李若飛，解俊杰，梁慧萍，吳靜

咸陽市中心醫(yī)院骨四科1、皮膚美容科2，陜西 咸陽 712000

骨肉瘤是原發(fā)于骨髓內(nèi)的高惡性腫瘤，是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，75%的患者在10～30歲發(fā)病，且好發(fā)于男性[1]。骨肉瘤易復(fù)發(fā)并且早期轉(zhuǎn)移率非常高，在初診的骨肉瘤患者中有10%～20%出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且90%為肺轉(zhuǎn)移，骨肉瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)就預(yù)示預(yù)后不良[2]。因此闡明骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)改善骨肉瘤的診斷方法和提高治療效果有重要意義。

大量研究表明，微小型RNA(microRNA，miRNA)是一類17～25 nt長短的小RNA分子，不具有蛋白編碼功能。miRNA在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤血管生成、浸潤及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[3]，通過與靶基因mRNA上特定序列結(jié)合，可以剪切靶基因的mRNA分子或抑制靶基因蛋白質(zhì)翻譯，從而起到調(diào)控靶基因的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞中miR-424抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-6]，但其具體分子機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，PAK2在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)，抑制其表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[7]。頭頸鱗癌中PAK2-c-Myc-PKM2軸是一個(gè)致癌通路，促進(jìn)癌癥進(jìn)展[8]。PAK2基因在骨肉瘤中的表達(dá)尚無報(bào)道，本文就miR-424和PAK2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及miR-424是否可通過調(diào)控PAK2基因來抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡展開研究，以期為今后骨肉瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 健康人成骨細(xì)胞系hFOB1.19、骨肉瘤細(xì)胞系MG63、U2-OS、SOSP-9607購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM培養(yǎng)液購于Gibco，RT-PCR相關(guān)試劑盒購于日本TaKaRa,miR-424、內(nèi)參U6的引物購于美國ABI公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Invitrogen公司，一抗PAK2購自美國Abcam公司，總蛋白提取試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司，CCK-8試劑盒購于Dojindo。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，其中青霉素1×105U/mL，鏈霉素100 mg/mL。置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Real-time PCR法檢測(cè)RNA的表達(dá) 根據(jù)Trizol法抽提總RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行操作，合成cDNA。miR-424-F：5'-CAGCAGCAATTCATGTTTTGAA-3'，miR-424-R：5'-CAAAACATGAATTGCTGCTGT-3'；PAK2-F：5'-TG AGCACACCATCCATGTTGG-3'，PAK2-R：5'-AGGT CTGTAGTAATCGAGCCC-3'；U6 作為內(nèi)參，U6-F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'； U6-R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。按照SYBR Green I PCR檢測(cè)試劑盒說明書在ABI7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性 5 s，60℃退火 32 s，70℃延伸30 s，循環(huán)40次。溶解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃15 s。2-△△Ct法測(cè)定各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣品孔重復(fù)檢測(cè)3次，取均值。

