劉 偉，常 征，黃 勇

（文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099）

白花三葉草（Trifolium repensL），又名白三葉草、荷蘭翹搖、菽草、白花苜蓿、白車軸草，為豆科三葉草屬多年生常綠草本植物，廣泛分布于溫帶及亞熱帶高海拔地區(qū)，在我國淮河以南和西南地區(qū)均有栽培。三葉草是優(yōu)質(zhì)牧草，莖葉細(xì)軟，葉量豐富，粗蛋白含量高，粗纖維含量低，既可放養(yǎng)牲畜，又可飼喂草食性魚類，具有良好的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。根部分蘗能力及再生能力均強(qiáng)，可以和菌根真菌形成良好的共生關(guān)系[1]。因其植株低矮，適應(yīng)性強(qiáng)，被廣泛用于機(jī)場、碼頭、高速公路、公園廣場、街頭綠地等場所，是優(yōu)良的水土保持和城市園林綠化植物。種子的萌發(fā)狀況是植物生長的關(guān)鍵步驟，在我國土壤酸化、土壤鹽漬化和干旱地區(qū)，土壤pH值、鹽脅迫、干旱脅迫等都是影響種子萌發(fā)的重要因素；研究不同脅迫條件下白花三葉草種子的萌發(fā)特性，對在具有相關(guān)逆境因素的區(qū)域推廣利用該植物資源具有重要意義。我國對白花三葉草的研究較晚，從種子萌發(fā)、固土護(hù)坡效果、蟲害、抗脅迫能力等方面的研究都有報(bào)道。王華軍對三葉草的病蟲害防治提了詳細(xì)的具體措施[2]，高占軍等研究得到鹽脅迫對白三葉種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢產(chǎn)生顯著的影響；當(dāng)NaCl濃度＜0.40%時(shí)白三葉幼苗和根的生長速度幾乎不受影響，≥0.40%時(shí)受到抑制；白三葉幼苗體內(nèi)游離脯氨酸、MDA和可溶性糖含量與鹽度的上升呈正相關(guān)關(guān)系[3]，黃壽臣等[4]研究表明：AM真菌與白花三葉草形成共生關(guān)系后能夠顯著改善復(fù)合鹽堿脅迫下白花三葉草的生長狀況。安利佳在1992年研究了白花三葉草葉愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的方法和技術(shù)[5]；陳寶書對三葉草的起源、生物學(xué)特性、形態(tài)特征、栽培技術(shù)等做了比較深入的研究[6]；胡迪先對紅三葉和白三葉的營養(yǎng)成分進(jìn)行了分析[7]。本研究以種子萌發(fā)中經(jīng)常遇到的土壤酸堿度、鹽堿化和干旱脅迫3種條件下的萌發(fā)特性為切入點(diǎn)，通過試驗(yàn)，得到白花三葉草在三種不同脅迫條件下的萌發(fā)特性，為白花三葉草在鹽堿化土壤或干旱條件下的推廣利用積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年10月底在文山學(xué)院草坪收集白花三葉草種子，曬干后選取健壯、子粒飽滿、完整的種子作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)前先用1%高錳酸鉀溶液表面滅菌 10 min，再用蒸餾水沖洗3～4次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同pH值對種子萌發(fā)影響的研究方法

先配制1 mol/L HCl和l mol/L NaOH，將培養(yǎng)溶液pH值調(diào)節(jié)成6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共5個(gè)梯度。將種子置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中并貼上標(biāo)簽，加入不同pH值溶液，處理后開始每天用膠頭滴管滴加相應(yīng)的pH溶液，使濾紙保持濕潤，每2 d更換一次培養(yǎng)液和濾紙，每處理50粒種子，重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿放在（25±1）℃、有自然光照的實(shí)驗(yàn)室里萌發(fā)，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，以胚根露出種皮為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，觀察記錄后及時(shí)清除已萌發(fā)種子。

1.2.2 鹽脅迫對種子萌發(fā)影響的研究方法

分別設(shè)置濃度為50、100、150 mmol/L的NaCl溶液，以蒸餾水培養(yǎng)作對照（CK），培養(yǎng)和處理方法同pH值溶液。

1.2.3 干旱脅迫對種子萌發(fā)影響的研究方法

用PEG6000配制干旱脅迫溶液，分別設(shè)置5%、10%、15%、20%、25%共5個(gè)濃度梯度，各處理均在（25±1）℃、自然光照的條件下進(jìn)行，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)50粒種子，以蒸餾水培養(yǎng)作對照（CK），種子的數(shù)量、萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)、培養(yǎng)方法和記錄方法同上。

