陳競(jìng)茜 揭秋玲 龍平 鐘高布 孫超 盧惠 王櫻瑾王軍 馬燕琳，4

1海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院海南省人類生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科/海南省地方?。ǖ刂泻Ｘ氀┡R床醫(yī)學(xué)研究中心/?？谑腥祟愡z傳資源保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）（?？?70102）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510515）；3德克薩斯州心臟研究中心（休斯頓德克薩斯州77030）；4海南醫(yī)學(xué)院熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（海口571199）；

染色體病是常見(jiàn)的遺傳病，占新生兒疾病的0.7%［1］，2006年全球出生缺陷報(bào)告顯示，染色體病主要以21 三體綜合征、18 三體綜合征、13 三體綜合征為主，占出生缺陷的6.9%［2］。2017年一項(xiàng)基于人群的出生缺陷研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素包括染色體異常所致的出生缺陷約19.07%［3］。目前該病尚無(wú)有效的治療方法，只能是對(duì)高危人群進(jìn)行產(chǎn)前診斷來(lái)檢測(cè)該類疾病，預(yù)防該類患兒的出生。產(chǎn)前診斷包括有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷及無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，由于技術(shù)及準(zhǔn)確性等多方面考慮，目前較常用的產(chǎn)前診斷為羊膜腔穿刺術(shù)，目前其產(chǎn)前診斷的指征主要有：胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)（non-invasive prenatal testing，NIPT）高風(fēng)險(xiǎn)，B 超胎兒多發(fā)畸形，血清學(xué)篩查（唐氏篩查）高風(fēng)險(xiǎn)，父母染色體異常，高齡，不良孕產(chǎn)史和地貧攜帶［4-6］。為提高我國(guó)的出生人口素質(zhì)，臨床上主要用經(jīng)典的篩查方法：血清學(xué)篩查來(lái)評(píng)估染色體病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)率，陽(yáng)性病例進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷。隨著產(chǎn)前檢查技術(shù)的飛速發(fā)展，近年通過(guò)NIPT 進(jìn)行唐氏篩查得到了廣泛應(yīng)用［7］。隨著超聲醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，胎兒的超聲軟指標(biāo)的篩查也應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中。另外隨著我國(guó)二孩政策的實(shí)施，許多高齡孕婦增加，因年齡因素的胎兒患染色體病的概率也明顯增加，因此，高齡妊娠也成為產(chǎn)前診斷的一個(gè)重要指征。海南地區(qū)是地中海貧血（thalassemia，簡(jiǎn)稱地貧）高發(fā)區(qū)域，夫婦雙方如為地貧攜帶者需行羊膜腔穿刺術(shù)取羊水細(xì)胞以檢測(cè)胎兒的地貧基因型，防止地貧患兒的出生，同時(shí)檢測(cè)羊水細(xì)胞的染色體核型。本文總結(jié)了不同產(chǎn)前診斷指征，在我中心行羊水細(xì)胞培養(yǎng)的3 251 例孕婦的羊水細(xì)胞染色體核型結(jié)果，探討胎兒染色體異常核型與產(chǎn)前診斷指征的關(guān)系，為產(chǎn)前篩查及診斷提供參考，同時(shí)對(duì)提高染色體異常的檢出率，對(duì)進(jìn)一步提高產(chǎn)前診斷的效率具有非常重要的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2013年3月至2016年12月，在我中心遺傳咨詢門診進(jìn)行遺傳咨詢并經(jīng)羊膜腔穿刺術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦3 251 例，年齡19 ～45歲，孕周16 ～31周，產(chǎn)前診斷指征包括NIPT高風(fēng)險(xiǎn)、B 超胎兒多發(fā)畸形、唐氏血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、父母染色體異常、高齡、不良孕產(chǎn)史、地貧基因攜帶。

