項(xiàng)指標(biāo)尤其是準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性方面離子液體和納米金材料明顯優(yōu)于其他材料。

2.8 免疫色譜技術(shù)

免疫色譜技術(shù)（immunochromatographic technique，ICT）是以抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)。該方法首先在柱填料中偶聯(lián)抗原（抗體）來(lái)制備親和層析柱，當(dāng)樣品通過(guò)層析柱后，就可以從混合樣品中將與抗原（抗體）特異性結(jié)合的免疫成分分離純化出來(lái)。免疫色譜法在近30年來(lái)發(fā)展迅速，具有高效、快速、安全的優(yōu)點(diǎn)，該方法選擇性最高并且分離純化最有效。YEUNG C Y等[29]建立了一種脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）探針-金納米顆粒免疫色譜法來(lái)檢測(cè)樣品中沙門(mén)氏菌的16S核糖體DNA，并將該方法與VITEK 2系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)比較，結(jié)果顯示該方法檢測(cè)159份樣品的敏感性為100%，特異性為94.93%，DNA純化后的檢測(cè)時(shí)間僅為30 min，是一種方便、快速、成本低的檢測(cè)方法。BAUTISTA D A等[30]評(píng)估了基于免疫色譜的試紙條檢測(cè)家禽中沙門(mén)氏菌的敏感性和特異性，當(dāng)使用不同沙門(mén)氏菌菌種的純菌落時(shí)分析靈敏度為1×104～1×105CFU/mL；當(dāng)直接檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染的雞糞便時(shí)敏感性為12.3%，特異性為100%；與XLT4選擇性培養(yǎng)基相比當(dāng)樣品在2%BPW中預(yù)增菌后敏感性和特異性分別增加至93.8%和89%；隨后用TT肉湯增菌后敏感性和特異性分別提高至94.7%和96.8%。與在XLT4選擇性培養(yǎng)基分離病原菌相比，該試紙條檢測(cè)法在預(yù)增菌和增菌步驟會(huì)縮短18～48 h。

3 分子生物學(xué)方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的逐漸發(fā)展，人們對(duì)生物體的認(rèn)識(shí)已經(jīng)到達(dá)微觀水平，通過(guò)檢測(cè)病原微生物的核酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)，來(lái)進(jìn)行不同致病微生物、同一微生物不同抗原類(lèi)型的分離鑒定[31]。許多沙門(mén)氏菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法以其快速、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)也逐漸被廣泛應(yīng)用。

