浙江中醫(yī)藥大學藥學院 杭州 310053

海芋為天南星科海芋屬植物海芋（Alocasia macrorrhiza(L.)Schott）的干燥根莖，又名野芋、狼毒、獨角蓮、野芋頭、坡扣等，載于《本草綱目》，主要分布于我國華南、西南及福建、臺灣等地[1]。海芋味辛，性寒，有毒，具有清熱解毒、行氣止痛、散結消腫等功效，可用于治療高熱流感、風濕關節(jié)炎、疔瘡腫毒等疾病，同時也是浙江、上海地區(qū)地方抗癌用藥蛇六谷的來源之一[2-3]?，F代研究表明，海芋具有抗腫瘤[4]、抗肝癌[5]、抗炎鎮(zhèn)痛[6-7]、抗真菌[8-9]、抗氧化[10]等生物活性。本課題組前期研究發(fā)現，海芋石油醚部位對肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤具有明顯的抑制作用[11]。

目前國內外對海芋的研究主要集中于化學成分與藥理研究，其藥材鑒定學資料相對較少，僅有韋松基等[12]和郭微等[13-14]學者的報道，亦未見針對海芋藥材的顯微定量研究。而且不同地區(qū)的海芋由于生長環(huán)境的不同，可能在性狀、顯微及理化方面存在差異。由于海芋屬植物種類多樣，與海芋親緣關系相近的植物還有尖尾芋（Alocasia cucullata(Lour.)Schott）、箭葉海芋（Alocasia longiloba(Lour.)Schott）和南海芋（Alocasia hainanica(Lour.)Schott）等[15]。海芋屬植物外形相似，極易造成藥材品種混淆，誤采誤食還易造成中毒事件的發(fā)生，如神經系統(tǒng)毒性作用[16-18]。尤其同為天南星科海芋屬的尖尾芋，在性狀、顯微及理化特征及藥理活性方面與海芋存在諸多相似的特點,如尖尾芋也有抗腫瘤[19]、抗胃癌[20]、抗惡性黑色素瘤[21]等作用。因海芋與尖尾芋均有毒，為保證臨床用藥的安全性與來源可溯性，有必要對不同地區(qū)的海芋和混淆品尖尾芋進行對比分析。本文采用傳統(tǒng)的鑒別方法結合顯微定量分析法對不同地區(qū)的海芋和混淆品尖尾芋藥材進行研究，旨在為該藥的臨床應用及質量控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗用海芋原植物分別采自重慶、廣東、廣西、四川、江蘇，混淆品尖尾芋采自貴州。樣品批號分別為重慶海芋（20150630）、廣東海芋（20190308）、廣西海芋（20190310）、四川海芋（20190318）、江蘇海芋（20190309）、尖尾芋（20190320）。所采植物均為野生，經浙江中醫(yī)藥大學中藥資源研究所黃真教授鑒定，海芋為天南星科（Araceae）海芋屬（Alocasia）植物海芋（Alocasia macrorrhiza(L.)Schott）的葉及根莖，尖尾芋為天南星科（Araceae）海芋屬（Alocasia）植物尖尾芋Alocasia cucullata(Lour.)Schott的葉及根莖。甲醛-醋酸-乙醇（formalin-acetic acid-alcohol，FAA）固定液由10%甲醛5mL，冰醋酸5mL，70%乙醇90mL配制而成。

1.2 儀器 KD-BM生物組織包埋機及KD-BL包埋機冷凍臺（浙江金華市科迪儀器設備有限公司），HM430滑動切片機（賽默飛世爾科技有限公司），BX51正置顯微鏡及DP72顯微鏡攝影儀（奧林巴斯有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基原鑒定 觀察植物形態(tài)，結合文獻，仔細鑒定不同地區(qū)的海芋和尖尾芋根、莖、葉、花、果實等器官，并描述其特征。

1.3.2 性狀鑒定 通過眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等方法，對不同地區(qū)的海芋和尖尾芋飲片的形狀、大小、顏色、表面特征、質地、折斷面特征及氣、味等進行鑒定。

