諶晶晶 唐旭霞 徐慧芳 石涯

馬兜鈴酸(aristolochic acid, AA)為硝基菲類有機(jī)酸，其具有廣泛的藥理作用，如：抗癌、抗感染、增強(qiáng)細(xì)胞免疫。含馬兜鈴酸的中草藥達(dá)數(shù)十余種，如：關(guān)木通、天仙藤、廣防己、青木香、細(xì)辛等，目前，收載于中國藥典、部頒標(biāo)準(zhǔn)以及地方藥材標(biāo)準(zhǔn)的馬兜鈴科中藥材有24種、含馬兜鈴屬中藥材的中成藥口服制劑有47種[1]。但是，馬兜鈴酸具有明確的腎毒性，并且，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸可能是誘發(fā)肝癌的重要因素[2]，因此，很多國家對含馬兜鈴酸藥物的使用都有嚴(yán)格的規(guī)定。我國藥物監(jiān)督行政部門對含馬兜鈴酸的中藥材也實(shí)施了嚴(yán)格管制[3]。很多具有腎毒性的藥物，同時也有耳毒性，如：氨基糖苷類抗生素、順鉑類抗腫瘤藥物、中草藥雷公藤[4]等。馬兜鈴酸具有明確的腎毒性，但其有無耳毒性未見臨床報道，也尚無該方面的研究。斑馬魚具有與哺乳動物相似的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，身體透明，繁殖周期短，這些特征使斑馬魚成為高通量進(jìn)行藥物耳毒性及聽細(xì)胞保護(hù)劑研究的理想模型。故本研究利用斑馬魚來觀察馬兜鈴酸的腎毒性，并對馬兜鈴酸的耳毒性進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進(jìn)行。每次交配準(zhǔn)備4～5對成年斑馬魚，平均每對能產(chǎn)200～300個胚胎。在受精后6小時(即6 hpf)和24 hpf對胚胎進(jìn)行清理(移除已死亡胚胎)，并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。在28 ℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎(養(yǎng)魚用水水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μs/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3)。以受精后5天(5 dpf)的斑馬魚為研究對象[因?yàn)榕咛タ梢詮淖陨淼穆腰S囊中獲取營養(yǎng)物質(zhì)，所以在受精后9天內(nèi)(9 dpf)不需要喂食]。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥、儀器與試劑 馬兜鈴酸(阿拉丁，批號67451)：用1.0%的二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為6.8 mg/ml的儲備液，-20 ℃保存；慶大霉素(阿拉丁，批號39970)用超純水配制成25 mg/ml的儲備液，-20 ℃保存)，熒光立體顯微鏡(Nikon AZ 100, Japan)；6孔板(Nest Biotech)；二甲基亞砜(DMSO，阿拉丁，批號1095515)； DASPEI染料(sigma，批號109k1336)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1確定馬兜鈴酸的最大非致死濃度(maximum non-lethal concentration，MNLC) 馬兜鈴酸的初始檢測濃度設(shè)計(jì)為6.8、3.4、1.7、0.85、0.425 μg/ml。分別用上述不同濃度的馬兜鈴酸處理15尾5 dpf的斑馬魚，24 h后，統(tǒng)計(jì)不同濃度下斑馬魚的死亡數(shù)量，使用Graphpad prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制最佳的濃度效應(yīng)曲線，計(jì)算出馬兜鈴酸的MNLC。

1.3.2評價馬兜鈴酸的毛細(xì)胞毒性 根據(jù)MNLC，選取4個濃度(MNLC、1/2 MNLC、1/4 MNLC、1/8MNLC)的馬兜鈴酸，每個濃度處理30尾5 dpf的斑馬魚，分別命名為MNLC組、1/2 MNLC組、1/4 MNLC組、1/8MNLC組，所有實(shí)驗(yàn)組均含有相同濃度的溶劑。陽性對照組(慶大霉素組)：用2.5 μg/ml的慶大霉素飼養(yǎng)30尾5 dpf斑馬魚；陰性對照組(溶劑組)：用1.0%DMSO飼養(yǎng)30尾5 dpf斑馬魚 。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 馬兜鈴酸對斑馬魚的毛細(xì)胞損傷率計(jì)算公式如下：

