何迎粉，何榮榮，劉敦華，孫 悅

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是對(duì)人類(lèi)有益的一類(lèi)微生物，常被用來(lái)制作面包、啤酒和葡萄酒等發(fā)酵食品，除此之外，其也廣泛應(yīng)用在溶劑、乳化劑和燃料等工業(yè)領(lǐng)域[1]。釀酒酵母因具有發(fā)酵速度快和產(chǎn)酒精濃度高等優(yōu)點(diǎn)而成為學(xué)者研究的重點(diǎn)。但在發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母細(xì)胞受到乙醇、酸度、滲透壓和營(yíng)養(yǎng)成分不足等因素的影響[2]，生長(zhǎng)代謝受到抑制，其中乙醇脅迫是影響較大的因素之一[3]。

釀酒酵母細(xì)胞中含有許多抵御乙醇脅迫的成分，如菌體海藻糖[4]、與細(xì)胞膜流動(dòng)性有密切聯(lián)系的脂肪酸[5]、與菌體蛋白相關(guān)的氨基酸等[6]。其中海藻糖是釀酒酵母在乙醇脅迫下產(chǎn)生的重要應(yīng)激產(chǎn)物，能夠特異性保護(hù)菌體蛋白質(zhì)、生物膜和核酸等大分子結(jié)構(gòu)[7]。海藻糖發(fā)揮的作用是雙重的：一是海藻糖取代水并與磷脂極性基團(tuán)結(jié)合來(lái)保持膜結(jié)構(gòu)的完整性；二是海藻糖還可以起到伴侶蛋白作用，抑制變性蛋白質(zhì)聚集，為蛋白質(zhì)復(fù)性提供能量[8]。海藻糖除了提高釀酒酵母的乙醇脅迫外，在其他不利環(huán)境（如高溫、冷凍、剪切力和有毒物質(zhì)）中也起著至關(guān)重要的作用[9]。本文對(duì)乙醇脅迫下釀酒酵母細(xì)胞的耐受機(jī)制及海藻糖與釀酒酵母乙醇脅迫的關(guān)系進(jìn)行綜述，旨在為提高釀酒酵母的乙醇耐受性提供參考。

1 釀酒酵母的乙醇耐受性機(jī)理

乙醇是釀酒酵母發(fā)酵生成的主要副產(chǎn)物，高濃度乙醇對(duì)酵母細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生抑制作用，酵母菌則產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保證正常的生長(zhǎng)代謝，這種應(yīng)對(duì)機(jī)制即為釀酒酵母乙醇耐受性[10]。乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)為降低酵母細(xì)胞存活率和細(xì)胞生長(zhǎng)速率，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程的終止[11]。因此，研究耐酒精釀酒酵母的篩選和發(fā)酵特性的評(píng)價(jià)具有重要意義。

1.1 酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)與乙醇耐受性的關(guān)系

1.1.1 酵母細(xì)胞壁與乙醇耐受性的關(guān)系

細(xì)胞壁的完整性在釀酒酵母乙醇耐受性發(fā)揮著重要作用。釀酒酵母細(xì)胞壁的主要成分是D-葡萄糖、D-甘露糖、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和極少量的脂類(lèi)物質(zhì)和礦物質(zhì)。在高濃度酒精的環(huán)境下，細(xì)胞壁中的成分會(huì)發(fā)生改變以抵御酒精等不利環(huán)境，減輕對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞[12]。葡萄糖和甘露糖構(gòu)成的細(xì)胞壁具有一定的韌性，細(xì)胞壁蛋白固定在細(xì)胞壁上，可以起到防止酒精溶解酵母細(xì)胞的作用[13]。細(xì)胞壁麥角固醇和多種脂肪酸可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的滲透性，提高釀酒酵母的存活率[14]。