1.3.3 顯微鑒定

1.3.3.1 石蠟永久切片 對海芋和尖尾芋葉片、根莖進行石蠟永久切片制作[22]，顯微鏡下觀察，結合數碼顯微成像系統(tǒng)記錄觀察結果。

1.3.3.2 藥材粉末制片 取干燥藥材粉碎，過60目篩，混合均勻。取少量藥材粉末滴加水合氯醛溶液透化，后滴加少許稀甘油，蓋上蓋玻片后用吸水紙吸去多余液體，顯微鏡下觀察。

1.3.3.3 顯微定量分析 顯微觀測樣品制片：將樣品粉碎，過100目篩。準確稱取25mg樣品，加1mL水合氯醛溶液，充分混勻，取混懸液150μL透化，再滴加100μL甘油，用22mm×22mm蓋玻片封片。每份樣品平行制作3張裝片[23-24]。

1.3.3.4 顯微特征常數測定 將每張樣品制片平分為9個區(qū)域，置于10×10倍鏡下觀察，分別統(tǒng)計9個觀測視野中的草酸鈣針晶數，合并數據，計算草酸鈣針晶數量，并使用顯微成像系統(tǒng)測量每張裝片中草酸鈣針晶的長度。

其中：m為每片中草酸鈣針晶的數量（個），v為混懸液總體積（1mL），V 為裝片中混懸液體積（150μL），W 為取樣量（25mg）。

1.3.4 理化鑒定 取海芋藥材粗粉10g，置于圓底燒瓶中，加入75%乙醇100mL，水浴加熱回流1h，放冷后過濾。將醇提液分為若干份，分別檢查以下項目，觀察顏色反應并記錄實驗結果。見表1。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料若符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，以±s表示，各組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用顯著差異法（LSD-t）；不滿足方差齊性的計量資料，組間比較采用非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 理化鑒定檢查項目Tab.1 Examination items of physical and chemical identification

2 結果

2.1 基原鑒定 海芋為多年生大型草本植物，高0.5～1.5m，具匍匐、直立地上莖，莖呈圓柱形，直徑10～30cm。葉柄長60～90cm，基部擴大成鞘，抱莖；葉片呈闊卵形，先端短尖，亞革質，黃綠色，長50～90cm，寬 40～90cm，邊緣波狀；側脈 9～12對，下部較粗，向上漸狹?；ㄐ虮蕡A柱形，長12～60cm，2～3枚叢生。佛焰苞管部常卵形或短橢圓形；檐部舟狀，先端喙狀，長10～30cm。肉穗花序長10～17cm，短于佛焰苞，花序下部為雌花，中部為中性花，上部為雄花；附屬器圓錐狀，長3～5.5cm，粗1～2cm，嵌以不規(guī)則槽紋。漿果紅色，卵狀，長 8～10mm，粗 5～8mm，種子 1～2 枚。

尖尾芋為直立草本。高15～60cm，地上莖直徑 3～6cm，周圍具環(huán)形葉痕，葉柄基部擴大成鞘。葉片寬卵狀心形，先端驟狹具凸尖，膜質至亞革質，深綠色，長10～40cm，寬 7～28cm，邊緣全緣；側脈 5～8 對，葉片下部2對側脈由中側基部出發(fā)，往下彎曲再往上弧度延伸。花序柄呈圓柱狀，長20～30cm，常單生。佛焰苞近肉質，管部長圓狀卵形；檐部狹舟狀，邊緣內卷，先端具狹長的凸尖，長5～10cm，肉穗花序短于佛焰苞，長約10cm，花序下部為雌花，中部為中性花，上部為雄花；附屬器狹圓錐形，長約3.5cm，下部粗6mm。漿果近球形，直徑6～8mm，種子1枚。

2.2 性狀鑒定 不同地區(qū)的海芋根莖呈橢圓形、長橢圓形或圓柱形，大小不等，長者可達40cm，直徑2～8cm。表面棕色或棕褐色，具明顯環(huán)狀節(jié)與圓形根痕。質堅實，斷面白色粉質，內皮層環(huán)清晰，維管束呈淡黃色點狀散在。氣微，味淡，嚼之麻舌。商品呈類圓形或長橢圓形片狀，厚2～3mm，常卷曲成各種形態(tài)，邊緣皺縮。見圖1A。