1.2.4 種子萌發(fā)指標(biāo)的測定

發(fā)芽以胚根突破種皮，露白為發(fā)芽標(biāo)志，每24 h定時(shí)記錄種子萌發(fā)數(shù)。

發(fā)芽率（%）=試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢（%）=發(fā)芽達(dá)到高峰時(shí)的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

本試驗(yàn)發(fā)芽高峰期為發(fā)芽數(shù)最多的一天。

發(fā)芽指數(shù)（GI）＝ ∑（Gt/Dt），式中：Gt為 t時(shí)間內(nèi)發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)

平均發(fā)芽時(shí)間=∑（d）n/∑n，式中：d為開始試驗(yàn)日算起的天數(shù)，n為相應(yīng)各天正常發(fā)芽粒數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

所有測量數(shù)據(jù)用Excel2016和Spss16.0軟件進(jìn)行處理，不同試驗(yàn)因素進(jìn)行單因素方差分析，同一因素不同水平進(jìn)行LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH處理對白花三葉草種子萌發(fā)的影響

2.1.1 不同pH處理對白三葉草種子發(fā)芽率的影響

由表1可以看出，白三葉草種子在6.0和6.5時(shí)發(fā)芽率均達(dá)到92.67%，隨著pH值的上升，發(fā)芽率呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，發(fā)芽率都在86%以上。進(jìn)行方差分析后顯示組內(nèi)和組間的發(fā)芽率沒有顯著性差異，種子的發(fā)芽率與CK無顯著性差異，發(fā)芽率均可達(dá)到86.00%以上，說明白三葉草種子在萌發(fā)期對土壤酸堿性要求不嚴(yán)，都能正常萌發(fā)。

2.1.2 不同pH處理對白三葉草種子發(fā)芽勢的影響

表1顯示，pH為6.0時(shí)，種子的發(fā)芽勢達(dá)到最大值（36.00%），pH為6.0～7.0時(shí)發(fā)芽勢呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，且在pH為6.5、7.5、8.0時(shí)達(dá)到最小值31.33%。這說明在pH=6時(shí)，白三葉草的發(fā)芽速度和整齊度都達(dá)最高，種子發(fā)芽快、出苗整齊。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析可知，發(fā)芽勢在組內(nèi)和組間也沒有顯著性差異。

2.1.3 不同pH處理對白三葉草種子發(fā)芽指數(shù)的影響

由表1可看出，pH在6.0～7.0時(shí)，種子的發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；pH在7.0～8.0時(shí)，發(fā)芽指數(shù)隨pH值升高呈先增加后降低的趨勢，在pH6.0時(shí)達(dá)到最大值21.52，證明白三葉草種子生活力最強(qiáng)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，各處理之間的發(fā)芽指數(shù)存在顯著差異，之后進(jìn)行多重比較，在pH7.0時(shí)發(fā)芽指數(shù)顯著低于pH8.0，極顯著低于pH6.0、6.5和7.5，說明在pH7.0的環(huán)境對白三葉草種子的活力具有明顯的抑制作用。以上結(jié)果表明萌發(fā)環(huán)境的酸堿度對白三葉草種子的活力具有明顯的影響。

2.1.4 不同pH處理對白三葉草種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響

由表1可知，總體上看平均發(fā)芽時(shí)間變化趨勢不明顯，都在2.95～3.59 d范圍之內(nèi)波動。在pH6.0時(shí)，平均發(fā)芽時(shí)間最短為2.95 d，說明種子在pH6.0時(shí)發(fā)芽速度快，發(fā)芽能力較好。

表1 不同pH處理對白花三葉草種子萌發(fā)的影響

2.2 不同NaCl濃度處理對白三葉草種子萌發(fā)的影響

2.2.1 不同NaCl處理對白三葉草種子發(fā)芽率的影響

由表2可知，不同鹽濃度脅迫下，白三葉草種子的萌發(fā)情況不同，表現(xiàn)為：隨著鹽濃度的增高，發(fā)芽率逐漸下降，清水處理萌發(fā)率為95.33%，100 mmol/L 處理萌發(fā)率僅為26.00%，差異極顯著。對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較顯示100 mmol/L及以上濃度的NaCl處理后的萌發(fā)率顯著低于50 mmol/L 處理，說明有鹽脅迫的環(huán)境能明顯降低白三葉草種子的發(fā)芽率，增加萌發(fā)環(huán)境的鹽濃度能抑制種子的萌發(fā)。但在NaCl濃度為50 mmol/L時(shí)仍有64.00%的發(fā)芽率，表明白三葉草種子在萌發(fā)期對較低濃度的鹽脅迫具有一定的耐受性。