1.2.3 Western bolt檢測(cè)蛋白的表達(dá) 按照蛋白提取試劑盒說明書提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度，取25 g蛋白上樣，SDS-PAGE充分分離后，轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜，室溫條件下封閉液封閉1 h，加稀釋后I抗，4℃條件下過夜，第二天用TBST洗膜3次，每次15 min，之后加入相應(yīng)Ⅱ抗，室溫條件下孵育2 h，TBST洗膜，加入顯影液顯影，以β-actin作內(nèi)參，利用Image J軟件計(jì)算條帶灰度比，利用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長期的骨肉瘤U2-OS細(xì)胞，適當(dāng)密度接種到6孔板上。細(xì)胞融合到70%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將過表達(dá)miR-424的模擬物和其miR陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至U2-OS細(xì)胞中，分別標(biāo)記為miR-424組和miR-con組。轉(zhuǎn)染5 h后換為含血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果(參照上述1.2.2中的方法)。后續(xù)試驗(yàn)中，將U2-OS細(xì)胞隨機(jī)分為anti-miR-424組(轉(zhuǎn)染干擾miR-424的模擬物)、anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染干擾miR-424的miR陰性對(duì)照)、si-PAK2 組(轉(zhuǎn)染沉默PAK2的siRNA)、si-con組(轉(zhuǎn)染沉默PAK2的陰性對(duì)照)、miR-424+pcDNA-PAK2組(miR-424模擬物與pcDNA-PAK2載體共轉(zhuǎn)染)、miR-424+pcDNA組(miR-424模擬物與pcDNA空載體共轉(zhuǎn)染)六組，采用上述方法轉(zhuǎn)染后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長期的各組U2-OS細(xì)胞消化后，以每孔5×103的密度接種于96孔板中，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后加入10 L CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測(cè)各孔吸光度值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組待測(cè)細(xì)胞，離心漂洗去上清后，按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作。具體用緩沖液重懸細(xì)胞，輕搖至均勻，避光孵育15 min，加入適量Annexin V-FITC，避光條件下孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤細(xì)胞系和健康人成骨細(xì)胞中miR-424和PAK2的表達(dá)水平比較 與健康人成骨細(xì)胞hFOB1.19相比，骨肉瘤細(xì)胞系 MG63、U2-OS、SOSP-9607中miR-424的表達(dá)量明顯下降，PAK2的mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1和表1。

圖1 骨肉瘤細(xì)胞系和健康人成骨細(xì)胞中PAK2蛋白表達(dá)

2.2 上調(diào)miR-424表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖和細(xì)胞凋亡的影響 與miR-con組比較，上調(diào)miR-424表達(dá)明顯增加骨肉瘤U2-OS細(xì)胞中miR-424的表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量，顯著降低48 h和72 h的細(xì)胞活力、促增殖蛋白Cyclin D1的表達(dá)量、抑凋亡蛋白Bcl-1的表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而24 h的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2和圖2。

表1 骨肉瘤細(xì)胞系和健康人成骨細(xì)胞中miR-424和PAK2的表達(dá)水平比較(±s，n=6)

表1 骨肉瘤細(xì)胞系和健康人成骨細(xì)胞中miR-424和PAK2的表達(dá)水平比較(±s，n=6)

注：與hFOB1.19組比較，aP＜0.05。

組別hFOB1.19組MG63組U2-OS組SOSP-9607組F值P值PAK2蛋白0.46±0.03 0.76±0.06a 0.85±0.06a 0.82±0.08a 53.007＜0.05 miR-424 1.00±0.07 0.48±0.05a 0.25±0.02a 0.33±0.03a 313.471＜0.05 PAK2 mRNA 1.00±0.08 4.45±0.45a 5.87±0.59a 4.28±0.43a 137.353＜0.05

表2 上調(diào)miR-424表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖和細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=6)

表2 上調(diào)miR-424表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖和細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=6)

組別miR-424細(xì)胞活力(OD490 nm)細(xì)胞凋亡率(%)Cyclin D1Bcl-2Bax miR-con組miR-424組t值P值0.99±0.08 4.58±0.41 21.051＜0.05 24 h 0.38±0.02 0.36±0.02 1.732 0.114 48 h 0.79±0.04 0.54±0.03 12.247＜0.05 72 h 1.19±0.06 0.81±0.05 11.918＜0.05 8.47±0.55 21.75±1.38 21.897＜0.05 0.87±0.05 0.45±0.03 17.644＜0.05 0.58±0.05 0.43±0.04 5.738＜0.05 0.47±0.05 0.78±0.06 9.722＜0.05

圖2 骨肉瘤細(xì)胞U2-OS凋亡率及增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)注：A，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS凋亡；B，Western blot檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS中Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。

