羅卿清， 鄭 鋼， 顧翠花， 顧 帆， 陳 凱， 鄭紹宇

（浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院， 浙江 杭州311300）

從有性生殖角度來看， 植物的生物學(xué)特性與傳粉條件相適應(yīng)； 而有效的傳粉是以鮮花粉的活力、 可靠的傳播媒介和可授期的花朵柱頭為前提的［1］。 花粉持續(xù)活力的時間與柱頭可授期共同對植物的傳粉受精和植株發(fā)育起重要作用， 特別在異花授粉和遠(yuǎn)緣雜交方面的影響程度更高［2］， 了解花粉培養(yǎng)、 儲藏及活力測定的方法是提高植物雜交育種效率的前提條件［3］。 黃薇Heimia myrtifolia為千屈菜科Lythraceae 黃薇屬Heimia灌木， 原產(chǎn)南美洲和非洲的熱帶、 亞熱帶地區(qū)， 人類的遷移致使南亞、 東亞地區(qū)有零星分布， 在中國上海、 廣西、 浙江等地均有引種， 用于園林觀賞及河道美化等方面。 對黃薇的研究主要集中在生物應(yīng)用方面［4-5］， 目前未見黃薇在雜交育種方面的報道。 本研究采用花粉離體萌發(fā)法研究不同溫度、蔗糖質(zhì)量濃度和硼酸（H3BO4）質(zhì)量濃度對黃薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的影響； 用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性， 研究不同質(zhì)量濃度萘乙酸（NAA）、 赤霉素（GA3）、 6-芐基腺嘌呤（6-BA）對黃薇柱頭可授性的影響， 并對黃薇花粉與柱頭進(jìn)行電鏡掃描觀察， 為黃薇雜交育種親本選配提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃薇花單生葉腋， 花瓣5～6， 倒廣卵形， 長3～4 mm， 金黃色； 花萼鐘形， 裂片間有角狀附屬物；花、 果期7 月［6］。 于2014 年8 月由杭州植物園引進(jìn)， 經(jīng)過扦插繁殖成批量小苗種植于浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)平山植物苗圃。 植株生長良好， 可正常開花結(jié)實。 試驗分別在2015 年7 月10-25 日， 2016 年7月12 日至8 月25 日進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集 在7：00-8：00 采集黃薇未散粉的花藥置于干燥箱內(nèi)干燥2 h， 常溫下自然散粉后過80目分子篩收集花粉。

1.2.2 花粉萌發(fā)培養(yǎng)基配制及培養(yǎng) 采用瓊脂培養(yǎng)基萌發(fā)法檢測花粉萌發(fā)率， 培養(yǎng)基于121 ℃高溫滅菌20 min， 冷卻至常溫后備用。 硼酸（H3BO4）處理： 以100.0 g·L-1蔗糖， 8.0 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基， 分別添加0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5 g·L-1的硼酸， 在30 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)； 蔗糖處理： 以1.0 g·L-1的硼酸，8.0 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基， 分別添加0、 50.0、 100.0、 150.0、 200.0、 250.0 g·L-1的蔗糖， 30 ℃下培養(yǎng)； 溫度處理： 培養(yǎng)基為150.0 g·L-1蔗糖+ 20.0 mg·L-1H3BO4+ 20.0 mg·L-1CaCl2+ 100.0 g·L-1PEG 4000， 設(shè)置10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 ℃共7 個溫度梯度， 3 種處理均將培養(yǎng)基滴加在凹形載玻片上， 采集的花粉用毛筆均勻撒在培養(yǎng)基上， 放置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中， 蓋上保鮮膜， 置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)， 光照強(qiáng)度2 000 lx， 培養(yǎng)6 h。

1.2.3 柱頭采集及處理 柱頭采集和處理參考KHO 等［7］的方法， 提前選取即將開放、 松蕾情況相同、長勢良好的花朵， 標(biāo)記掛牌， 次日清晨6：00 摘取黃薇鮮花， 用鑷子去除花瓣和雄蕊， 取出柱頭， 分別裝入含6-BA、 GA3、 NAA 等3 種植物生長調(diào)節(jié)劑溶液的5 mL 離心管中。 6-BA 的質(zhì)量濃度設(shè)為1.0、5.0、 10.0、 15.0、 20.0 mg·L-1； GA3的質(zhì)量濃度設(shè)為100.0、 200.0、 400.0、 600.0 mg·L-1， NAA 的質(zhì)量濃度設(shè)為1.0、 5.0、 10.0、 15.0、 20.0 mg·L-1， 以蒸餾水浸泡為參照， 4 ℃保存12 h 后， 柱頭在4.0 mol·L-1氫氧化鈉（NaOH）溶液中常溫處理6 h， 經(jīng)蒸餾水洗凈后用質(zhì)量濃度為0.1%水溶性苯胺藍(lán)染色1 h。 摘取開花1、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h 的黃薇花朵， 用鑷子取出柱頭， 用福爾馬林-乙醇-醋酸混合固定液（FAA）固定24 h， 其余染色步驟如上。

