肖金成 康鑫鑫 朱文良 白淇文 李靖

1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院微創(chuàng)介入科（鄭州450003）；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科（鄭州450052）；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腫瘤內(nèi)科二病區(qū)（南寧530011）

肝癌是我國(guó)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為其主要類型［1］。盡管手術(shù)切除、肝臟移植、栓塞、消融、放射治療和化療已被應(yīng)用肝癌治療，手術(shù)復(fù)發(fā)率高和5年生存率低等問題仍舊困擾著臨床醫(yī)生［2-3］。因此，尋找新的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)以改善肝癌的診斷和結(jié)局至關(guān)重要。

組蛋白的乙酰化/去乙?；揎椩诨虮磉_(dá)調(diào)控中起重要作用。沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silence information regulator2，Sir2）蛋白及Sir2 相關(guān)酶類（Sir2-related enzymes，Sirtuin）是一類依賴于NAD+、核心區(qū)域高度保守的組蛋白去乙?；福▍⑴c蛋白乙?；揎棧２溉閯?dòng)物的Sirtuin 家族有7 個(gè)成員：Sirt1～Sirt7。其中，Sirt5 定位于線粒體基質(zhì)。研究［4］表明，Sirt5 缺乏會(huì)減少線粒體ATP 產(chǎn)生，并激活小鼠心臟中AMP 激活的蛋白激酶。在人肺癌細(xì)胞中，Sirt5 能夠?qū)⑻墙徒膺^程的限速酶丙酮酸激酶2（pyruvate kinase M2，PKM2）去琥珀?；?，抑制Sirt5 表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖［5］。Sirt5 失活還會(huì)導(dǎo)致線粒體絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2 去琥珀?；种平z氨酸分解代謝，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)［6］。這些發(fā)現(xiàn)提示Sirt5 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。另一方面，研究表明肝部特異敲除Sirt6 會(huì)導(dǎo)致糖酵解和甘油三酯合成，從而導(dǎo)致脂肪肝形成［7］。Sirt3 低表達(dá)與肝癌預(yù)后差有關(guān)［8］。而Sirt5是否參與肝癌的進(jìn)程及其可能的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究通過研究Sirt5 處理肝癌細(xì)胞后STAT3/Nanog 通路變化情況，揭示了Sirt5 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7 及HepG3 培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清、青霉素50 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL），培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。1～2 d換液1次，細(xì)胞匯合度達(dá)90%后0.25%胰酶消化傳代。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將細(xì)胞分為4 組：Blank 組（正常培養(yǎng)的細(xì)胞），AAV 組（空載體病毒組），AAV-Sirt5 組（AAV-Sirt5 病毒組），Sirt5+Colivelin 組（AAV-Sirt5 病毒+0.5 μmol/L STAT3 激活劑Colivelin，美國(guó)Santa cruz 公司）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞，以2 × 105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞融合至80%，換液并繼續(xù)培養(yǎng)6 h，將病毒原液按照感染復(fù)數(shù)（MOI）=20 加入培養(yǎng)液中，搖勻。24 h 后，去除病毒工作液并換液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞蛋白，檢測(cè)Sirt5 的表達(dá)情況。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 待細(xì)胞匯合度約為80%，胰酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞鋪于96 孔板中（2 × 105個(gè)/mL），每孔200 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24后取出，每孔加入100 μL 含有10%CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h 后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)為450 nm）檢測(cè)各孔吸光度（A）值。

1.4 Western Blot 檢測(cè) 用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)法（120 V，2 h）將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，加入含5%脫脂奶粉的TBST 室溫1 h，加抗人Sirt5，抗人p-STAT3，抗人STAT3，抗人Nanog 及抗人β-actin一抗4 ℃孵育過夜。隨后加入兔抗人二抗室溫孵育1 h。ImageJ 軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.5 RT-PCR 待細(xì)胞匯合度約為80%，胰酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)。Trizol 試劑提取總RNA。使用PrimeScript RT reagent kit（Takara，中國(guó)）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后使用SYBR Premix Ex Taq（Takara，中國(guó)）進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sirt5 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá) 與正常人肝細(xì)胞L02 相比，Sirt5 在肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7 及HepG3的mRNA水平顯著降低（圖1A）。此外，Western Blot結(jié)果表明Sirt5 在肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7 及HepG3的mRNA 水平顯著降低，其中以HepG2細(xì)胞水平最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。

圖1 各組Sirt5 表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of Sirt5

2.2 過表達(dá)Sirt5 抑制HepG2 細(xì)胞增殖及遷移AAV-Sirt5 轉(zhuǎn) 染HepG2 細(xì) 胞，RT-qPCR 及Western Blot 結(jié)果均表明Sirt5 表達(dá)水平升高，說明Sirt5 腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染成功（圖2）。CCK-8 實(shí)驗(yàn)表明（圖3A），與Blank 組（1.00 ± 0.05）或AAV 組（1.03±0.04）相比，AAV-Sirt5組（0.42±0.04）細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.05），說明過表達(dá)Sirt5 能夠顯著抑制HepG2 細(xì)胞增殖。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)Sirt5 能夠顯著抑制HepG2 細(xì)胞遷移能力（圖3B）。

