高萬里，張鵬飛，常志揚，魏志潘，臧小彪，王現(xiàn)青，張靜，高傳玉，趙永輝

(河南大學(xué)人民醫(yī)院/華中阜外醫(yī)院 a.心血管內(nèi)科;b.超聲科，河南 鄭州 450003)

冠狀動脈閉塞后，根據(jù)缺血的程度、速度、范圍以及是否存在側(cè)支循環(huán)，心肌細胞可能出現(xiàn)以下3種情況。(1)冬眠心?。河砷L期的血流低灌注狀態(tài)造成的靜息狀態(tài)下左心室功能持續(xù)低下，當(dāng)冠狀動脈血流恢復(fù)正常灌注后，收縮功能可完全或部分恢復(fù)，是心肌細胞應(yīng)對缺血損傷的保護性機制。(2)頓抑心?。盒募〖毙匀毖徑夂?，心肌細胞并未壞死，當(dāng)冠狀動脈供血恢復(fù)后，心肌收縮力和心肌代謝需要一定的時間才能恢復(fù)。冬眠心肌和頓抑心肌都具有收縮功能儲備，屬于存活心肌。(3)壞死心?。盒募〖毎寻l(fā)生不可恢復(fù)的損傷，當(dāng)冠狀動脈恢復(fù)灌注后，心肌收縮力無法恢復(fù)，心功能亦不會改善。冬眠心肌由于恢復(fù)血供后可部分或完全恢復(fù)，具有重要的研究價值。

近年來，冬眠心肌成為了心血管領(lǐng)域的研究熱點[1]，但經(jīng)濟且有效的冬眠心肌模型的制備方法尚未統(tǒng)一。查閱國內(nèi)外文獻可見，目前較常用的方法是球囊擴張+內(nèi)膜剝脫，造成冠狀動脈左前降支狹窄，亦有開胸后使用縮窄環(huán)造成慢性閉塞的模型[2-4]。但該研究方法缺乏準(zhǔn)確的冠狀動脈的閉塞百分比，對實驗室及實驗人員條件要求高，實驗花費大，X線下對實驗者有輻射傷害，動物死亡率高。本研究采用開胸法暴露犬冠狀動脈左前降支中遠段，用游標(biāo)卡尺測量冠狀動脈直徑，采用不同粗細鋼絲結(jié)扎，確保管腔狹窄程度在75%左右，以期為研究冬眠心肌提供簡單易行的模型制備方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康成年比格犬16只，月齡為12～36個月，體質(zhì)量為(11.2±1.9)kg，雌雄各半。所有動物研究完全符合國家《實驗動物管理條例》。實驗動物由南京亞東實驗動物研究中心提供，編號：NO.201708679。將實驗動物按照隨機數(shù)表法分為A、B兩組，A組為冬眠心肌模型組，B組為假手術(shù)組，每組8只。A組月齡為(16.1±3.1)個月，體質(zhì)量為(11.8±1.2)kg；B組月齡為(15.9±2.5)個月，體質(zhì)量為(12.0±1.0)kg。兩組間體質(zhì)量及月齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