1.2.4 花粉萌發(fā)和柱頭可授性檢測 花粉萌發(fā)后在ZEISS Imager A2 熒光顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)狀況，觀察不同視角花粉個數(shù)大于50， 重復(fù)5 次， 拍照并記錄， 花粉萌發(fā)率=（萌發(fā)花粉/花粉總數(shù)）×100%。 用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性［8］。 將處理后的柱頭放入4.0 mol·L-1NaOH 溶液中常溫處理6 h， 浸入盛有聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液（1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水為4∶11∶22， 體積比）染色1 h， 隨后取出并移置載玻片上， 滴加體積分?jǐn)?shù)為50%中性甘油， 蓋片壓片， 用ZEISS Imager A2 熒光顯微鏡進(jìn)行觀察［9］；反應(yīng)液呈藍(lán)色并伴有少量的氣泡， 表明柱頭具有可授性； 反應(yīng)液無變化， 則柱頭無可授性［10］。 每處理重復(fù)5 次， 并拍照。

1.2.5 花粉和柱頭的掃描電鏡觀察 黃薇花粉和柱頭經(jīng)過硅膠干燥， 雌蕊經(jīng)FAA 固定24 h 以上， 乙醇溶液梯度脫水。 臨界點干燥后， 固定于樣品臺上， 離子濺射儀鍍金， 在S-3700N Hitachi 掃描電鏡下觀察拍照。 選取5 個花粉或柱頭， 重復(fù)3 次。 利用Image-Pro plus 6.0， Photoshop CS6， SPSS 19.0 分析處理圖像及數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃薇花粉萌發(fā)率觀察

2.1.1 溫度對黃薇花粉萌發(fā)的影響 由表1 可見： 花粉萌發(fā)率及花粉管長度在10～15 ℃呈上升趨勢， 15～35 ℃時花粉萌發(fā)率達(dá)25%～30%， 花粉管長度處于上升趨勢，在30～35 ℃時花粉萌發(fā)率和花粉管長度達(dá)最高值。 溫度為40 ℃時花粉萌發(fā)率和花粉管長度顯著下降， 且花粉萌發(fā)率降至最低， 干癟花粉粒數(shù)量增多， 花粉粒脫水嚴(yán)重?？梢?， 溫度對黃薇花粉萌發(fā)率影響較為顯著， 適宜的溫度為35 ℃。

2.1.2 硼酸質(zhì)量濃度對黃薇花粉萌發(fā)的影響 由表2 可見： 硼酸質(zhì)量濃度對黃薇花粉萌發(fā)率與花粉管生長影響差異顯著。 硼酸質(zhì)量濃度為0～0.5 g·L-1時， 花粉萌發(fā)率和花粉管生長隨著硼酸質(zhì)量濃度提高而呈上升趨勢， 花粉萌發(fā)率在0.5 g·L-1時達(dá)最高值為39.60%， 相較對照（24.20%）高出15.40%； 硼酸質(zhì)量濃度為0.5～2.5 g·L-1時， 花粉萌發(fā)率和花粉管生長， 隨著硼酸質(zhì)量濃度提高呈下降趨勢， 高于1.0 g·L-1時， 對黃薇花粉萌發(fā)和花粉管生長具有明顯抑制作用， 2.5 g·L-1時， 花粉萌發(fā)率與花粉管長度均降至最低， 花粉萌發(fā)率比對照降低了13.80%， 花粉管長度相比對照減少了102.67 μm。 因此，當(dāng)硼酸質(zhì)量濃度為0.5～1.0 g·L-1時， 對黃薇花粉萌發(fā)和花粉管生長具有明顯促進(jìn)作用。

2.1.3 蔗糖質(zhì)量濃度對黃薇花粉萌發(fā)的影響 由表3 可見： 不同質(zhì)量濃度蔗糖對黃薇花粉萌發(fā)與花粉管生長的影響差異顯著。 蔗糖質(zhì)量濃度為50.0 g·L-1時， 花粉萌發(fā)率和花粉管長達(dá)最大值， 花粉萌發(fā)率相比對照高出40.60%， 花粉管長度相比對照長308.86 μm。 黃薇花粉萌發(fā)及生長隨著蔗糖質(zhì)量濃度上升呈下降趨勢， 在250.0 g·L-1降至最低， 花粉萌發(fā)率比對照低0.40%， 花粉管長僅為5.38 μm。 因此， 有效促進(jìn)黃薇花粉萌發(fā)及花粉管生長的蔗糖質(zhì)量濃度為50.0～150.0 g·L-1， 最佳蔗糖質(zhì)量濃度為50.0 g·L-1。

表2 硼酸對黃薇花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響Table 2 Effect of boric acid on pollen germination and pollen tube growth of H. myrtifolia

表3 蔗糖對黃薇花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響Table 3 Effect of sucrose on pollen germination and pollen tube growth of H. myrtifolia