2.3 miR-424靶向PAK2并負(fù)向調(diào)控其表達(dá) TargetScan(http://www.targetscan.org/)軟件檢測(cè)結(jié)果，miR-424和PAK2之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖3A。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果表明，同miR-con與WT-PAK2共轉(zhuǎn)染相比，miR-424與WT-PAK2共轉(zhuǎn)染后，U2-OS細(xì)胞熒光素酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而miR-con、miR-424分別與MUT-PAK2共轉(zhuǎn)染后，U2-OS細(xì)胞熒光素酶活性變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。與miR-con組相比，miR-424組中PAK2蛋白的表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；相反，anti-miR-424組中PAK2蛋白的表達(dá)量較anti-miR-con組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4和圖3B。

圖3 miR-424與PAK2互補(bǔ)的核苷酸序列以及miR-424調(diào)控PAK2表達(dá)

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s，n=6)

組別miR-con組miR-424組t值P值WT-PAK2 1.00±0.05 0.63±0.07 10.536＜0.05 MUT-PAK2 0.96±0.09 1.08±0.12 1.960 0.079

表4 miR-424調(diào)控PAK2的表達(dá)(±s，n=6)

注：與miR-con組比較，aP＜0.05；與anti-miR-con組比較，bP＜0.05。

組別miR-con組miR-424組anti-miR-con組anti-miR-424組F值P值PAK2 0.81±0.04 0.38±0.05a 0.69±0.06 0.92±0.08b 92.482＜0.05

2.4 下調(diào)PAK2表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖和凋亡的影響 與si-con組比較，下調(diào)PAK2表達(dá)明顯降低48 h和72 h的細(xì)胞活力、PAK2蛋白的表達(dá)量、促增殖Cyclin D1蛋白的表達(dá)量、抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量，顯著提高細(xì)胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而24 h的細(xì)胞活力差異不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表5和圖4。

表5 下調(diào)PAK2表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖和凋亡的影響（x-±s，n=6）

圖4 骨肉瘤細(xì)胞中PAK2、Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

2.5 過表達(dá)PAK2能部分逆轉(zhuǎn)miR-424對(duì)骨肉瘤U2-OS細(xì)胞的增殖和凋亡的影響 轉(zhuǎn)染24 h后，miR-con組與miR-424組細(xì)胞的吸光度值差異不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，miR-24組較miR-con組細(xì)胞的吸光度值顯著下降，細(xì)胞的凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；PAK2蛋白和促增殖蛋白Cyclin D1和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯下降，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染24 h后，miR-424+pcDNA組與miR-424+pcDNA-PAK2組的細(xì)胞吸光度值差異不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，miR-424+pcDNA-PAK2組較miR-424+pcDNA組細(xì)胞吸光度值顯著升高，細(xì)胞的凋亡率顯著下降；PAK2蛋白和促增殖蛋白Cyclin D1和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯升高，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表6和圖5。

圖5 骨肉瘤細(xì)胞中PAK2蛋白表達(dá)

表6 過表達(dá)PAK2逆轉(zhuǎn)miR-424表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖和凋亡的作用(±s，n=6)

表6 過表達(dá)PAK2逆轉(zhuǎn)miR-424表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖和凋亡的作用(±s，n=6)

注：與miR-con組比較，aP＜0.05；與miR-424+pcDNA組比較，bP＜0.05。

組別 細(xì)胞活力(OD490 nm)細(xì)胞凋亡率(%)PAK2Cyclin D1Bcl-2Bax miR-con組miR-424組miR-424+pcDNA組miR-424+pcDNA-PAK2組F值P值24 h 0.36±0.04 0.34±0.03 0.31±0.03 0.34±0.04 2.040 0.141 48 h 0.77±0.06 0.49±0.04a 0.44±0.05 0.61±0.06b 45.788＜0.05 72 h 0.88±0.07 0.57±0.06a 0.54±0.05 0.68±0.07b 35.761＜0.05 8.53±0.63 19.25±1.12a 22.38±1.88 15.33±1.05b 136.079＜0.05 0.83±0.07 0.57±0.06a 0.54±0.05 0.68±0.07b 26.013＜0.05 0.88±0.08 0.49±0.04a 0.45±0.04 0.61±0.05b 74.628＜0.05 0.85±0.07 0.62±0.06a 0.51±0.05 0.72±0.07b 31.648＜0.05 0.47±0.07 0.79±0.06a 0.81±0.05 0.63±0.07b 37.987＜0.05