除釀酒酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)外，細(xì)胞壁合成基因與乙醇耐受性也存在一定的關(guān)聯(lián)。這些基因包括葡聚糖合成基因、β-1,3葡聚糖合成基因FKS1和β-1,6葡聚糖合成基因KRE6[15]，細(xì)胞壁蛋白基因SPl1和其他細(xì)胞壁基因BEM2、PAT1、ROM2、VPS34、ADA2[16]。

1.1.2 細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)與乙醇耐受性的關(guān)系

乙醇對(duì)釀酒酵母內(nèi)膜系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用的部位有細(xì)胞膜、親水蛋白、疏水蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[17]，其主要目標(biāo)是膜結(jié)構(gòu)。高濃度乙醇會(huì)導(dǎo)致膜流動(dòng)性和通透性增加，從而破壞膜完整性，酵母細(xì)胞可以通過(guò)改變膜結(jié)構(gòu)來(lái)防止膜流化和穩(wěn)定質(zhì)膜[18]，達(dá)到抵御乙醇?jí)毫Φ哪康腫19]。

不飽和脂肪酸和麥角固醇是細(xì)胞膜的重要成分，ALEXANDRE H等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇濃度升高時(shí)，麥角固醇含量也會(huì)增加。ARCHANA K M等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入不飽和脂肪酸，釀酒酵母抵御乙醇毒害的能力會(huì)提高。除此之外，乙醇還通過(guò)減少生物分子的水化外殼的方式使其受到活性氧的攻擊，在此過(guò)程中乙醇取代水并改變分子在細(xì)胞膜上的位置，最終破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能[22]。

1.2 釀酒酵母自身遺傳基因與乙醇耐受性的關(guān)系

釀酒酵母在高濃度乙醇中會(huì)做出一系列應(yīng)激反應(yīng)，與釀酒酵母乙醇耐受性密切相關(guān)的基因主要有：熱激蛋白合成基因、與乙醇耐受性相關(guān)的內(nèi)源基因、某些氨基酸的合成基因以及海藻糖合成酶基因[23]。

1.2.1 熱激蛋白合成基因

熱激蛋白是釀酒酵母在脅迫條件下產(chǎn)生的特殊蛋白，熱激蛋白合成基因主要有Hsp12、Hsp30、Hsp70、Hsp78、Hsp82、Hsp104等。CHANDLER M等[24]采用脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）微陣列分析的方法研究釀酒酵母在體積分?jǐn)?shù)5%酒精培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)物的基因，通過(guò)與原始菌株對(duì)比，經(jīng)過(guò)酒精處理的酵母菌Hsp104、Hsp26、Hsp30、Hsp70和Hsp12的基因在轉(zhuǎn)錄水平上提高幅度較大，熱激蛋白合成量較多?；騂sp70具有穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、參與其他蛋白質(zhì)的合成與折疊和抑制蛋白質(zhì)分解的作用[25]。MARKS V D等[26]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在乙醇脅迫下熱激蛋白Hsp70家族基因SSE1、SSA1和SSA2表達(dá)上調(diào)。Hsp12是與細(xì)胞膜相關(guān)的蛋白質(zhì)，在高濃度酒精中維持質(zhì)膜完整性，Hsp104則充當(dāng)變性蛋白質(zhì)分解中的重塑劑[27]。

1.2.2 酵母內(nèi)源性基因

酵母內(nèi)源性基因過(guò)表達(dá)可以提高釀酒酵母乙醇耐受性，逆代謝工程方法可以識(shí)別釀酒酵母潛在的與乙醇耐受性相關(guān)的基因靶點(diǎn)。HONG M E等[28]選擇酵母內(nèi)源性基因作為研究對(duì)象，采用逆代謝工程方法識(shí)別過(guò)表達(dá)基因靶點(diǎn)，其中基因靶點(diǎn)INO1、DOG1、HAL1和截短的MSN2基因與乙醇耐受性有著密切聯(lián)系，將這四種質(zhì)粒重組酵母進(jìn)行乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這四種質(zhì)粒過(guò)表達(dá)都能增強(qiáng)酵母乙醇耐受性，其中基因INO1過(guò)表達(dá)的效果最好。

