張巧丹 牛思宇 李耕旭 陳建星 湯慶南 徐洪 楊方耿玉聰 李世峰

華北理工大學1醫(yī)學實驗研究中心，2基礎醫(yī)學院（河北唐山063210）

矽肺是危害最嚴重也是我國發(fā)病率最高的職業(yè)病，其主要病理特征是矽結(jié)節(jié)的形成及肺間質(zhì)纖維化。越來越多研究揭示了活性四肽N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸（N-acetylseryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP）的抗器官纖維化作用，本課題組圍繞Ac-SDKP 拮抗矽肺纖維化也做了較多工作。課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠矽肺纖維化的進展，乙?；⒐艿鞍爪粒╝cetylated tubulin α，Ac-Tub α）的表達水平逐漸降低。Ac-SDKP 通過穩(wěn)定Ac-Tub α 的表達，抑制肌成纖維細胞分化及膠原沉積，發(fā)揮抑制矽肺纖維化的作用［1］。然而具體機制尚未闡明。α-微管蛋白的第40 位的賴氨酸殘基是乙酰化的重要位點［2］，在進化上較為保守。有研究表明，α-微管蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶1（α-tubulin acetyltransferase 1，α-TAT1）是哺乳動物和線蟲體內(nèi)主要的、也可能是唯一的乙酰轉(zhuǎn)移酶［3］，動態(tài)調(diào)節(jié)α-微管蛋白的翻譯后修飾，影響微管骨架的穩(wěn)定［4-6］。本研究擬通過構(gòu)建矽肺纖維化動物模型及轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化模型，觀察Ac-SDKP 能否通過調(diào)節(jié)α-TAT1 的表達，穩(wěn)定微管蛋白的乙酰化水平，以進一步揭示Ac-SDKP 抑制矽肺纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性成年Wistar 大鼠18 只，體質(zhì)量（180±10）g，購于北京維通利華動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SLXK 京20090008。本研究已得到華北理工大學動物倫理委員會批準并保證整個研究過程符合倫理學要求，倫理批準文號：華北理工醫(yī)倫［2013］第038 號。

1.2 材料、主要試劑 二氧化硅粉塵（美國Sigama公司），Ac-SDKP（H-1156）（瑞士Bachem AG 公司），TGF-β1（100-21）（美國peprotech 公司），Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）兔抗（ab34710）（美國Abcam公司），α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）鼠抗（ab7871）（美國Abcam 公司），Ac-Tub α鼠抗（sc-23950）（美國Santa Cruz 公司），α-TAT1 兔抗（Qc13106）（北京奧維亞生物科技有限公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗（sc-25778）（美國Santa Cruz 公司），羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（武漢博士德生物有限公司），α-TAT1 過表達質(zhì)粒（廣州銳博生物有限公司），α-TAT1 沉默質(zhì)粒（廣州銳博生物有限公司），脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑（lipofectamine 2000，Lipo2000）（賽默飛世爾科技公司），DAB 顯色試劑盒（ZLI-9032）（北京中衫金橋）。

1.3 模型制備 采用HOPE-MED8050 動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建矽肺模型［7］，18 只大鼠隨機分為3 組：對照組（腹腔內(nèi)埋入含2 mL 生理鹽水的微量緩釋膠囊，至24 周處理）、矽肺模型組（腹腔內(nèi)埋入含2 mL 生理鹽水的微量緩釋膠囊，動式染塵每天3 小時，至24 周處理）、Ac-SDKP 處理組（腹腔內(nèi)埋入含2 mL 生理鹽水的微量緩釋膠囊，動式染塵3 h/d，染塵至12 周后將膠囊更換為含Ac-SDKP 的微量緩釋膠囊，至24 周處理）。