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是一項(xiàng)體外基因擴(kuò)增技術(shù)，是由美國(guó)的MULLIS K等在1985年首次建立的[9]，具有檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)、敏感性高[10]的優(yōu)點(diǎn)，是一種目前廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法，但是操作比較復(fù)雜，檢測(cè)結(jié)果不太穩(wěn)定。常用的PCR檢測(cè)方法包括多重PCR法、熒光定量PCR法、免疫PCR法等。趙新等[32]以沙門(mén)氏菌invA基因作為目的基因，建立了檢測(cè)沙門(mén)氏菌微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)法，此方法不需要構(gòu)建質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)沙門(mén)氏菌含量。王青龍等[33]建立了實(shí)時(shí)熒光PCR來(lái)檢測(cè)食品中的亞利桑那沙門(mén)氏菌，特異性很好，檢測(cè)靈敏度為1～10 CFU/mL。PRASHANT S等[34]建立了雙重實(shí)時(shí)熒光PCR來(lái)檢測(cè)牛肉制品中大腸桿菌（Escherichia coli）、stx1、stx2基因和沙門(mén)氏菌（Salmonella），此方法利用內(nèi)標(biāo)形成具有高分辨率的兩個(gè)溶解曲線(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、成本低廉。程玲玲等[35]設(shè)計(jì)并篩選出三對(duì)特異性引物來(lái)進(jìn)行雞白痢沙門(mén)氏菌（Salmonella pullorum）檢測(cè)，并且經(jīng)條件優(yōu)化得到一種含兩種DNA聚合酶的三重PCR反應(yīng)體系，該體系可以實(shí)現(xiàn)免核酸提取的直接PCR，檢測(cè)靈敏性高，檢出限＜1 000 CFU/mL。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是2000年NOTOMI T等[36]開(kāi)發(fā)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是針對(duì)靶基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四種特異性引物，利用一種鏈置換脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶在等溫條件（63 ℃左右）保溫30～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，LAMP具有簡(jiǎn)單、靈敏、成本低的特點(diǎn)，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳等過(guò)程[10]，適用于高通量檢測(cè)，但是對(duì)引物設(shè)計(jì)要求比較嚴(yán)格[37-38]。LI J等[39]建立了食品中沙門(mén)氏菌特異性基因62181533的LAMP法，檢出限為4.1 CFU/mL，具有高度特異性和靈敏性，檢測(cè)時(shí)間＜1 h。該檢測(cè)技術(shù)的特異性、靈敏性和檢測(cè)范圍與PCR技術(shù)一致甚至更高，檢測(cè)成本較低，但是由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境、樣品中病原菌的多樣性容易產(chǎn)生不穩(wěn)定結(jié)果。郭澍強(qiáng)等[40]建立了以沙門(mén)氏菌invA基因?yàn)槟康钠蔚腖AMP檢測(cè)方法，該方法靈敏度為10CFU/mL，具有快速、費(fèi)用低、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，可以快速檢測(cè)食品樣品和動(dòng)物中6個(gè)腸道沙門(mén)氏菌亞種。張?zhí)焯淼萚41]根據(jù)沙門(mén)氏菌invA基因設(shè)計(jì)引物，在樣品前處理時(shí)結(jié)合疊氮溴化乙錠、蒙脫石封閉的活性炭，建立了一種牛奶中活沙門(mén)氏菌的非預(yù)增菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。該方法的靈敏度為10 CFU/mL，與國(guó)標(biāo)檢測(cè)法相比更快速、靈敏。

3.3 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)的原理是堿基配對(duì)，核酸探針是指帶有標(biāo)記物的能識(shí)別特定核酸序列的脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）片段[42]，它能與其互補(bǔ)的核酸序列雜交形成雙鏈，可以用于待測(cè)核酸樣品中特定基因序列的檢測(cè)。此技術(shù)具有快速、特異、敏感的特點(diǎn)[43]，已經(jīng)應(yīng)用于一些病原微生物的檢測(cè)和研究。目前已經(jīng)用于病原檢測(cè)的核酸探針有基因組DNA探針、互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）分子探針和近些年來(lái)開(kāi)發(fā)出來(lái)的如TaqMan探針、分子信標(biāo)等寡核苷酸探針。ALMEIDA C等[44]利用新型肽核酸探針結(jié)合熒光原位雜交來(lái)檢測(cè)水、奶粉、糞便中的沙門(mén)氏菌，準(zhǔn)確度達(dá)到100%。袁慕云等[45]建立了基于TaqMan探針的沙門(mén)氏菌雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌和腸道沙門(mén)氏菌的同時(shí)檢測(cè)，該方法具有高靈敏度和強(qiáng)特異性，腸炎沙門(mén)氏菌和腸道沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限分別為260 CFU/mL和280 CFU/mL。ISABEL M等[43]篩選出了Sal-3和Sal-5兩個(gè)核酸序列作為檢測(cè)沙門(mén)氏菌的探針，Sal-3探針在鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌培養(yǎng)液中的檢測(cè)限（limit of detection，LOD）值分別為105CFU/mL和104CFU/mL，Sal-5探針的檢測(cè)限稍高于Sal-3探針，分別為104CFU/mL和104CFU/mL，檢測(cè)結(jié)果與PCR、ISO 6579標(biāo)準(zhǔn)方法一致。