1.2 方法 在告知孕婦本人及家屬行羊膜腔穿刺術(shù)及羊水細(xì)胞染色體核型分析的風(fēng)險(xiǎn)及產(chǎn)前診斷范圍，孕婦及家屬簽署知情同意書后在B 超引導(dǎo)下，行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水20 mL，分裝于兩支15 mL 離心管，1 500 r/min，離心5 min 后棄上清，留取約0.5 mL 制成細(xì)胞懸液，按照兩線培養(yǎng)原則，分別無(wú)菌接種于兩個(gè)4.5 mL 羊水培養(yǎng)基的25 cm3培養(yǎng)瓶中，并分別平鋪混勻。置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，倒置顯微鏡下觀察羊水細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，當(dāng)羊水細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)旺盛，并且有3 個(gè)以上大克隆，或者7 個(gè)以上中克隆，細(xì)胞呈圓亮?xí)r，便進(jìn)行傳代處理，使細(xì)胞重新分布于4 個(gè)培養(yǎng)瓶里繼續(xù)培養(yǎng)2 ～3 d 后，當(dāng)傳代細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時(shí)，進(jìn)行兩線細(xì)胞收獲、制片，常規(guī)染色體G 顯帶，用德國(guó)蔡司全自動(dòng)染色體掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行核型分析，計(jì)數(shù)20 個(gè)分裂相，分析3 個(gè)核型，異常核型增加計(jì)數(shù)，分析量，發(fā)現(xiàn)嵌合體至少計(jì)數(shù)100 個(gè)分裂相，并收獲第3 瓶細(xì)胞再次進(jìn)行染色體分析；對(duì)于染色體結(jié)構(gòu)異常的核型，建議行父母染色體核型分析，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名（ISCN2013）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，卡方檢驗(yàn)分析各產(chǎn)前診斷指征與產(chǎn)前診斷結(jié)局的關(guān)系，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常核型在不同產(chǎn)前診斷指征中的檢出情況 3 251 例產(chǎn)前診斷的羊水標(biāo)本中共檢出染色體異常核型182 例，染色體異常核型檢出率為5.60%。不同產(chǎn)前診斷指征的染色體異常核型檢出率不相同，NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)的羊水細(xì)胞染色體異常核型檢出率最高，為83.84%，詳細(xì)檢出情況見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)前診斷指征的羊水細(xì)胞染色體異常核型檢出情況Tab.1 The diagnosis results of abnormal karyotype of different indication of antenatal diagnosis例

2.2 染色體異常核型分布情況 182 例染色體異常核型中常染色體數(shù)目異常130 例，性染色體數(shù)目異常8 例，平衡性結(jié)構(gòu)異常28 例，非平衡性結(jié)構(gòu)異常4 例，嵌合體10 例，倒位2 例。染色體的多態(tài)性如9 號(hào)染色體的臂間倒位，D/G 組隨體及短臂多態(tài)變異以及縊痕區(qū)的多態(tài)變化，在本文中不作討論。染色體異常核型詳細(xì)分布情況見(jiàn)表2。

表2 羊水細(xì)胞染色體異常核型分布情況Tab.2 The distribution of chromosomal abnormal karyotype of antenatal diagnosis（n=182） 例

2.3 不同產(chǎn)前診斷指征染色體異常核型差異情況 染色體異常核型組182 例，染色體正常核型組3 069 例。產(chǎn)前診斷指征中，染色體異常組和染色正常組中NIPT 是否為高風(fēng)險(xiǎn)，B 超胎兒是否多發(fā)畸形，唐氏篩查是否高風(fēng)險(xiǎn)，父母染色體是否異常，孕婦是否高齡及是否地貧基因攜帶比較，其染色體異常檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而是否具有不良孕產(chǎn)史比較，其染色體異常檢出率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.581）。見(jiàn)表3。

2.4 NIPT產(chǎn)前篩查優(yōu)于血清學(xué)篩查 NIPT對(duì)T21具有較高的準(zhǔn)確性，對(duì)T18 以及T13 仍存在較大的假陽(yáng)性率。本文統(tǒng)計(jì)了89 例T21，T18，T13 的孕婦無(wú)創(chuàng)性NIPT 檢測(cè)以及相應(yīng)的有創(chuàng)性羊水產(chǎn)前診斷結(jié)果對(duì)比，見(jiàn)表4。

表3 不同產(chǎn)前診斷指征染色體異常核型的差異Tab.3 The difference chromosomal abnormal karyotype in different indication of antenatal diagnosis 例（%）

表4 89 例孕婦無(wú)創(chuàng)NIPT 三體高風(fēng)險(xiǎn)與羊水細(xì)胞染色體診斷結(jié)果Tab.4 89 cases maternal NIPT′s trisomy high risk and antenatal diagnosis results 例