尖尾芋根莖呈類圓柱形，大小不等，長10～20cm，直徑2.5～4.5cm。表面棕色或棕褐色，具環(huán)狀節(jié)或圓形根痕。質堅硬，斷面灰白色粉質樣，內皮層環(huán)較為明顯，維管束呈淡黃色點狀散在。氣微，味淡，嚼之麻舌。商品呈類圓形片狀，厚約3mm，木栓層常向內皺縮，飲片微有卷曲。見圖1B。

2.3 顯微鑒定

2.3.1 不同地區(qū)海芋和混淆品尖尾芋葉片顯微鑒定

2.3.1.1 葉片橫切面 海芋葉為兩面葉。上表皮細胞類長方形、稍大，下表皮細胞類長方形或類圓形，稍小；上下表皮均外被睫毛狀角質層，且上表皮角質層較密集，下表皮角質層較稀疏；柵欄組織1～2列，呈短柱狀，長45～65μm，約占葉肉組織1/2，上柵欄組織通過主脈，下柵欄組織于中脈處中斷；海綿組織位于柵欄組織下方，薄壁細胞形狀不規(guī)則，排列疏松；主脈呈半圓形，向下顯著突起，上面微微突起；維管束外韌型，木質部可見1～2個成對大型導管，以單個大型導管存在居多；主脈薄壁細胞與葉肉細胞中可見草酸鈣簇晶和針晶，多分布于靠近氣腔邊緣及內側處。不同地區(qū)的海芋葉片橫切面具有相似的結構特征。見圖 2A、圖 2B、圖 2F。

圖1 海芋和尖尾芋藥材飲片Fig.1 Medicinal pieces of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott and Alocasia cucullata(Lour.)Schott

尖尾芋為兩面葉。上表皮細胞類方形、略大，下表皮細胞較圓、略方，且形狀微小于上表皮細胞；上下表皮均具較薄的角質層，上表皮角質層較平坦，下表皮角質層較粗糙，凸起較多；柵欄組織1～2列，呈短柱狀，長50～100μm，約占葉肉組織1/3,上柵欄組織通過主脈，下柵欄組織于中脈處中斷；海綿組織位于柵欄組織下方，薄壁細胞排列寬廣，細胞之間較為疏松；主脈呈半圓形，向下顯著突起，上面微微隆起；維管束外韌型，散生，木質部可見1～2個大型導管，以成對導管存在居多；主脈薄壁細胞與葉肉細胞中可見草酸鈣簇晶和針晶，分布于氣腔周圍。見圖2C、圖2D。

2.3.1.2 葉下表皮撕片 不同地區(qū)的海芋下表皮細胞垂周壁較彎曲，排列緊密，氣孔較多；氣孔平軸式；副衛(wèi)細胞 2個，長 30～42μm，寬 12～32μm。尖尾芋下表皮細胞垂周壁較彎曲，氣孔較多，平軸式；副衛(wèi)細胞 2個，長 26～35μm，寬 5～10μm。從顯微結果觀察，可見海芋與尖尾芋的氣孔存在細微差別，表現為海芋的氣孔副衛(wèi)細胞寬度較大，而尖尾芋的副衛(wèi)細胞寬度較窄。見圖2E、圖3。

2.3.1.3 葉片粉末 不同地區(qū)海芋粉末大多墨綠色，存在大量螺紋導管；草酸鈣簇晶多見，多集中分布于薄壁細胞中，直徑13～30μm；草酸鈣針晶成束或散在，長 30～68μm。