1.4 細胞培養(yǎng) 在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)原代肺成纖維細胞，所得第2 代細胞用于實驗。采用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染成纖維細胞，待培養(yǎng)瓶中的細胞融合至80%～90%左右即可用α-TAT1 過表達質(zhì)粒（α-TAT1-cpDNA）、α-TAT1 沉默表達質(zhì)粒（α-TAT1-siRNA）或空載質(zhì)粒體進行轉(zhuǎn)染，所得轉(zhuǎn)染細胞用于實驗。實驗分組如下：（1）α-TAT1 過表達質(zhì)粒載體構(gòu)建：空白對照組：空白培養(yǎng)基培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染試劑對照組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000；空載質(zhì)粒對照組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+空載質(zhì)粒體；α-TAT1 過表達質(zhì)粒組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+α-TAT1 過表達質(zhì)粒體。（2）α-TAT1 基因沉默質(zhì)粒載體構(gòu)建：陰性對照siRNA 組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+陰性對照siRNA；α-TAT1-siRNA#1組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+α-TAT1-siRNA#1；α-TAT1-siRNA#2 組：空白培養(yǎng)基+Lipo 2000+α-TAT1-siRNA#2；α-TAT1-siRNA#3組：空白培養(yǎng)基+Lipo2000+α-TAT1-siRNA#3。（3）α-TAT1 沉默與過表達實驗分組：對照組：空白培養(yǎng)基；TGF-β1 誘導組：以含TGF-β1（5 ng/mL）的培養(yǎng)基誘導48 h；Ac-SDKP 預處理組：Ac-SDKP（10-8mol/L）預處理1 h后，再給予TGF-β1（5 ng/mL）誘導48 h；α-TAT1 沉默組：α-TAT1-siRNA 轉(zhuǎn)染6 h，再以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，以Ac-SDKP 預處理1 h 后再給予TGF-β1 誘導24 h；α-TAT1 過表達組：α-TAT1-cpDNA 轉(zhuǎn)染6 h，再以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，以Ac-SDKP 預處理1 h 后再給予TGF-β1 誘導24 h。

1.5 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色法檢測大鼠肺組織中α-TAT1 的表達。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑封閉，滴加一抗（α-TAT1 抗體濃度為1：200）4 ℃孵育過夜，滴加二抗37 ℃孵育2 h，DAB 顯色，蘇木素復染，分化返藍，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。采用顯微鏡進行圖像采集。

1.6 免疫印跡 提取肺組織蛋白或提取肺成纖維細胞蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，據(jù)測定的蛋白濃度，用細胞裂解液和5×上樣緩沖液配置蛋白，電泳及電轉(zhuǎn)。一抗孵育（其中抗體濃度為Col I（1∶1 000）、α-SMA（1∶800）Ac-Tub α（1∶800）、α-TAT1（1∶800），在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜，次日滴加二抗（抗鼠/抗兔）在37 ℃孵育箱內(nèi)孵育30 min，而后ECL 發(fā)光顯色儀器顯影，保存對應的圖像并用Image-proplus 分析其灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。進行完全隨機設計的單因素方差分析，方差齊采取LSD 檢驗，不齊采取Tamhane′s 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ac-SDKP 通過調(diào)節(jié)α-TAT1 抑制大鼠矽肺纖維化的作用 免疫組織化學染色結(jié)果所示（圖1）：對照組肺泡壁較薄、結(jié)構(gòu)清晰完整，未見炎癥細胞滲出，α-TAT1 可強陽性表達于成纖維細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞及支氣管纖毛等處；模型組肺泡壁增厚、結(jié)構(gòu)紊亂，可見明顯的矽肺大結(jié)節(jié)及典型的間質(zhì)纖維化區(qū)域，α-TAT1 在矽結(jié)節(jié)處表達缺失；Ac-SDKP 處理組的病變程度較矽肺模型組減輕，肺泡壁結(jié)構(gòu)相對正常，α-TAT1 表達增多。

圖1 α-TAT1 在矽肺大鼠肺組織中的表達（免疫組織化學染色）Fig.1 Expression of α-TAT1 in lung tissues of silicosis rats（immunohistochemical staining）

Western blot 結(jié)果顯示（圖2、表1）：與對照組比較，矽肺模型組的Col I、α-SMA 表達上調(diào)至對照組的3.38 倍（P=0.034）、1.70 倍（P＜0.001）；Ac-Tub α和α-TAT1表達下調(diào)至對照組的31.58%（P＜0.001）和45.83%（P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義。與矽肺模型組相比較，Ac-SDKP 處理組的Col I、α-SMA表達下調(diào)至矽肺模型組的44.44%（P=0.095）、52.94%（P＜0.001）；Ac-Tub α、α-TAT1 表達上調(diào)至矽肺模型組的2.00 倍（P= 0.041）和1.45 倍（P=0.020），除Col I 外差異均有統(tǒng)計學意義。

2.2 Ac-SDKP 通過調(diào)節(jié)α-TAT1 抑制肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的作用 Western blot 結(jié)果顯示（圖3、表2），構(gòu)建α-TAT1 過表達質(zhì)粒載體，空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組和空載質(zhì)粒對照組之間，α-TAT1 的表達水平差異無統(tǒng)計學意義，而α-TAT1 過表達質(zhì)粒組中α-TAT1 表達與空載質(zhì)粒對照組相比明顯上調(diào)，其表達量為空載質(zhì)粒對照組的2.59 倍（P＜0.001），差異有統(tǒng)計學意義。構(gòu)建α-TAT1 沉默表達質(zhì)粒載體，與陰性對照siRNA 組相比，在各轉(zhuǎn)染組中α-TAT1-siRNA#2 組的α-TAT1 蛋白表達下調(diào)較為顯著，下調(diào)至陰性對照siRNA 組的39.75%（P=0.004），差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 Ac-SDKP 對矽肺大鼠肺組織中Col I、α-SMA、Ac-Tub α、α-TAT1 蛋白表達的調(diào)節(jié)（免疫印跡法）Fig.2 The expression of Col I, α-SMA,Ac-Tub α,α-TAT1 regulated by Ac-SDKP in lung from silicotic rats（western blot）