2.2 柱頭與花粉的掃描電鏡觀察

由圖1 可見： 柱頭平面為橢圓形， 中部明顯凹陷，輻射對稱， 表面密布不規(guī)則突起， 柱頭直徑為425.78～546.93 μm， 表面突起高度為24.42～29.13 μm； 花粉以多粒形式存在， 赤道面觀為橢圓形， 兩端鈍尖， 近極面和遠(yuǎn)極面相同， 三裂圓形， 花粉表面平滑， 密布細(xì)孔， 極軸長為23.15～26.74 μm， 赤道軸長為18.02～20.03 μm， 花粉較小。

圖1 柱頭與花粉掃描電鏡觀察Figure 1 Scanning electron microscopic observation of stigma and pollen

2.3 柱頭熒光顯微鏡觀察

2.3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對黃薇柱頭可授性的影響 由圖2 顯示： 對照柱頭氣泡明顯低于6-BA 浸泡處理后的柱頭； 不同質(zhì)量濃度6-BA 浸泡12 h 后， 柱頭周邊氣泡數(shù)量增多， 當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為20.0 mg·L-1時， 柱頭氣泡數(shù)量明顯增多， 此時柱頭的可授性最好。 100.0～400.0 mg·L-1GA3處理的柱頭相較于對照氣泡增多， 柱頭可授性明顯提高； 當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到600.0～800.0 mg·L-1時， 柱頭氣泡減少， 甚至停止反應(yīng)， 氣泡消失。 200.0～400.0 mg·L-1GA3利于增強(qiáng)柱頭的可授性。 NAA 浸泡處理后的柱頭氣泡數(shù)隨著質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢， NAA 質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時柱頭反應(yīng)最為劇烈， 氣泡最多； 1.0～10.0 mg·L-1范圍內(nèi)， 柱頭可授性增強(qiáng)； 當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度大于10.0 mg·L-1時柱頭反應(yīng)減弱， 可授性降低， 20.0 mg·L-1時， 柱頭反應(yīng)較低。

2.3.2 自然條件下黃薇柱頭可授性的動態(tài)變化 由圖3 可見： 在自然條件下， 黃薇在6：00 左右花瓣展開， 柱頭已經(jīng)直立且伸出， 頂端呈嫩綠色； 11：00-12：30 柱頭開始產(chǎn)生黏液， 開花6 h 時柱頭上已粘染大量花粉： 開花24 h 時柱頭彎曲變褐色， 柱頭黏性消失； 開花48 h 時柱頭徹底萎蔫， 花瓣干枯掉落。 開花1～8 h 柱頭可授性逐漸增強(qiáng)， 在開花6～8 h 時柱頭可授性達(dá)到最強(qiáng)， 隨后下降， 開花24 h 的柱頭基本不產(chǎn)生氣泡。

3 討論與結(jié)論

花粉保持活力時間的長短， 同時受到遺傳基因和環(huán)境因素的影響［11］， 溫度過高或過低， 均會對花粉萌發(fā)生長產(chǎn)生影響。 本研究表明： 黃薇花粉在15～35 ℃條件下， 花粉萌發(fā)及生長良好， 10 與40 ℃時花粉萌發(fā)及生長受到抑制， 這與桃Prunus persica［12］和玉米Zea mays［13］中觀察到的現(xiàn)象一致。 多重因素對花粉的離體萌發(fā)產(chǎn)生影響， 其中蔗糖和硼酸是花粉萌發(fā)的重要因素。 本研究表明： 促進(jìn)黃薇花粉萌發(fā)生長硼酸適宜質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg·L-1， 蔗糖適宜質(zhì)量濃度為50.0～150.0 mg·L-1， 這與四季報春Primula obconica花粉一致［14］。 柱頭可授期是植物花正常成熟的重要時期， 對花傳粉率及受精過程起著重要的作用［15-16］， 不同植物的柱頭可授期長短差異較大， 即使種內(nèi)不同品種的植物柱頭可授期也有較大差異。 通過外源植物生長調(diào)節(jié)劑可有效提高柱頭可授性或促進(jìn)柱頭增長。 本研究表明： 黃薇柱頭在開花48 h 時柱頭徹底萎蔫， 花瓣干枯掉落， 失去可授性。 通過6-BA、 GA3和NAA 等3 種植物生長調(diào)節(jié)劑處理能夠有效提高黃薇柱頭可授性， 20.0 mg·L-16-BA， 200.0～400.0 mg·L-1GA3及10.0 mg·L-1NAA 處理都可顯著提高黃薇柱頭可授性。 在雜交育種中花粉的結(jié)構(gòu)、 大小對雜交授粉受精成功與否有著重要關(guān)系， 花粉粒與柱頭的結(jié)構(gòu)性差異會直接造成雜交不親和問題［17-18］。 本研究表明： 黃薇花粉的赤道軸、 極軸長均小于30 μm， 屬于小型花粉， 如與其他屬植物進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交時， 應(yīng)選擇黃薇作為父本， 并且盡量選取花型較小，柱頭較短的植物與黃薇進(jìn)行雜交， 從而提高雜交成功率。

圖3 不同時段黃薇柱頭可授性Figure 3 Stigma receptivity of H. myrtifolia at different periods