1.2.3 氨基酸基因

酵母細(xì)胞中某些氨基酸在提高釀酒酵母乙醇耐受性發(fā)揮重要作用，如脯氨酸、精氨酸和色氨酸。脯氨酸主要通過(guò)促進(jìn)GK蛋白的生成來(lái)提升釀酒酵母的乙醇耐受性[29]，精氨酸可以抑制酵母體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，從而對(duì)乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器起到保護(hù)作用[30]，HIRASAWA T等[31]研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸合成基因（即TRP1，TRP2，TRP3，TRP4和TRP5）缺失則會(huì)導(dǎo)致酵母對(duì)乙醇脅迫更加敏感。

1.2.4 海藻糖合成酶基因

釀酒酵母乙醇耐受性與菌體海藻糖含量有著密切的聯(lián)系，高濃度乙醇誘導(dǎo)海藻糖合成酶基因和降解酶基因的表達(dá)，促使酵母生成大量的海藻糖來(lái)抵御乙醇脅迫[24]。與海藻糖合成代謝密切相關(guān)的基因主要有海藻糖合成基因和海藻糖酶基因。海藻糖合成基因主要有TPS1、TPS2和TLS1；海藻糖酶基因主要有中性海藻糖酶基因NTH1、NTH2和酸性海藻糖酶基因ATH1[8，32]。不同倍體釀酒酵母在高濃度酒精中的基因表達(dá)存在差異，ZHANG K等[33]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析得出單倍體和三倍體釀酒酵母基因TPS1、TPS2和TLS1上調(diào)程度比基因NTH1、NTH2和ATH1上調(diào)程度高，從而使釀酒酵母積累更多海藻糖。釀酒酵母在不同時(shí)期的基因表達(dá)略有差異，YI C F等[34]研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)指數(shù)期的釀酒酵母基因NTH1和NTH2表達(dá)下調(diào)，海藻糖分解量減少，海藻糖累積量增加。生長(zhǎng)穩(wěn)定期的釀酒酵母基因NTH1、NTH2、TPS1和ATH1表達(dá)上調(diào)，TPS2表達(dá)下調(diào)，從而使釀酒酵母菌體海藻糖達(dá)到穩(wěn)定趨勢(shì)。

乙醇誘導(dǎo)海藻糖合成基因表達(dá)生成大量海藻糖，但過(guò)量海藻糖抑制熱激蛋白發(fā)揮穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，海藻糖酶基因表達(dá)使海藻糖降解，有利于發(fā)揮其他應(yīng)激物質(zhì)的保護(hù)作用[20]。因此，海藻糖合成基因和海藻糖酶基因共同賦予釀酒酵母抵御乙醇脅迫的能力。

2 海藻糖與釀酒酵母乙醇耐受性的相關(guān)性

海藻糖是由葡萄糖分子通過(guò)半縮醛羥基縮合構(gòu)成，是一種非還原性二糖[9]，海藻糖穩(wěn)定性強(qiáng)，只有海藻糖酶才會(huì)將其分解成葡萄糖[35]。海藻糖具有高度水合能力和強(qiáng)穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，在脅迫環(huán)境中起到維持生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的作用[11]，是評(píng)價(jià)酵母乙醇耐受性的重要指標(biāo)[36]。