2.2.2 不同NaCl處理對白三葉草種子發(fā)芽勢的影響

由表2可知，不同鹽濃度條件下白三葉草種子的發(fā)芽勢不同，發(fā)芽勢高低順序?yàn)镃K＞50 mmol/L＞150 mmol/L＞100 mmol/L，表現(xiàn)為隨著鹽濃度的上升，發(fā)芽勢逐漸降低。方差分析顯示，各處理組存在顯著性差異，且均與對照組間存在極顯著性差異，表明鹽濃度對白三葉草種子的發(fā)芽速度和整齊度產(chǎn)生明顯的影響。

2.2.3 不同NaCl處理對白三葉草種子發(fā)芽指數(shù)的影響

不同鹽濃度條件下，白三葉草種子的發(fā)芽指數(shù)不同，發(fā)芽指數(shù)大小順序?yàn)镃K＞50 mmol/L＞150 mmol/L＞100 mmol/L。150 mmol/L 與 100 mmol/L處理差異不明顯但顯著小于50 mmol/L處理，極顯著小于對照組，結(jié)果表明高鹽濃度對白三葉草種子的活力具有顯著的抑制作用。

2.2.4 不同NaCl處理對白三葉草種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響

由表2可看出，隨著鹽濃度的升高，平均發(fā)芽時(shí)間呈現(xiàn)逐漸延長的趨勢，表明鹽脅迫延長白三葉草種子萌發(fā)的平均發(fā)芽時(shí)間，導(dǎo)致發(fā)芽速度變慢。

表2 不同NaCl濃度處理對白三葉草種子萌發(fā)的影響

2.3 不同PEG濃度處理對白三葉草種子萌發(fā)的影響

2.3.1 不同PEG濃度處理對白三葉草種子發(fā)芽率的影響

由表3可知，不同干旱脅迫條件下白三葉草種子的發(fā)芽率不同，表現(xiàn)為隨著干旱程度的增加，種子的發(fā)芽率逐漸下降，在PEG=5%時(shí)發(fā)芽率為72.67%，當(dāng)PEG濃度提高到10%和15%時(shí)，種子發(fā)芽率顯著下降，分別為44.67%和34.67%。進(jìn)行方差分析得到各PEG處理與對照組間存在極顯著性差異。表明PEG處理對白三葉草種子的發(fā)芽率具有明顯的影響。

2.3.2 不同PEG濃度處理對白三葉草種子發(fā)芽勢的影響

表3顯示，不同干旱脅迫條件下白三葉草種子的發(fā)芽勢不同，平均發(fā)芽勢順序?yàn)镃K＞5%＞10%＞15%＞20%＞25%，表現(xiàn)為隨著干旱程度的增加，種子的發(fā)芽勢逐漸下降。進(jìn)行方差分析和多重比較，PEG濃度10%與15%、15%與20%、20%與25%沒有明顯差異。PEG各濃度處理與對照組之間均存在極顯著性差異，表明PEG濃度對種子的發(fā)芽速度和整齊度產(chǎn)生了影響。

2.3.3 不同PEG濃度處理對白三葉草種子發(fā)芽指數(shù)的影響

不同干旱脅迫條件下白三葉草種子的發(fā)芽指數(shù)不同，發(fā)芽指數(shù)順序?yàn)镃K＞5%＞10%＞15%＞20%＞25%，表現(xiàn)為隨著干旱程度的增加，種子的發(fā)芽指數(shù)逐漸下降。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析可知，PEG濃度為15%、20%、25%與對照組間均存在極顯著性差異，表明高濃度的PEG對白三葉草種子的活力具有明顯的影響。

2.3.4 不同PEG濃度處理對白三葉草種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響

由表3可知，在PEG濃度為10%時(shí)，平均發(fā)芽時(shí)間最短（3.76 d），當(dāng)PEG濃度在10%～25%時(shí)，隨著PEG濃度升高，平均發(fā)芽時(shí)間呈現(xiàn)逐漸延長的趨勢。說明當(dāng)PEG濃度大于10%以后，延長了種子的發(fā)芽時(shí)間，導(dǎo)致萌發(fā)能力下降。

表3 不同PEG濃度處理對白三葉草種子萌發(fā)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

3.1.1 不同pH處理對白三葉草種子萌發(fā)的影響

在不同pH值處理下，白三葉草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)在pH值為6.0時(shí)發(fā)芽率（92.67%）、發(fā)芽勢（36.00%）、發(fā)芽指數(shù)（21.52）均達(dá)到最高，表明白三葉草種子萌發(fā)的最佳pH值為6.0，此pH值條件下種子表現(xiàn)出最強(qiáng)的生活力、萌發(fā)起始早、發(fā)芽整齊，完成整個(gè)發(fā)芽過程所需時(shí)間最短。但是方差分析發(fā)現(xiàn)白三葉草種子在pH值為6.0～8.0條件下均能正常萌發(fā)，表明白三葉草種子可適應(yīng)各種土壤類型。