尖尾芋粉末墨綠偏深，存在較多螺紋導管；草酸鈣簇晶散在分布于薄壁細胞，直徑15～27μm；草酸鈣針晶散在，長 25～62μm。

2.3.2 不同地區(qū)海芋和混淆品尖尾芋根莖顯微鑒定

2.3.2.1 根莖橫切面 海芋表皮細胞1列，切向延長，常脫落。木栓層較厚，由7～12列細胞組成，類長方形，切向長 34～104μm，徑向長 17～35μm，排列不甚規(guī)則。皮層細胞類圓形，排列疏松，散有外韌型根跡維管束，近木栓層處的細胞受擠壓呈類長方形。中柱維管束散在，多周木型，少外韌型，存在維管束走向不規(guī)則者；導管多數。薄壁組織中散有黏液細胞，內含草酸鈣針晶及簇晶；薄壁細胞中含淀粉粒。不同地區(qū)海芋結構相似，其中廣東、廣西、江蘇產海芋根莖中草酸鈣針晶與簇晶極為明顯，四川產海芋根莖中可見較多棕色塊，多分布于導管附近薄壁組織。見圖4。

尖尾芋表皮細胞一列，切向延長，常脫落。木栓層較厚，由5～6列扁平類長方形細胞組成。排列不甚規(guī)則。皮層細胞類圓形，排列較為疏松，散在外韌型根跡維管束。中柱維管束較多周木型，亦有外韌型維管束散在；導管多數，薄壁細胞中含黏液細胞，內含草酸鈣簇晶與草酸鈣針晶。數量相對于海芋根莖較少。見圖4F。

2.3.2.2 根莖粉末 海芋粉末黃白色。淀粉粒較多，常為單粒，呈長卵形、腎形或類圓形，直徑3～17μm，臍點及層紋均不明顯。草酸鈣針晶單個散在或成束存在于黏液細胞中，長29～90μm。草酸鈣簇晶較多，直徑26～65μm，棱角較尖銳。導管為環(huán)紋導管和螺紋導管，直徑24～95μm。木栓細胞黃棕色，類方形。棕色塊黃棕色或紅棕色，類圓形或橢圓形，散在。見圖5。尖尾芋粉末黃白色。淀粉粒眾多，常以單粒存在，類圓形居多，直徑4～25μm，臍點及層紋均不明顯。草酸鈣針晶較少，單個散在或成束分布，長30～88μm。草酸鈣簇晶直徑21～55μm，棱角較尖銳。環(huán)紋導管居多，直徑20～80μm。木栓細胞黃棕色，類方形或長方形。棕色塊黃棕至深紅棕色，較不規(guī)則，散在。

圖2 海芋與尖尾芋葉顯微鑒定Fig.2 Microscopic images of the leaves of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott and Alocasia cucullata(Lour.)Schott

2.3.3 顯微定量分析 根據實驗結果，重慶海芋草酸鈣針晶數量為86.28～125.11個/mg，廣東海芋128.27～140.53 個/mg，廣西海芋為 116.80～137.07 個/mg，四川海芋為104.27～122.40個/mg，江蘇海芋為114.93～137.07 個/mg,貴州海芋為 76.00～101.33 個/mg，6 組數據均滿足方差齊性，且與尖尾芋相比，廣東、廣西、四川、江蘇四個地區(qū)的海芋根莖中草酸鈣針晶數均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。重慶海芋草酸鈣針晶平均長度為 44.72～46.40μm，廣東海芋為 63.05～66.77μm，廣西海芋為 57.62～62.27μm，四川海芋為 48.47～51.04μm，江蘇海芋為58.75～62.88μm，尖尾芋草酸鈣針晶平均長度為56.89～64.19μm，6組數據均滿足方差齊性，且重慶，廣東與四川海芋針晶長度與尖尾芋相比有顯著性差異（P＜0.05）。見表 2。

圖3 不同地區(qū)的海芋與混淆品尖尾芋葉下表皮撕片氣孔(400×)Fig.3 Stomata of tear surface of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott lower epidermis in different regions and adulterant Alocasia cucullata(Lour.)Schott lower epidermis(400×)