表1 肺組織中Col I、α-SMA、Ac-Tub α、α-TAT1 蛋白表達（n=4）Tab.1 The expression of Col I，α-SMA，Ac-Tub α，α-TAT1 in lung tissue（n=4） ±s

表1 肺組織中Col I、α-SMA、Ac-Tub α、α-TAT1 蛋白表達（n=4）Tab.1 The expression of Col I，α-SMA，Ac-Tub α，α-TAT1 in lung tissue（n=4） ±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與矽肺模型組相比，bP ＜0.05

組別對照組矽肺模型組Ac-SDKP處理組F值Col I 0.08±0.02 0.27±0.08a 0.12±0.08 9.69 α-SMA 0.20±0.03 0.34±0.03a 0.18±0.05b 22.51 Ac-Tub α 0.19±0.01 0.06±0.00a 0.12±0.02b 74.57 α-TAT1 0.24±0.02 0.11±0.02a 0.16±0.03b 28.17

圖3 α-TAT1過表達載體（n=3）與α-TAT1沉默載體（n=4）的篩選Fig.3 Screening of over-expression vector of α-TAT1（n=3），silencing vector of α-TAT1（n=4）

表2 α-TAT1 過表達（n=3）與沉默載體（n=4）的篩選Tab.2 Screening of over-expression（n=3）and silencing（n=4）vector of α-TAT1±s

表2 α-TAT1 過表達（n=3）與沉默載體（n=4）的篩選Tab.2 Screening of over-expression（n=3）and silencing（n=4）vector of α-TAT1±s

注：與空載質(zhì)粒對照組相比，aP ＜0.05；與陰性對照siRNA 組相比，bP ＜0.05

組別空白對照組轉(zhuǎn)染試劑對照組空載質(zhì)粒對照組α-TAT1 過表達質(zhì)粒組F 值α-TAT1 1.56±0.12 1.77±0.14 2.08±0.57 5.38±0.65a 50.06組別陰性對照siRNA 組α-TAT1-siRNA#1 組α-TAT1-siRNA#2 組α-TAT1-siRNA#3 組F 值α-TAT1 1.61±0.14 1.16±0.17b 0.64±0.02b 0.15±0.08b 115.73

圖4 α-TAT1 對TGF-β1 介導的肌成纖維細胞分化的調(diào)節(jié)（n=4）Fig.4 Regulation effect of α-TAT1 on TGF-β1 induced myofibroblast differentiation（n=4）

表3 α-TAT1 對TGF-β1 介導的肌成纖維細胞分化的調(diào)節(jié)（n=4）Tab.3 Regulation effect of α-TAT1 on TGF-β1 induced myofibroblast differentiation（n=4）±s

表3 α-TAT1 對TGF-β1 介導的肌成纖維細胞分化的調(diào)節(jié)（n=4）Tab.3 Regulation effect of α-TAT1 on TGF-β1 induced myofibroblast differentiation（n=4）±s

注：與對照組相比，aP ＜0.05；與TGF-β1 誘導組相比，bP ＜0.05；與Ac-SDKP 預處理組相比，cP ＜0.05

組別對照組TGF-β1誘導組Ac-SDKP預處理組α-TAT1沉默組α-TAT1過表達組F值Col I 0.17±0.01 0.83±0.02a 0.30±0.09b 0.77±0.05c 0.02±0.01 222.34 a-SMA 0.21±0.10 0.54±0.05a 0.38±0.03b 0.53±0.11 0.03±0.03c 35.23 Ac-Tub α 0.84±0.04 0.09±0.02a 0.33±0.02b 0.09±0.01c 0.78±0.06c 485.25 α-TAT1 1.65±0.09 0.86±0.16a 1.27±0.08b 0.82±0.11c 1.85±0.17c 50.53