1.2 實驗方法A組30 g·L-1戊巴比妥鈉30 mg·kg-1靜脈注射麻醉后，氣管插管接麻醉呼吸機給予機械通氣，連接多功能監(jiān)護儀。觸診心尖搏動最強點，胸骨左緣第四肋間標(biāo)記理想搏動點，常規(guī)備皮，消毒，鋪巾，按標(biāo)準(zhǔn)外科程序開胸，打開心包，暴露冠狀動脈左前降支(left anterior descending，LAD)中遠段，無菌條件下使用游標(biāo)卡尺測量靶血管直徑，用帶線縫合針(5-0)穿過靶血管下方心肌表面，繞過靶血管備結(jié)扎阻斷，使用不同粗細鋼絲將血管與鋼絲緊密結(jié)扎，而后迅速抽出鋼絲，確保結(jié)扎后造成靶血管70%～75%狹窄，觀察臨近靶血管供血區(qū)域血供情況，可見其心肌顏色較前稍有變淺。B組將絲線穿過前降支下方，但不結(jié)扎，其余同A組。術(shù)后連續(xù)3 d給予五水頭孢唑琳0.5 g肌內(nèi)注射，每日3次，預(yù)防切口感染。1周后開始進行加強運動訓(xùn)練，即實驗犬每日運動量不少于4 h。術(shù)后3個月終止實驗。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1A組小劑量多巴酚丁胺負荷超聲檢測 正式實驗前24～48 h，胸前壁備皮。用4.0 MHz電子相控陣扇擴探頭在胸骨右緣進行體外超聲掃查，取標(biāo)準(zhǔn)乳頭肌水平左室短軸切面，對比觀察左室前間壁(冬眠心肌)和后壁心肌(正常對照區(qū))的收縮功能。采用M形取樣線通過左室前間壁和后壁測定基礎(chǔ)狀態(tài)下和不同劑量多巴酚丁胺(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·kg-1·min-1，每期3 min)負荷時局部心肌的收縮功能。以收縮期室壁增厚率(wall thickening，WT%)表示心肌收縮功能。以靜脈輸液泵控制多巴酚丁胺劑量分別為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·kg-1·min-1[5-6]。

1.3.2靜息時室壁運動分析 按照美國超聲協(xié)會左心室16節(jié)段劃分法，請兩位主治及以上職稱超聲科醫(yī)生以目測法觀察LAD供血區(qū)室壁運動情況[7]：1分為運動正常，2分為運動幅度減低，3分為運動消失，4分為矛盾運動，即收縮期心外膜向外膨出，室壁變薄。室壁運動計分指數(shù)(wall molion score index，WMSI)=各節(jié)段記分之和/總節(jié)段數(shù)。正常值為1。

1.3.3左心室整體收縮功能測定 選取左室長軸切面圖像，應(yīng)用M型超聲心動圖連續(xù)測量3個不同心動周期的左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)，取平均值，比較術(shù)前、術(shù)后左心室整體收縮功能。

2 結(jié)果

2.1 模型制備概況本實驗A組和B組共16只比格犬，均順利完成實驗，且A組造模成功，各項數(shù)據(jù)基本符合預(yù)期要求，無麻醉意外，無心肌梗死、感染等術(shù)后并發(fā)癥。

2.2 A組超聲心動圖多巴酚丁胺負荷試驗A組行超聲心動圖多巴酚丁胺負荷試驗時，左室前間壁(冬眠心肌區(qū)域)與左室后壁(正常心肌區(qū)域)進行比較。隨著多巴酚丁胺劑量增加，左室前間壁(冬眠心肌區(qū)域)收縮期WT%明顯降低，且出現(xiàn)雙向運動，即室壁運動隨多巴酚丁胺劑量增加，先出現(xiàn)室壁運動增強，而后室壁運動減弱(均P<0.01)。隨多巴酚丁胺劑量增加，左室后壁(正常心肌區(qū)域)室壁運動持續(xù)增強(均P<0.01)，冬眠心肌模型成功。見表1。A組小劑量多巴酚丁胺負荷左心室壁運動超聲影像見圖1。

表1 A組左室前間壁與左室后壁不同藥物劑量下的WT%比較

注：與左室前間壁基礎(chǔ)狀態(tài)比較，aP<0.01；與左室后壁基礎(chǔ)狀態(tài)比較，bP<0.01。

A—多巴酚丁胺泵速為15 μg·kg-1·min-1；B—多巴酚丁胺泵速為20 μg·kg-1·min-1，室壁運動減弱，室壁厚度變?。籇1—左室前間壁厚度；D2—左室后壁厚度。

圖1A組小劑量多巴酚丁胺負荷左心室壁運動超聲影像

2.3 靜息時室壁運動分析結(jié)果A組有較多節(jié)段出現(xiàn)室壁運動異常，B組未出現(xiàn)室壁運動異常，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 靜息時心肌左心室壁節(jié)段障礙計分