3.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片的基本原理是雜交測(cè)序法，是指標(biāo)記樣品DNA與一組固定于支持物上的核酸探針雜交，通過(guò)分析雜交的信號(hào)強(qiáng)度獲得樣品DNA序列?；蛐酒?991年由美國(guó)學(xué)者FODOR S P[46]提出的。不同于PCR、免疫分析等只能檢測(cè)一種或較少的幾種微生物基因片段、操作過(guò)程復(fù)雜，基因芯片技術(shù)可以同時(shí)對(duì)大量基因片段進(jìn)行分析[8]，具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化以及高通量的優(yōu)點(diǎn)，是目前可用于多種微生物檢測(cè)的快速方法之一，但也存在實(shí)驗(yàn)成本（探針合成、核酸標(biāo)記、數(shù)據(jù)分析）較高、測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定等問(wèn)題。許俊鋼[47]應(yīng)用基因芯片檢測(cè)了大腸菌群（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）和志賀氏菌（Shigella castellani）共30份樣品，結(jié)果顯示其準(zhǔn)確率高，檢測(cè)時(shí)間在8 h內(nèi)，檢測(cè)效率顯著提高。LI Y[48]利用可視化DNA微矩陣技術(shù)結(jié)合多重PCR方法來(lái)檢測(cè)常見(jiàn)的致病菌，包括大腸菌群、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和單增李斯特菌，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)包括沙門(mén)氏菌在內(nèi)的14種致病菌陽(yáng)性的食品及菌液，結(jié)果顯示檢出限為102CFU/mL，是一種快速、特異、高通量的檢測(cè)方法。

3.5 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（amplified fragment length polymorphism，AFLP）的基本原理是先用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行基因組DNA的雙酶切，產(chǎn)生不同分子質(zhì)量大小的隨機(jī)DNA片段，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段進(jìn)行多態(tài)性分析。此技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，在微生物研究方面的應(yīng)用較為廣泛[1]，但是對(duì)內(nèi)切酶質(zhì)量和DNA純度要求很?chē)?yán)格。目前AFLP技術(shù)在沙門(mén)氏菌研究方面報(bào)道較少。有學(xué)者[1]對(duì)含有62個(gè)血清型的78株沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行了AFLP指紋圖譜分析后，結(jié)果顯示每一個(gè)血清型都有獨(dú)特的AFLP指紋圖，并且AFLP指紋的分辨率較高，可以因此區(qū)分不同菌株。

4 新型檢測(cè)方法

4.1 生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

生物傳感器是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器，是由固定化的生物分子識(shí)別元件（如微生物、細(xì)胞、組織、酶、抗原、抗體等生物活性物質(zhì)）、適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換器（如光敏管、氧電極、壓電晶體）及信號(hào)放大裝置組成的分析系統(tǒng)。目前用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的傳感器有酶?jìng)鞲衅鳌㈦娀瘜W(xué)傳感器、免疫傳感器、基因傳感器、光敏傳感器等[7]。生物傳感器具有準(zhǔn)確度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。嚴(yán)杏[49]建立了一種DNA適配體傳感器來(lái)檢測(cè)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella paratyphi）A，其基本原理是熒光疊加、熒光能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）和限制性?xún)?nèi)切酶酶解作用。其中限制性?xún)?nèi)切酶I介導(dǎo)的靶標(biāo)循環(huán)可以將熒光信號(hào)放大，當(dāng)靶標(biāo)濃度為1×102～1×1011cells/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系良好，檢測(cè)下限為1×102cells/mL，結(jié)果顯示該方法具有高度靈敏性和特異性。CHEN I H等[50]利用噬菌體包被的ME傳感器建立兩種檢測(cè)模式，以比較雞肉中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)效果，結(jié)果表明在檢測(cè)雞肉表面時(shí)，添加了7.86×105CFU/mm2沙門(mén)氏菌的噬菌體C4-22傳感器與未添加的噬菌體對(duì)照傳感器相比顯示出12倍以上的沙門(mén)氏菌結(jié)合能力。王月等[51]利用生物素-脫氧核糖核苷三磷酸（biotin-deoxy-ribonucleoside triphosphate，B-dNTP）改良了沙門(mén)氏菌目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了以核酸橫流生物傳感器為檢測(cè)依據(jù)的沙門(mén)氏菌可視化檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)快速、結(jié)果直觀，檢出限為10 CFU/mL。