海藻糖是酵母在脅迫條件下的保護(hù)劑，酵母存活率隨著菌體海藻糖累積量增加而增加[37-38]。當(dāng)酵母處在致死濃度的乙醇中，海藻糖起到穩(wěn)定酵母細(xì)胞膜、保護(hù)細(xì)胞質(zhì)蛋白和修復(fù)變性蛋白的作用[8，39]，還可以幫助菌體蛋白進(jìn)行適當(dāng)折疊和修復(fù)，防止蛋白質(zhì)聚集和羰基化[22，40-41]，通過(guò)取代酵母細(xì)胞膜上的水和乙醇，與脂質(zhì)極性基團(tuán)之間形成氫鍵，穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)[43]。除此之外，海藻糖在流體條件下可以維持脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，海藻糖還是抵御細(xì)胞內(nèi)部和外部乙醇毒性的重要物質(zhì)之一，能夠防止乙醇誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞和羧基熒光素捕獲的脂質(zhì)體模型系統(tǒng)中的電解質(zhì)流失[22]。

2.1 酒精脅迫條件下釀酒酵母基因的變化

一些學(xué)者采用進(jìn)化差異理論的誘變技術(shù)分離酵母突變菌株并進(jìn)行乙醇沖擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海藻糖合成基因TPS1、TPS2、TPS3和TSL1表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，這表明乙醇誘導(dǎo)海藻糖合成基因的表達(dá)以產(chǎn)生更多海藻糖抵御乙醇脅迫[44-45]。MAHMUD S A等[8]將中性海藻糖酶基因NTH1、NTH2和酸性海藻糖酶基因ATH1同時(shí)敲除，將海藻糖酶缺陷菌株進(jìn)行乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，缺陷菌株海藻糖合成基因TPS1和TPS2表達(dá)增強(qiáng)，缺陷菌株海藻糖含量比原始菌株FY834高，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出過(guò)表達(dá)基因TPS2產(chǎn)生的海藻糖含量高于過(guò)表達(dá)基因TPS1產(chǎn)生的海藻糖含量。

釀酒酵母在高濃度乙醇中，除了海藻糖合成基因表達(dá)增強(qiáng)外，中性海藻糖酶基因和酸性海藻糖酶基因表達(dá)也會(huì)增強(qiáng)。TAO X L等[45]以釀酒酵母敏感菌株Z5和耐酒精菌株SZ3-1為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用體積分?jǐn)?shù)10%的酒精進(jìn)行沖擊實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)海藻糖合成基因TPS1、TPS2、TPS3和TSL1表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)；除此之外，酸性海藻糖酶基因ATH1和中性海藻糖酶基因NTH1的表達(dá)水平也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。

2.2 外源海藻糖與乙醇耐受性的關(guān)系

高濃度乙醇會(huì)損害釀酒酵母體內(nèi)代謝過(guò)程，使酵母無(wú)法產(chǎn)生大量海藻糖來(lái)抵御乙醇脅迫[40]。酵母菌獲取能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要途徑是培養(yǎng)基，一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入海藻糖，可以有效提高釀酒酵母的乙醇耐受性[3，46]。劉琦等[47]將葡萄酒泥酵母中的海藻糖提取物以300 mg/L的添加量加入到模擬葡萄汁中，研究其對(duì)酵母乙醇耐受性的影響。結(jié)果表明，酵母在穩(wěn)定期的生物量和存活率都大幅提高，說(shuō)明海藻糖可以提高酵母的乙醇耐受性。由此得出，外源添加海藻糖提高釀酒酵母乙醇耐受性，可以有效改善釀酒酵母發(fā)酵特性，有利于酒精工業(yè)的發(fā)展。

3 展望

盡管DNA芯片、基因工程、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得酵母的乙醇脅迫機(jī)制的研究已經(jīng)深入到分子遺傳學(xué)層次，但海藻糖對(duì)釀酒酵母的保護(hù)機(jī)理還未有統(tǒng)一定論。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)主要集中在內(nèi)源海藻糖提高釀酒酵母乙醇耐受性的機(jī)理，但對(duì)于外源海藻糖與釀酒酵母之間的結(jié)合位點(diǎn)和相互作用力以及其他作用機(jī)理研究較少。因此，研究外源海藻糖提高釀酒酵母乙醇耐受性對(duì)于發(fā)酵工業(yè)具有重要意義。