注：A組與B組比較，P<0.01；WMSI—室壁運動計分指數(shù)。

2.4 左心室整體收縮功能測定A組術(shù)后左室收縮功能降低，表現(xiàn)為射血分數(shù)顯著較少，B組術(shù)前術(shù)后未見明顯變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖2和圖3。

表3 兩組手術(shù)前后慢性冬眠心肌心功能的變化比較

注：與同組術(shù)前比較，aP<0.01；與B組術(shù)后3個月比較，bP<0.01；LVEF—左室射血分數(shù)。

A—A組術(shù)前左心功能測定；B—A組術(shù)后左心功能測定；EF—左室射血分數(shù)。

圖2A組手術(shù)前后左心功能比較

A—B組術(shù)前左心功能測定；B—B組術(shù)后左心功能測定；EF—左室射血分數(shù)。

圖3B組手術(shù)前后左心功能比較

3 討論

冬眠是心肌缺血時為了避免壞死采取的一種自我保護機制，及時恢復(fù)血供可以使缺血心肌功能恢復(fù)正?；蚪咏＃悠诨謴?fù)血供可能使冬眠心肌功能慢性喪失[8-10]。心肌對慢性缺血的反應(yīng)表現(xiàn)為一種適應(yīng)的連續(xù)統(tǒng)一體，隨著時間的推移，形成一種抗應(yīng)激表型。有文獻報道，其可以通過上調(diào)線粒體解偶聯(lián)蛋白-2(UCP-2)，降低鈣調(diào)蛋白表達，降低β受體密度等防止缺血引起的氧化應(yīng)激，但是具體機制還有待進一步研究[11-12]。因此，合適的冬眠心肌模型是開展此實驗的基礎(chǔ)。

犬冬眠心肌模型制備具有天然的優(yōu)勢。比格犬體型適中，便于操作，其性格溫順，實驗重復(fù)性好，適合循環(huán)生理、藥理、病理等實驗研究，比格犬冠狀動脈側(cè)支循環(huán)豐富，術(shù)中結(jié)扎血管不易因急性心肌缺血而誘發(fā)室速、室顫等惡性心律失常[13]。豬的冠狀動脈側(cè)支循環(huán)少，結(jié)扎時易發(fā)生惡性心律失常，且豬的冠脈分布與人的相似程度不及犬。兔體積小，冠狀動脈細小，不易分離。因此，比格犬被國際醫(yī)學(xué)、生物學(xué)界公認為是比較理想的實驗動物。

建立慢性冬眠心肌模型的方法為球囊擴張和內(nèi)膜剝脫，造成LAD狹窄，亦有開胸后使用縮窄環(huán)造成前降支慢性縮窄，但兩者均有不足。前者對實驗場地及實驗人員要求高，在X線下進行實驗，實驗人員難以避免受輻射傷害，且花費較高，性價比欠佳；后者采用縮窄環(huán)造成前降支慢性閉塞，雖避免輻射傷害，但無法精確控制靶血管縮窄百分比，對后續(xù)實驗結(jié)果可控性欠佳。

本研究采用開胸絲線結(jié)扎法制備犬冬眠心肌模型，通過游標(biāo)卡尺測量前降支中遠端直徑，匹配不同直徑鋼絲造成前降支75%狹窄，參考相關(guān)文獻[14-15]，以稍高于運動當(dāng)量的運動量，即術(shù)后1周輔以每日室外運動4 h(上下午各2 h)，避免以往單純?nèi)︷B(yǎng)，長期低需氧量狀態(tài)造成慢性心肌缺血不充分的問題。冬眠心肌鑒別方法眾多[16-18]，尤以超聲心動圖多巴酚丁胺負荷試驗性價比最高，術(shù)后此方法驗證成功造成前降支供血區(qū)域心肌產(chǎn)生冬眠現(xiàn)象。此實驗方法簡單，對實驗人員要求較低，花費少，為冬眠心肌領(lǐng)域的后續(xù)研究提供了合理的、穩(wěn)定的模型制備方法。