3 討論

3.1 針對(duì)性的產(chǎn)前診斷可以提高染色體異常的檢出率 染色體核型異?？蓪?dǎo)致染色體病，是常見(jiàn)的遺傳性疾病之一，目前仍無(wú)有效的治療方法，只能聯(lián)合應(yīng)用多種篩查及診斷方法互相補(bǔ)充診斷染色體病，從而減少該類遺傳性疾病患兒的出生。針對(duì)不同產(chǎn)前診斷指征，如NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)，B 超胎兒多發(fā)畸形，唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)，父母染色體異常，高齡，不良孕產(chǎn)史等進(jìn)行產(chǎn)前診斷是可以減少染色體病兒出生。本文回顧性地分析了3 251 例羊水標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)染色體異常核型182 例，異常檢出率為5.60%（182/3 251），與近幾年國(guó)內(nèi)其他地區(qū)文獻(xiàn)報(bào)道的檢出率相似，為5.93%～8.10%［8-9］。各地區(qū)報(bào)道的染色體核型異常檢出率具有細(xì)微差別，可能是由于納入分析的人群中產(chǎn)前診斷比例的不同以及各地區(qū)人群染色體異常的特異性所致。有針對(duì)性的產(chǎn)前診斷可以有效地診斷染色體病，降低遺傳性疾病缺陷兒的出生，產(chǎn)前診斷指征的嚴(yán)格把控，對(duì)提高染色體異常檢出率，進(jìn)一步提高產(chǎn)前診斷的效率具有重要意義。

3.2 NIPT 假陽(yáng)性率 NIPT 檢測(cè)作為一種較新的非介入的較高準(zhǔn)確性的產(chǎn)前篩查技術(shù)，該技術(shù)與傳統(tǒng)的唐氏篩查相比較，NIPT 對(duì)T21 有較高的準(zhǔn)確性。對(duì)于篩查為高危的孕婦，該檢查可以增加染色體陽(yáng)性檢出率，減少漏檢，可有效地降低穿刺檢查的數(shù)量。該技術(shù)接近于羊水胎兒染色體核型分析技術(shù)，具有高敏感性，高特異性，早期檢測(cè)，無(wú)創(chuàng)安全，其用時(shí)少，風(fēng)險(xiǎn)小，取材簡(jiǎn)單，不管是從心理和生理層面均減少了孕婦的痛苦及減少了大量不必要的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷等優(yōu)勢(shì)，較大程度地優(yōu)化了產(chǎn)前診斷流程，改善了產(chǎn)前診斷服務(wù)模式，正被越來(lái)越多的孕婦及家屬認(rèn)可［10-12］。但NIPT 仍具有一定的局限性，該技術(shù)條件要求較高，對(duì)染色體的數(shù)目異常及嵌合體，易位等結(jié)構(gòu)異常仍無(wú)法檢測(cè)，出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性［13-14］，其中T21 假陽(yáng)性率最低，為0.09%，T18 假陽(yáng)性率為0.19%；T13 假陽(yáng)性率最高為0.22%。既往研究中，ZHANG 等［7］納入112 669 例病例分析NIPT 檢測(cè)T21 的假陽(yáng)性率為0.05%，T18 的假陽(yáng)性率為0.045%，T13 的假陽(yáng)性率為0.04%。同時(shí)GRATI 等［15］納入3 222 例病例分析NIPT 檢測(cè)T21 的假陽(yáng)性率為0.097%。假陽(yáng)性結(jié)果與本研究中T21、T18 與T13 的假陽(yáng)性率接近。同時(shí)NIPT 不適宜檢測(cè)多胎妊娠［16］，因此NIPT 仍未能替代傳統(tǒng)的篩查方法及產(chǎn)前診斷。因無(wú)國(guó)家食品藥品監(jiān)督總局認(rèn)證，本實(shí)驗(yàn)室尚無(wú)開(kāi)展基因芯片技術(shù)及二代測(cè)序技術(shù)，只能依靠比較初級(jí)的檢測(cè)來(lái)提高產(chǎn)前診斷異常核型的檢出率。

3.3 不同產(chǎn)前診斷指征中染色體三體異常率最高 本研究發(fā)現(xiàn)的染色體異常核型中，以染色體三體異常率最高，為138 例，占所有異常核型75.8%（138/182），其中以21三體為主（95例），其占三體異常的68.8%（95/138），與文獻(xiàn)［5，17］報(bào)道基本一致。本研究的7 種產(chǎn)前診斷指征均與胎兒染色體異常密切相關(guān)。NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)的檢出率最高，為83.84%，99例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)中，羊水檢測(cè)54例為T21，16 例為T18，3 例為T13，5 例為性染色體異常，3 例為嵌合體，2 例為其他染色體異常。在3 251 例孕婦中，因唐篩高風(fēng)險(xiǎn)而進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷的有1 866 例，共檢出30 例異常核型，異常率為1.61%，23 例T21，1 例T18，2 例易位染色體核型，4 例嵌合體。由此可見(jiàn)唐篩不僅能檢出T21，T18，也能檢出其他異常的染色體。B 超檢測(cè)出的胎兒異常包括羊水過(guò)多或過(guò)少，腎積水，胎兒頸項(xiàng)透明層增厚，雙側(cè)（單側(cè)）脈絡(luò)叢囊腫，側(cè)腦室囊性水腫，胎兒水腫，胎兒心室內(nèi)強(qiáng)回聲點(diǎn)等各種胎兒畸形均可能與染色體有關(guān)［18-20］，B 超篩查是檢測(cè)胎兒遺傳病的重要手段。本文研究的B 超胎兒多發(fā)畸形的異常核型檢出率為8.96%，其中檢出8 例T18，4 例T21，2 例T13，1 例嵌合體，1 例其他染色體異常，18 三體在中孕時(shí)會(huì)出現(xiàn)多發(fā)畸形的各種結(jié)構(gòu)異常，B 超篩查對(duì)18 三體的敏感性較高，現(xiàn)在B 超作為一種無(wú)創(chuàng)傷性的產(chǎn)前診斷指征已受到關(guān)注。