×100%

根據(jù)毛細(xì)胞損傷率繪制劑量效應(yīng)曲線；采用方差分析和Dunnett’s T-檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1馬兜鈴酸的MNLC 不同濃度馬兜鈴酸組斑馬魚的死亡率見表1。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，用GraphPad 6.0擬合濃度致死曲線，未能得到MNLC擬合結(jié)果，故本研究取未出現(xiàn)斑馬魚死亡的最大濃度(3.4 μg/ml)為MNLC。

2.2馬兜鈴酸的毛細(xì)胞毒性 活體斑馬魚染色后，毛細(xì)胞與染料結(jié)合后，發(fā)綠色熒光；可見，斑馬魚的毛細(xì)胞分布在側(cè)線神經(jīng)丘及頭部，如圖1中紅色標(biāo)記所示。拍照后，用圖像處理軟件分析圖1中各組斑馬魚紅色部分毛細(xì)胞熒光強(qiáng)度，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：慶大霉素組(陽性對照組)毛細(xì)胞損傷率為88.5%，與陰性對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。馬兜鈴酸0.425、0.85、1.7、3.4 μg/ml各組(即1/8MNLC、1/4MNLC、1/2MNLC及MNLC組)毛細(xì)胞損傷率分別為12.4%、-0.4%、6.9%、-7.2%，與陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 不同濃度馬兜鈴酸誘發(fā)的斑馬魚死亡率(n=15)

表2 各組相對熒光強(qiáng)度及毛細(xì)胞的損傷率

注：與陰性對照組比較， *:P<0.01

2.3馬兜鈴酸對斑馬魚的腎毒性 各組剩余20尾斑馬魚飼養(yǎng)72 h后，馬兜鈴酸0.425、0.85 μg/ml組斑馬魚均無死亡，1.7 μg/ml組死亡率為10%，3.4 μg/ml組全部死亡。馬兜鈴酸1.7 μg/ml組中觀察到11.1%的斑馬魚出現(xiàn)嚴(yán)重的腎包膜水腫(圖2)。陽性對照組、陰性對照組及馬兜鈴酸0.425、0.85 μg/ml組均未觀察到明顯的腎包膜水腫現(xiàn)象。

3 討論

斑馬魚屬于低等脊椎動物，其生長周期短，產(chǎn)卵量大，胚胎體外發(fā)育且透明。斑馬魚雖然沒有外耳和中耳，但有典型的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，同時，其身體側(cè)線上用來感知周圍水流方向和變化的毛細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上也與哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞非常相似[5,6]。利用其胚胎透明的特點(diǎn)，可以在顯微鏡下直接觀察給藥前后內(nèi)耳形態(tài)的變化和身體側(cè)線上的毛細(xì)胞，便于進(jìn)行活體染色和觀察。2005年，Ton等[7]首次用斑馬魚模型來評估藥物耳毒性；2008年，Chiu等[6]使用斑馬魚模型篩查了FDA批準(zhǔn)使用的1 040種藥物，發(fā)現(xiàn)21種藥物具有斑馬魚耳毒性，其中2種藥物的耳毒性作用進(jìn)一步在大鼠實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)[6]，證明了斑馬魚在研究藥物耳毒性方面的價值。