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，致死率和致殘率較高[9-10]。目前對(duì)于骨肉瘤的治療多采用手術(shù)治療結(jié)合化療、放療的綜合療法，但是骨肉瘤手術(shù)治療致殘率高、假體功能差，放療和化療毒副作用大，并且晚期腫瘤對(duì)化療藥耐受，導(dǎo)致骨肉瘤患者的生存率低，治療效果不盡人意[11]。因此，尋找一種治療骨肉瘤效果好、可行性大且不良反應(yīng)小的臨床新方法已成為目前研究的熱點(diǎn)。

近年研究表明，miRNA是腫瘤發(fā)生發(fā)展中最基本的參與者，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miRNA主要通過與靶基因mRNA 3'非編碼區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)完全配對(duì)促使靶基因mRNA發(fā)生降解，或不完全配對(duì)抑制mRNA的翻譯但不影響其穩(wěn)定性，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、浸潤及轉(zhuǎn)移等[12]。miRNA可作為癌癥發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)，所以探尋與癌癥相關(guān)的miRNA及下游靶基因有利于癌癥的診斷與治療。劉萍等[13]發(fā)現(xiàn)miR-424與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后關(guān)系密切。嚴(yán)貝芬等[14]發(fā)現(xiàn)miR-424-5p通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)抑制人肺癌細(xì)胞的增殖，李宏敏等[15]發(fā)現(xiàn)miR-424能夠通過調(diào)控E2F6而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長和侵襲，孫雪梅等[16]發(fā)現(xiàn)miR-424a通過與ARK5 mRNA 3'UTR結(jié)合抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。據(jù)研究報(bào)道，miR-424在骨肉瘤細(xì)胞中抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-6]，本文通過RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與健康成骨細(xì)胞相比，骨肉瘤細(xì)胞中miR-424的表達(dá)下調(diào)，提示其可能在骨肉瘤中起抑癌基因的作用。過表達(dá)miR-424細(xì)胞活性顯著下降，凋亡率顯著升高，且促增殖蛋白Cyclin D1、抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯下降，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量明顯升高，結(jié)果與此前研究一致，但其具體分子機(jī)制尚不清楚。

據(jù)研究報(bào)道，p21激活激酶2(PAK2)在多種腫瘤中異常表達(dá)，可參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[17]。PAK2在乳腺癌、胃癌、頭頸鱗癌、黑色素瘤及膀胱癌等癌癥中充當(dāng)促癌基因的功能[18-20]，但其在骨肉瘤中的作用還未有報(bào)道。本研究通過RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PAK2在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，沉默PAK2抑制了骨肉瘤U2-OS細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且明顯降低細(xì)胞中促增殖蛋白Cyclin D1、抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量，并明顯升高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量，其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的影響與miR-424恰好相反。本實(shí)驗(yàn)利用生物信息預(yù)測(cè)miR-424與PAK2之間的關(guān)系，結(jié)果表明miR-424與PAK2之間存在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶基因報(bào)告試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-424與PAK2之間存在靶向調(diào)控關(guān)系，提示PAK2是miR-424的下游靶基因。同時(shí)，過表達(dá)miR-424明顯減少PAK2的表達(dá)量，而沉默miR-424明顯升高PAK2的表達(dá)量，證實(shí)miR-424可負(fù)向調(diào)控PAK2的表達(dá)。此外，研究發(fā)現(xiàn)PAK2可以逆轉(zhuǎn)miR-424對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，以及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。這些結(jié)果說明miR-424抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是通過靶向調(diào)控PAK2表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-424可通過抑制PAK2的表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。本文明確了miR-424和PAK2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響并初步探討了miR-424可通過調(diào)控PAK2的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機(jī)制，為臨床治療骨肉瘤提供了可靠的理論依據(jù)和新的治療思路。