表2 不同地區(qū)的海芋與混淆品尖尾芋根莖草酸鈣針晶的顯微數量統(tǒng)計（±s，n=3）Tab.2 The microscopic quantitative statistics of needle-like calcium oxalate crystal in the rhizome of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott in different regions and adulterant Alocasia cucullata(Lour.)Schott(±s,n=3)

表2 不同地區(qū)的海芋與混淆品尖尾芋根莖草酸鈣針晶的顯微數量統(tǒng)計（±s，n=3）Tab.2 The microscopic quantitative statistics of needle-like calcium oxalate crystal in the rhizome of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott in different regions and adulterant Alocasia cucullata(Lour.)Schott(±s,n=3)

注：不同地區(qū)的海芋與尖尾芋針晶數量與長度比較，*P＜0.05Note:The comparisom of the number and length of needle crystals between Alocassia macrorrhiza(L)Scott and Alocassia cullata(Lour.)Scott in different regions,*P＜0.05

樣品 草酸鈣針晶數量（個/mg） 草酸鈣針晶長度（μm）重慶海芋廣東海芋廣西海芋四川海芋江蘇海芋尖尾芋107.31±19.61 134.22±6.14*125.33±10.50*112.44±9.20*126.67±11.13*87.11±12.95 45.73±0.88*65.31±1.99*60.68±2.65 50.02±1.36*60.31±2.24 60.61±3.65

2.4 理化鑒定 不同地區(qū)海芋根莖醇提液含鞣質（加三氯化鐵顯墨綠色，加氯化鈉明膠產生白色沉淀），其中江蘇產海芋醇提液三氯化鐵顏色反應最為明顯；尖尾芋根莖醇提液含較少鞣質（加三氯化鐵顯淺綠色，加氯化鈉明膠產生白色渾濁）。不同地區(qū)海芋均含有皂苷（泡沫實驗泡沫不消失）；尖尾芋不含或含少量皂苷（泡沫實驗為負性結果）。不同地區(qū)海芋和尖尾芋均含有機酸（pH 5～6）。不同地區(qū)海芋均含黃酮（加鹽酸-鎂粉顯橙紅色；氨熏試驗呈黃色，紫外下顯黃色熒光；熒光試驗有強烈熒光），其中江蘇與廣東結果較為明顯；尖尾芋不含或含較少黃酮（鹽酸-鎂粉反應，氨熏試驗，紫外觀察及熒光試驗均為負性結果）。不同地區(qū)海芋均含甾醇、三萜類（Salkowski氯仿-濃硫酸反應，硫酸層呈現紅色或藍色，氯仿層有綠色熒光出現）；尖尾芋含甾醇、三萜類（Salkowski氯仿-濃硫酸反應，硫酸層呈現藍色，氯仿層無綠色熒光出現）。不同地區(qū)海芋和尖尾芋均含生物堿（加碘化鉍鉀產生橘紅色無定形沉淀；加硅鎢酸產生淡黃色沉淀）。初步證明海芋根莖中含有鞣質、皂苷、有機酸、黃酮、甾醇、三萜類、生物堿等化學成分，而尖尾芋中鞣質、皂苷及黃酮含量較少或無。

圖4 不同地區(qū)的海芋和混淆品尖尾芋根莖顯微鑒定（40×）Fig.4 Microscopic images of the rhizome of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott in different regions and adulterant Alocasia cucullata(Lour.)Schott（40×）

3 討論

3.1 不同地區(qū)海芋對比分析 實驗結果顯示，不同地區(qū)的海芋原植物特征，葉片和根莖的性狀特征及顯微特征均十分相似。具環(huán)狀節(jié)與圓形根痕，斷面具內皮層環(huán)與點狀維管束，嚼之麻舌；顯微鏡下可見根莖中柱維管束多周木型，少外韌型，黏液細胞中含草酸鈣針晶和簇晶；理化鑒定可初步證明海芋根莖中含有鞣質、皂苷、有機酸、黃酮、甾醇、三萜類和生物堿等化學成分。由于不同地區(qū)海芋的生長環(huán)境不同，海芋之間的細胞內含物可能略有差異。表現為根莖橫切面中，廣東、廣西及江蘇海芋的草酸鈣針晶及簇晶數量較多，且廣東海芋針晶的平均長度較長，四川海芋根莖的導管周圍棕色塊較多；在理化檢驗中江蘇的鞣質反應較明顯，廣東與江蘇的黃酮顏色反應較明顯，其他方面幾無差異。以上實驗表明不同地區(qū)海芋的性狀特征基本一致，可作為海芋的鑒別特征。