Western blot 結(jié)果顯示（圖4、表3），與對照組相比，TGF-β1 誘導組的Col I、α-SMA 表達上調(diào)至對照組的4.88 倍（P＜0.001）、2.57 倍（P= 0.027），Ac-Tub α、α-TAT1 表達下調(diào)至對照組的10.71%（P＜0.001）、52.12%（P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義；Ac-SDKP 預處理后，Col I、α-SMA 蛋白表達下調(diào)至TGF-β1 誘導組的36.14%（P= 0.010）、70.37%（P=0.044），Ac-Tub α、α-TAT1 表達上調(diào)至TGF-β1 誘導組的3.67 倍（P＜0.001）、1.48 倍（P=0.001），差異均有統(tǒng)計學意義；在此基礎上給予α-TAT1 沉默時，Col I、α-SMA 表達上調(diào)至Ac-SDKP預處理組的2.57倍（P=0.004）、1.39倍（P=0.553），Ac-Tub α、α-TAT1 表達下調(diào)至Ac-SDKP 預處理組的27.27%（P＜0.001）、64.57%（P＜0.001），除α-SMA 外差異均有統(tǒng)計學意義；令α-TAT1 過表達，Col I、α-SMA 表達下調(diào)至Ac-SDKP 預處理組的6.67%（P=0.073）、7.89%（P＜0.001），Ac-Tub α、α-TAT1 表達上調(diào)至Ac-SDKP 預處理組的2.36 倍（P= 0.002）、1.46 倍（P＜0.001），除Col I 差異均有統(tǒng)計學意義。

3 討論

Ac-Tub α常作為微管穩(wěn)定的標志之一［5-6］，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在矽肺纖維化模型中，Ac-Tub α表達下調(diào)，能很好地反映矽肺的發(fā)生與發(fā)展［1］。在急性腎損傷中也有報道，Ac-Tub α水平下降［8］，阻礙了腎小管上皮細胞再生，加速腎纖維化的進程［8］。微管蛋白乙?；煞€(wěn)定微管骨架，維持上皮細胞的極化狀態(tài)，并通過穩(wěn)定肺泡上皮細胞緊密連接，有效地抵御外界刺激和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［9］，微管蛋白去乙?；龠M心肌成纖維細胞增殖和心臟纖維化［10］。課題組前期也發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP 通過抑制組蛋白去乙?；? 的活性，維持Ac-Tub α的乙?；?，從而有效的延緩矽肺纖維化［1］。可見，維持微管蛋白的乙?；剑{(diào)節(jié)微管骨架的穩(wěn)定性，有望成為控制矽肺纖維化病情進展的重要治療靶點。

在基礎和臨床上，針對微管穩(wěn)定的調(diào)節(jié)在抗器官纖維化的治療中逐漸被關(guān)注［11-12］，然而，據(jù)目前報道，微管穩(wěn)定劑可維持Ac-Tub α水平，但其抗器官纖維化效果存在差異。如ZHANG 等［13］證明，單側(cè)輸尿管梗阻模型給予微管穩(wěn)定劑紫杉醇治療，可有效的延緩腎纖維化進程。而KONG 等［8］發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷恢復期給予紫杉醇治療，反而加速腎纖維化。因此，微管穩(wěn)定劑抗纖維化的機制和療效復雜。

α-TAT1 是一種特異的微管乙酰轉(zhuǎn)移酶，其進入微管空腔，催化α 微管蛋白第40 位賴氨酸位點Lys-40 乙?；险{(diào)Ac-Tub α 水平［2-5］。由于其作用靶標明確，闡釋α-TAT1/Ac-Tub α 途徑在抑制器官纖維化中的機制更有價值。研究報道，在缺血再關(guān)注損傷中，腎組織微管網(wǎng)絡破壞和腎纖維化與α-TAT1 的表達水平降低有關(guān)［8］。課題組近期發(fā)現(xiàn)，α-TAT1 過表達能夠通過保護肺泡Ⅱ型上皮細胞［14］，和促進活化的成纖維細胞（肌成纖維細胞）凋亡［15］的雙重作用，抑制矽肺纖維化的進程。另有報道，肌動蛋白-轉(zhuǎn)錄因子心肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（myocardin-related transcription factor，MRTF）-血清反應因子（serum response factor，SRF）轉(zhuǎn)錄環(huán)可調(diào)節(jié)α-TAT1 基因表達，控制Ac-Tub α水平［16-17］。在本研究發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP 介導的Ac-Tub α水平上調(diào)和對α-SMA 表達抑制作用可被α-TAT1-siRNA 阻斷，證實α-TAT1 可調(diào)節(jié)細胞微管和微絲骨架動態(tài)變化，從而抑制肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化［17］。

綜上所述，本研究以α-TAT1 作為調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定的靶點，揭示了α-TAT1 具有一定的拮抗矽肺纖維化的效果。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP 可活化α-TAT1/Ac-Tub α 信號，抑制大鼠矽肺纖維化和肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化。未來的研究中，筆者將深入探討α-TAT1 對肺泡上皮細胞和成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化的機制，并著重比較α-TAT1 對上皮細胞和間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化的差異。這將對抗纖維化的靶向治療提供重要的實驗依據(jù)。