3.4 高齡孕婦，夫婦染色體異常等更應(yīng)重視產(chǎn)前診斷 隨著我國(guó)計(jì)劃生育政策的放寬，欲生二孩的高齡孕婦越來(lái)越多。本研究中高齡孕婦的染色體異常檢出率為3.76%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于唐篩的異常檢出率1.61%，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于新生兒染色體異常率0.7%。母親高齡是形成“三體”病的原因之一。因?yàn)殡S著年齡的增加，女性的卵原細(xì)胞受外界的影響因素越來(lái)越多，卵巢功能開(kāi)始退化，導(dǎo)致配子的易發(fā)畸形，胎兒易患染色體異常的概率增加［21］。隨著年齡的增加，染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常發(fā)生率顯著增加，如21-三體，18-三體及13-三體［22-25］。我國(guó)的《母嬰保健法實(shí)施辦法》也規(guī)定，對(duì)高齡孕婦直接進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)的產(chǎn)前診斷。因此，對(duì)于高齡孕婦，更應(yīng)該重視產(chǎn)前診斷，對(duì)胎兒染色體進(jìn)行檢查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常，預(yù)防染色體病兒的出生。

夫婦染色體異常是僅次于NIPT 異常核型檢出率最高的一組。當(dāng)在臨床羊水標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常的染色體核型時(shí)，為了判斷該異常核型的來(lái)源均建議其雙親行外周血染色體核型分析。雖然大部分檢出的異常核型來(lái)源于父母的平衡性易位，可以發(fā)育至正常分娩，但少數(shù)異常胎兒的檢出仍需羊水穿刺來(lái)檢查。YU等［26］研究發(fā)現(xiàn)具有不良孕產(chǎn)史夫婦的胎兒染色體異常率為7.4%，本研究中異常檢出率為3.28%，均較新生兒染色體異常率0.7%明顯增高。因此，不良孕產(chǎn)史也是羊水產(chǎn)前診斷高危指征之一。

3.5 加強(qiáng)海南地區(qū)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷的宣教尤為重要 海南省是我國(guó)地貧基因攜帶、患病的流行的區(qū)之一。我省對(duì)可能生育的地貧兒或已生育地貧兒的家庭給予產(chǎn)前免費(fèi)檢查，并且對(duì)這部分孕婦在進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)取羊水進(jìn)行胎兒地貧基因檢測(cè)的同時(shí)也進(jìn)行胎兒細(xì)胞培養(yǎng)及核型分析。因海南地區(qū)偏遠(yuǎn)、少數(shù)民族較多，這部分患者的產(chǎn)前檢查意識(shí)較低，且大部分患者來(lái)自鄉(xiāng)鎮(zhèn)，幾乎不做產(chǎn)前篩查。本文研究了421 例因地貧攜帶來(lái)行產(chǎn)前診斷的孕婦，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析，減少地貧產(chǎn)前診斷中遺漏染色體異常病例。本研究中共發(fā)現(xiàn)10 例異常核型，異常核型率為2.38%，低于整體人群，與韋世錄等［27］的研究結(jié)果一致。以上數(shù)據(jù)提示，在防治地貧的同時(shí)，也要減少染色體異?；純旱某錾?，有針對(duì)性的產(chǎn)前診斷可以提高胎兒染色體異常的檢出率，對(duì)提高我國(guó)人口優(yōu)生很有社會(huì)效益。

綜上所述，結(jié)合NIPT 高風(fēng)險(xiǎn)，B 超異常，唐篩高風(fēng)險(xiǎn)，父母染色體異常，高齡等各種產(chǎn)前診斷指征來(lái)進(jìn)行羊水染色體檢查，以確診胎兒染色體核型，并對(duì)可能妊娠異常染色體胎兒的夫婦進(jìn)行遺傳咨詢，可以明顯提高染色體異常的檢出率，減少染色體異常兒的出生率，從優(yōu)生的角度提高我國(guó)出生人口的身體素質(zhì)具有重大意義。