4.2 納米技術(shù)

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（1～100 nm）的材料[52]，具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)的基本特征。將納米材料與電子材料、生物學(xué)結(jié)合起來(lái)，就可以利用如酶、抗體等特定識(shí)別分子來(lái)分析待測(cè)樣品，并產(chǎn)生特定信號(hào)。納米材料應(yīng)用于食品中致病菌檢測(cè)方面的技術(shù)包括納米生物傳感器技術(shù)、納米金免疫標(biāo)記技術(shù)、納米磁分離技術(shù)等。納米材料如氧化石墨烯、碳納米管、等離子體金、磁珠等被用作生物傳感器的傳感部分，已經(jīng)應(yīng)用于致病菌的檢測(cè)[53]。將納米技術(shù)與常規(guī)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，具有大批量檢測(cè)、方便快捷、靈敏度高[8]的優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)檢測(cè)成本和技術(shù)水平要求較高。徐連應(yīng)等[54]建立了一種基于復(fù)合納米材料和酶切信號(hào)的電化學(xué)傳感器，已經(jīng)成功檢測(cè)出羊奶中的沙門(mén)氏菌，檢測(cè)敏感性為200 CFU/mL，具有檢測(cè)限低、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于食品中沙門(mén)氏菌的快速定量檢測(cè)。LIU X等[55]利用夾心免疫分析法原理，將免疫傳感器結(jié)合抗體修飾Fe3O4磁性納米（immunosensor combining antibody-functionalized Fe3O4magnetic nanoparticles，immuno MNPs）構(gòu)建了一個(gè)表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器，用于腸炎沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)。此方法的檢測(cè)限為14 CFU/mL，與immunoMNPs結(jié)合的SPR免疫傳感器與腸炎沙門(mén)氏菌常規(guī)SPR傳感器相比，其靈敏度提高了4個(gè)數(shù)量級(jí)。該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的SRP傳感器具有成本低、簡(jiǎn)便、高度敏感的特點(diǎn)，有望成為食品中致病菌檢測(cè)的新方法。肖穩(wěn)等[56]研究了一種羧甲基殼聚糖-分子信標(biāo)-金納米合成材料，根據(jù)以分子信標(biāo)共價(jià)功能化為基礎(chǔ)的殼聚糖技術(shù)，利用金納米比色方法來(lái)進(jìn)行鼠傷寒沙門(mén)氏菌SSeC基因的檢測(cè)，該方法的靈敏度和特異性較高，對(duì)目的基因的檢測(cè)下限為50 nmol/L。

4.3 基于適配體的檢測(cè)技術(shù)

適配體是采用指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從人工合成的隨機(jī)文庫(kù)中篩選出的一段寡核苷酸序列，該序列對(duì)相應(yīng)的配體具有高度親和力和特異性。核酸適配體作為一種新型識(shí)別分子，具有制備方便、可體外化學(xué)合成、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[57]，并且比抗體的制備周期短、特異性高，但是該技術(shù)目前檢測(cè)的致病菌種類(lèi)比較少，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)還存在較大難度[58]。近年來(lái)已經(jīng)篩選出多種致病菌的適配體并應(yīng)用于食品檢測(cè)，基于適配體檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的技術(shù)也在逐漸發(fā)展。段諾[59]首先將適配體、磁性納米顆粒、雙色上轉(zhuǎn)換納米顆粒分別作為識(shí)別元件、捕獲探針和顯示探針，與上轉(zhuǎn)換激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立了一種同時(shí)檢測(cè)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄菌的方法，鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限分別為5 CFU/mL和8 CFU/mL；其次基于適配體識(shí)別和量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)，并與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，建立了同時(shí)檢測(cè)沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌的方法，結(jié)果顯示該方法與平板計(jì)數(shù)法無(wú)顯著差異；最后根據(jù)AccuBlue染料具有弱熒光強(qiáng)度，結(jié)合雙鏈DNA后產(chǎn)生高熒光強(qiáng)度，結(jié)合單鏈DNA后熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，建立了無(wú)標(biāo)記熒光適配體傳感器，分別實(shí)現(xiàn)了沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌的檢測(cè)，檢測(cè)限為25 CFU/mL、35 CFU/mL。賈飛[60]首先基于適配體識(shí)別和還原氧化石墨烯-納米金制備了新型電流型傳感器，對(duì)食品中沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為80 CFU/mL（S/N=3）；其次利用一步電沉積法還原氧化石墨烯-碳納米管復(fù)合納米材料，構(gòu)建了基于適配體的新型無(wú)標(biāo)記電化學(xué)傳感器來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌，檢出限為25 CFU/mL（S/N=3）。蔣曉華等[61]根據(jù)合成的金屬有機(jī)骨架材料（Uio-66-NH2）的熒光猝滅特性和適配體的識(shí)別作用，制備了熒光生物傳感器來(lái)檢測(cè)蝦肉樣品中的沙門(mén)氏菌，該傳感器的靈敏度、特異性較好，檢出限（S/N=3）為7 CFU/mL。