圖5 海芋根莖粉末顯微鑒定(400×)Fig.5 Microscopic images of the rhizome powder of Alocasia macrorrhiza(L.)Schott(400×)

3.2 海芋與尖尾芋的對比分析

3.2.1 海芋與尖尾芋的基原鑒別 筆者對不同地區(qū)的海芋與混淆品尖尾芋的鑒別研究發(fā)現，作為海芋的親近緣種，尖尾芋與海芋存在較大的相似之處。首先二者均為直立草本，具環(huán)形葉痕，葉柄基部擴大成鞘，花序柄圓柱形，檐部舟狀，具佛焰苞，肉穗花絮。花序下部為雌花，中部為中性花，上部為雄花，果實類型為漿果等。但海芋個體較大，葉片先端短尖，邊緣波狀，側脈數較多，花序柄2～3枚叢生，種子1～2枚；尖尾芋個體較小，葉片尖端驟狹具凸尖，邊緣全緣，側脈數較少，花序柄常單生，種子1枚等。

3.2.2 海芋與尖尾芋葉的鑒別 海芋與尖尾芋的葉片均為兩面葉，上表皮細胞較大于下表皮細胞；均有上下兩層柵欄組織，且上柵欄組織通過主脈，維管束外韌型具1～2個導管；薄壁細胞中均含草酸鈣針晶與簇晶。海芋上表皮具睫毛狀角質層，柵欄組織約占葉肉組織1/2，以單個大型導管為主；尖尾芋上表皮角質層較平坦，柵欄組織約占葉肉組織1/3，以成對導管為主。且葉片顯微中觀察到在下表皮細胞中，尖尾芋的氣孔副衛(wèi)細胞寬度較窄，而海芋副衛(wèi)細胞較寬。

3.2.3 海芋與尖尾芋根莖的鑒別 在藥材飲片的觀察中，不同地區(qū)的海芋與尖尾芋均呈圓柱形，表面棕色或棕褐色，具明顯的環(huán)狀節(jié)與圓形根痕。質堅實，斷面粉質，內皮層環(huán)明顯，維管束淡黃色點狀散在。海芋卷曲程度較大，邊緣皺縮，尖尾芋卷曲程度較小，形狀較為規(guī)則。根莖顯微中海芋和尖尾芋的結構特征相似，均由木栓層、皮層、根跡維管束、中柱維管束等組成，且薄壁細胞中均含草酸鈣針晶及簇晶。但海芋木栓層較厚，尖尾芋木栓層較薄。從實驗結果中觀察到海芋根莖的草酸鈣針晶和簇晶數量也明顯多于尖尾芋。理化實驗發(fā)現海芋和尖尾芋均含鞣質、有機酸、甾醇、三萜類、生物堿等化合物，但尖尾芋顏色反應不及海芋明顯。提示可能尖尾芋根莖中上述含量較少，且尖尾芋中皂苷及黃酮含量不易檢出。

目前關于海芋屬植物的鑒別分析資料較少，海芋與尖尾芋的鑒別特征也只有郭微與張宏偉等人[13-14]關于海芋與尖尾芋地上部分尤其是葉的比較分析，未有對海芋與尖尾芋根莖進行鑒定研究。本文運用傳統(tǒng)的中藥鑒定方法與顯微定量分析法對不同地區(qū)的海芋及尖尾芋進行研究，所得海芋的特征描述具有代表性，結果不但完善了海芋藥材的鑒定學資料，還為海芋屬近緣植物的鑒別提供參考。尤其在藥材區(qū)分中，根莖橫切面草酸鈣結晶的類型與分布可作為海芋的主要顯微鑒別特征。