圖2 Sirt5 表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of Sirt5

2.3 Sirt5 過表達(dá)抑制STAT3/Nanog 信號(hào)通路為了進(jìn)一步研究Sirt5 抑制HepG2 細(xì)胞增殖及遷移的機(jī)制，本研究對(duì)細(xì)胞中STAT3 的水平進(jìn)行了檢測(cè)。研究也表明，與Blank 組或AAV 組相比，過表達(dá)Sirt5 會(huì)顯著降低p-STAT3 和Nanog 的相對(duì)表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）；而STAT3 激活劑colivelin 的加入顯著逆轉(zhuǎn)了Sirt5 對(duì)STAT3 的抑制作用（P＜0.05）。CCK-8 及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)也表明與AAV-Sirt5 組相比，Sirt5+Colivelin 組細(xì)胞增殖和遷移能力顯著升高（圖3）。

3 討論

圖3 過表達(dá)Sirt5 對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響Fig.3 Effects of Sirt5 on cell proliferation and migration

圖4 STAT3 和Nanog 表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of STAT3 and Nanog

Sirtuin 是一個(gè)高度保守的去乙?；讣易宓鞍准易濉irtuin 具有廣泛的生理功能，并在調(diào)控衰老和壽命方面發(fā)揮重要的作用。但目前科學(xué)家對(duì)于Sirtuin 家族成員在腫瘤發(fā)生中的作用存在爭(zhēng)議。研究表明Sirt7 在HCC 癌癥組織中上升，并促進(jìn)HCC 細(xì)胞生長(zhǎng)，其缺失使細(xì)胞周期停留在G1［9］。而Sirt4 在結(jié)直腸癌中具有抑制癌癥的功能［10］。Sirt5 是Sirtuin 家族的一員，定位于線粒體中。Sirt5缺乏賴氨酸去乙?；富钚裕ㄎ⑷酰珦碛蠳AD依賴的去丙二?；富钚?。研究［11］表明Sirt5 可催化賴氨酸去琥珀酰化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)超琥珀酰基化時(shí)，一些代謝信號(hào)通路遭到破壞，包括肝臟中脂肪酸累積以及酮體生成減少。Sirt5 參與多種癌癥的發(fā)展進(jìn)程。在人肺癌細(xì)胞中，Sirt5 能夠?qū)⑻墙徒膺^程的限速酶PKM2 去琥珀?；?；在Sirt5 缺失的細(xì)胞中，PKM2 琥珀酰水平增加，其丙酮酸激酶活性下降，抑制Sirt5 表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖［5］。在非小細(xì)胞肺癌患者中，Sirt5 高表達(dá)，并與預(yù)后差有關(guān)［12］。Sirt5 可靶向作用于核因子E2 相關(guān)因子2（細(xì)胞抗氧化程序中的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子），其敲除會(huì)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)［12］。過表達(dá)Sirt5可減小異檸檬酸脫氫酶（IDH1）超琥珀酰化，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性生長(zhǎng)［13］。但Sirt5 在HCC 患者中的作用和機(jī)制還有待進(jìn)一步確認(rèn)。本研究表明，Sirt5 在肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7 及HepG3 均降低，而在HepG2 中水平最低。這可能與肝癌細(xì)胞的侵襲能力（HepG2 的侵襲能力小于Huh7 和MHCC97H）有關(guān)。本研究的成果與WANG 等［8］的研究結(jié)果相似，即在HCC 患者癌癥組織中，Sirt5 低表達(dá)。CHEN［14］等近期也揭示Sirt5 能通過抑制過氧化物酶體誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，抑制HCC 發(fā)展。

白介素6/STAT3 是HCC 干細(xì)胞更新和增殖的主要信號(hào)通路［15］。研究［16］發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞系中Sirt5 去乙酰化STAT3，從而抑制STAT3 在線粒體丙酮酸代謝中的作用。本研究也表明過表達(dá)Sirt5可以抑制STAT3 的磷酸化及Nanog 蛋白表達(dá)。用STAT3 特異性激活劑colivelin 激活STAT3 消除了Sirt5 對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，表明STAT3/Nanog 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)Sirt5 介導(dǎo)的HCC 細(xì)胞增殖和遷移中起著重要的作用。Nanog 是一種自我更新基因，可維持胚胎干細(xì)胞的多能性［17］。研究［18］表明，STAT3/Nanog 通路在肝臟腫瘤干細(xì)胞中被激活，導(dǎo)致致瘤性和干性。JSI-124（一種STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑）可有效地抑制惡性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的增殖及形成神經(jīng)球的能力［19］。提示Sirt5 可能通過調(diào)節(jié)HCC 干細(xì)胞更新和增殖調(diào)節(jié)HCC 發(fā)展。

綜上所述，本研究表明Sirt5 在肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)，過表達(dá)Sirt5 可以抑制HepG2 細(xì)胞增殖及遷移能力，而此過程可能與抑制STAT3/Nanog 信號(hào)通路有關(guān)。以上研究結(jié)果揭示Sirt5 能夠通過調(diào)節(jié)STAT3/Nanog 通路抑制肝癌發(fā)展，且Sirt5 有望成為治療肝癌的靶標(biāo)分子。未來將著重于Sirt5 對(duì)HCC細(xì)胞干性的影響及在動(dòng)物模型中探討Sirt5 下調(diào)是否會(huì)推動(dòng)HCC 的起始和進(jìn)展。