3.1馬兜鈴酸的腎毒性 本研究所用馬兜鈴酸濃度雖然未能得出其最大非致死濃度，但在6.8 μg/ml的濃度下處理24 h，斑馬魚均死亡，明確了馬兜鈴酸對斑馬魚的毒性作用。本研究觀察到馬兜鈴酸1.7 μg/ml組中11%的斑馬魚出現(xiàn)了嚴(yán)重的腎包膜水腫，推測其死亡可能是因嚴(yán)重的腎毒性造成。Ding等[8]用馬兜鈴酸處理發(fā)育早期的斑馬魚，發(fā)現(xiàn)斑馬魚水腫以及腎臟形態(tài)功能異常，并最終導(dǎo)致斑馬魚死亡。腎臟是脊椎動物最主要的排泄器官，馬兜鈴酸是大分子物質(zhì)，與血漿白蛋白結(jié)合后不能經(jīng)腎小球?yàn)V過，其部分代謝產(chǎn)物主要經(jīng)由腎小管分泌、排泄，這一過程主要依賴于近端腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，因此，馬兜鈴酸誘發(fā)的腎損傷主要發(fā)生在近端腎小管[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激、DNA損傷、免疫炎癥機(jī)制、凋亡機(jī)制等都與馬兜鈴酸引起的腎臟損傷有關(guān)[1]。

3.2馬兜鈴酸的耳毒性 耳蝸中階外側(cè)壁上血管紋的血-迷路屏障能在一定程度上保護(hù)內(nèi)耳不接觸來自血液中的有害物質(zhì)。有研究顯示耳毒性藥物可能是通過血-迷路屏障從血液進(jìn)入到內(nèi)耳的液體循環(huán)[9]。目前并無馬兜鈴酸導(dǎo)致聽力損傷的臨床病例報道，推測馬兜鈴酸可能因分子較大而無法通過人體的血-迷路屏障。但斑馬魚身體側(cè)線毛細(xì)胞無該屏障的保護(hù)作用，并且實(shí)驗(yàn)中馬兜鈴酸的給藥方式是直接稀釋到溶劑DMSO中來飼養(yǎng)斑馬魚，馬兜鈴酸可以通過斑馬魚腸道和皮膚吸收進(jìn)入體內(nèi)，盡管如此，馬兜鈴酸仍然未對斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞造成損傷。推測可能與馬兜鈴酸的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)：馬兜鈴酸是硝基菲類有機(jī)酸，馬兜鈴酸及其衍生物的生理活性和毒性作用與分子結(jié)構(gòu)中的羥基、甲氧基和硝基的位置和數(shù)量相關(guān)[10]，分子結(jié)構(gòu)的差異可能是馬兜鈴酸無耳毒性的原因。本實(shí)驗(yàn)中未觀察到馬兜鈴酸的耳毒性，基于斑馬魚的給藥方式及其缺乏血-迷路屏障的保護(hù)作用，有理由認(rèn)為到達(dá)斑馬魚毛細(xì)胞的藥物濃度高于到達(dá)人內(nèi)耳的藥物濃度，因此推測不導(dǎo)致斑馬魚死亡的藥物濃度對人內(nèi)耳是相對安全的。但在血-迷路屏障受到損害，如內(nèi)耳缺血缺氧，或者藥物濃度進(jìn)一步增加的情況下，是否會造成人內(nèi)耳損傷，尚不能給出結(jié)論。而更高濃度的馬兜鈴酸會導(dǎo)致斑馬魚死亡，因而也無法通過斑馬魚模型來進(jìn)一步研究馬兜鈴酸對內(nèi)耳毛細(xì)胞的毒性作用。

本研究的不足之處在于：①馬兜鈴酸濃度的選擇欠佳，無法通過所選藥物濃度判斷馬兜鈴酸對斑馬魚的毒性作用是否存在劑量依賴關(guān)系；②僅依靠免疫熒光強(qiáng)度來判斷馬兜鈴酸是否存在耳毒性，而未觀察毛細(xì)胞的形態(tài)是否有輕微異常改變。在今后的實(shí)驗(yàn)中，將再設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)藥物濃度，進(jìn)一步通過透射電鏡觀察斑馬魚毛細(xì)胞的形態(tài)，甚至斑馬魚的行為改變，以期更全面地認(rèn)識馬兜鈴酸對斑馬魚毛細(xì)胞的影響。

圖1 馬兜鈴酸對斑馬魚毛細(xì)胞影響的熒光染色結(jié)果(紅色部分的綠色熒光為毛細(xì)胞)

圖2 馬兜鈴酸對斑馬魚腎包膜影響的染色結(jié)果(紅色部分為水腫的腎包膜)