3.1.2 不同濃度鹽脅迫對白三葉草種子萌發(fā)的影響

在不同NaCl濃度處理下，白三葉草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均與對照組間存在極顯著性差異。當(dāng)鹽濃度為50 mmol/L時(shí)，白三葉草種子仍能保持60%以上的發(fā)芽率，說明白三葉草種子能耐受相當(dāng)于50 mmol/L NaCl濃度的鹽脅迫，是一種較為耐鹽的植物。鹽濃度＞50 mmol/L時(shí)，白三葉草種子的萌發(fā)受到嚴(yán)重的影響，鹽分不僅延遲了種子萌發(fā)的起始時(shí)間，同時(shí)也延長了完成萌發(fā)所需的總時(shí)長。

3.1.3 不同程度干旱脅迫對白三葉草種子萌發(fā)的影響

在不同干旱脅迫條件下，白三葉草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間均呈現(xiàn)出隨著PEG濃度的增加而逐漸下降的趨勢，且與對照組存在顯著性差異，在PEG濃度為5%時(shí)，仍有60%以上的發(fā)芽率，表明白三葉草種子在發(fā)芽期對低程度的干旱具有一定的耐受性。

3.2 討論

發(fā)芽率說明種子的活性，主要是指胚的活性，發(fā)芽率高說明具有活性的種子數(shù)量多；發(fā)芽勢說明種子的發(fā)芽速度和發(fā)芽整齊度；發(fā)芽勢高，說明種子的整體活力強(qiáng)；發(fā)芽勢也是反映種子活力強(qiáng)弱的指標(biāo)，發(fā)芽率相同時(shí)，發(fā)芽勢高，種子活力強(qiáng)；平均發(fā)芽時(shí)間反映種子活力強(qiáng)弱，平均發(fā)芽時(shí)間短，說明種子活力越強(qiáng)。

土壤環(huán)境的酸堿度、電導(dǎo)率和干旱程度是影響種子萌發(fā)的重要因素，也是種子萌發(fā)過程中最常遇到的逆境因子，因此在研究種子逆境適應(yīng)性和對逆境的響應(yīng)時(shí)，大部分學(xué)者都采用pH值、NaCl溶液模擬鹽脅迫和PEG模擬干旱脅迫來進(jìn)行試驗(yàn)。用培養(yǎng)皿濾紙法、水培法等方法是常用的研究不同pH溶液對種子萌發(fā)影響在方法，許多用此方法研究的結(jié)果都表明種子在微酸性條件下萌發(fā)較好，胚的活性高、發(fā)芽速度和發(fā)芽整齊度高，種子表現(xiàn)出較強(qiáng)的活力，而且萌發(fā)后的幼苗長勢好[8-10]。本實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)論，可能是南方物種長期適應(yīng)弱酸性土壤的結(jié)果。

鹽脅迫抑制植物的生長發(fā)育，造成植物生理代謝紊亂，不同的生育期有不同的表現(xiàn)形式。鹽脅迫影響植物細(xì)胞的正常生長代謝過程，導(dǎo)致種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)降低[11]。在植物生長的整個(gè)生育期中，種子萌發(fā)期和幼苗生長期是最重要的2個(gè)階段，其中種子萌發(fā)期是最敏感的時(shí)期，也是對鹽脅迫響應(yīng)比較敏感的階段，決定著作物的生長以及產(chǎn)量。不同的研究者用海水、NaCl 溶液和其它鹽類模擬鹽脅迫條件下不同三葉草品種的種子萌發(fā)特性和幼苗的生長特性，幾乎都得到了相似的結(jié)果，認(rèn)為鹽脅迫對三葉草種子萌發(fā)和幼苗生長有一定的抑制作用，且抑制程度隨著濃度的提高而增加[12-14]，與本研究結(jié)果一致。

水分是種子萌發(fā)需要的重要外部條件，是制約種子萌發(fā)特性的重要因素。黃文娟等[15]對紅果小檗種子的萌發(fā)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，PEG濃度達(dá)到10%時(shí)，仍有60%以上的萌發(fā)率，說明紅果小檗種子是一種較為耐旱的植物。本研究得到白花三葉草在PEG濃度為5%時(shí)，有60%以上的發(fā)芽率，說明白三葉草種子也有一定的耐旱性，但比紅果小檗的耐旱性低。