5 結(jié)論與展望

食品中微生物檢測(cè)對(duì)于保證人們的飲食健康有重要意義，尤其是近年來(lái)致病菌感染受到了人們的廣泛關(guān)注。沙門(mén)氏菌作為常見(jiàn)的致病菌在畜禽類(lèi)及其制品中的感染逐漸增多，沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法也在不斷發(fā)展。

最常用的沙門(mén)氏菌檢測(cè)技術(shù)有傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法。傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，檢測(cè)成本低，但是操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，目前該方法仍然是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織認(rèn)可的沙門(mén)氏菌檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。免疫學(xué)檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)批量多、檢測(cè)速度快，能夠廣泛應(yīng)用到沙門(mén)氏菌檢測(cè)中，但是操作中多次洗滌容易引起交叉污染和假陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果主要由一抗的質(zhì)量決定，而一抗的制備需要大量時(shí)間去摸索，并且目前無(wú)法檢測(cè)所有的沙門(mén)氏菌血清型。分子生物學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速，但是所需的儀器費(fèi)用高，對(duì)檢測(cè)人員、檢測(cè)條件和環(huán)境的要求比較嚴(yán)格，如PCR技術(shù)在引物設(shè)計(jì)、操作環(huán)境方面容易引起不穩(wěn)定結(jié)果；基因芯片的標(biāo)記技術(shù)、增強(qiáng)芯片檢測(cè)靈敏性等技術(shù)問(wèn)題需要進(jìn)一步優(yōu)化。生物傳感器技術(shù)、納米技術(shù)、基于適配體檢測(cè)技術(shù)等新型檢測(cè)技術(shù)為建立沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)方法提供了技術(shù)支撐，但是存在技術(shù)要求嚴(yán)格、實(shí)驗(yàn)成本高等問(wèn)題，其中基于適配體的檢測(cè)技術(shù)還需要提高適配體篩選效率、研究適配體與靶分子的結(jié)和作用機(jī)制。

聯(lián)合使用兩種或兩種以上方法能適當(dāng)彌補(bǔ)單一檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生的缺陷，將傳統(tǒng)的生化檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)用于致病菌的檢測(cè)，才能提高病原微生物的研究和檢測(cè)水平。將一些新型技術(shù)與常規(guī)檢測(cè)方法聯(lián)合使用，促進(jìn)了沙門(mén)氏菌檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展。目前由于高技術(shù)要求、成本費(fèi)用高等原因，大多數(shù)新型檢測(cè)技術(shù)僅在實(shí)驗(yàn)室研究階段。一項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)能否得到廣泛應(yīng)用，除了檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)外，還與成本較低、接近實(shí)際應(yīng)用有關(guān)。隨著人們對(duì)食品安全的密切關(guān)注和食品衛(wèi)生監(jiān)管的快速檢測(cè)要求，開(kāi)發(fā)靈敏度高、快速準(zhǔn)確、成本較低、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是今后檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的重要研究方向。