李玉輝 趙喜慶 陳思 劉巖 劉艷坤 李玉鳳

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，約占所有顱內(nèi)腫瘤的45%，其中一半以上為惡性度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）。GBM常常呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差，中位生存期少于20個(gè)月[1,2]。原癌基因BRAF編碼的BRAF蛋白是Raf激酶家族的一員，是下游促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路中的最強(qiáng)激活劑。BRAF第600個(gè)氨基酸殘基因由纈氨酸變成谷氨酸而形成持續(xù)激活型BRAFV600E，導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路的持續(xù)性激活，引起腫瘤細(xì)胞增殖和代謝的改變[3]。BRAFV600E突變?cè)谏掀覩BM中的發(fā)生率高達(dá)50%以上[4,5]。

已有研究表明Na+/H+交換蛋白1（Na+/H+exchanger 1，NHE1）為惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)，NHE1抑制劑Cariporide的抗腫瘤作用也日益受到關(guān)注。Guan等[6]研究發(fā)現(xiàn)Cariporide可抑制小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在裸鼠顱內(nèi)成瘤的體積、侵襲，并可延長(zhǎng)荷瘤裸鼠生存期。但Cariporide對(duì)人BRAF野生型（BRAFWT）和BRAFV600E突變型細(xì)胞GBM細(xì)胞的抑制作用尚有待于闡明。本研究旨在分析NHE1抑制劑Cariporide對(duì)BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM細(xì)胞系增殖活性和侵襲能力的影響，以期為GBM的臨床治療提供新思路和基礎(chǔ)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞（BRAFWT）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，AM38細(xì)胞（BRAFV600E突變）購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。細(xì)胞培養(yǎng)基MEM和進(jìn)口胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，Matrigel基底膜購(gòu)自美國(guó)BD公司，Cariporide（HOE-642）購(gòu)自美國(guó)MCE公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

U251細(xì)胞和AM38細(xì)胞均采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)。使用84%MEM培養(yǎng)基（15%胎牛血清，1%青霉素鏈霉素雙抗）在37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞均呈單層貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)以1∶1～1∶3傳代培養(yǎng)。

三、BCECF-AM熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值

乙酰甲酯化的2',7'-雙（2-羧乙基）-5（6）-羧基熒光素（acetoxymethyl ester of 2',7'-Bis(2-carboxyethyl)-5（6）-carboxy fluorescein，BCECF-AM），可以穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜。BCECF-AM本身沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成BCECF。BCECF在適當(dāng)?shù)膒H值情況下可以被激發(fā)形成綠色熒光。分別用440 nm和490 nm波長(zhǎng)激發(fā)BCECF所得到的發(fā)射熒光強(qiáng)度比值（fluorescence intensity ratio，F(xiàn)IR）與pH值（6.20～7.80）呈線性關(guān)系。用HEPES制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為4×107個(gè)/mL，將1 mmol/L的BCECFAM/溶劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液加入細(xì)胞懸液中（細(xì)胞懸液的1/300體積），BCECF-AM終濃度為3μmol/L。在37℃培養(yǎng)30 min，用HEPES緩沖液清洗細(xì)胞3次，制成3×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，使用熒光顯微鏡或多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在440 nm和490 nm的熒光強(qiáng)度。計(jì)算440 nm與490 nm熒光強(qiáng)度比值FIR，反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)pH值以間接反映NHE1的活性。

四、MTT細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

在96孔板分別加入U(xiǎn)251和AM38細(xì)胞100μL（約1×104個(gè)細(xì)胞），每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁完全。之后Cariporide處理組的2種細(xì)胞分別加入0.16 nmol/L Cariporide，對(duì)照組分別加入等量DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。置于搖床上低速震蕩10 min使藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜充分溶解。多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處各孔的吸光度值（optical density，OD）。

五、基質(zhì)膠-Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

Matrigel基質(zhì)膠可模擬基底膜結(jié)構(gòu)，用OPTIMEM培養(yǎng)基3∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠后，將其均鋪于Transwell小室內(nèi)，每孔40μL，置于37℃孵箱中反應(yīng)1 h，待膠凝固備用。Cariporide處理24 h后的細(xì)胞，常規(guī)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5×104個(gè)U251細(xì)胞稀釋于0.2 mL的OPTI-MEM培養(yǎng)基后接種到Transwell小室的上室（鋪有Matrigel基質(zhì)膠）。Traswell小室的下室中加入0.6 mL含有20%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，放回37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。20 h后，終止培養(yǎng)，用棉簽拭去小室上層細(xì)胞，1×PBS緩沖液輕洗小室上層的細(xì)胞2遍。自然風(fēng)干后向下室加入0.6 mL固定液（冰醋酸、甲醇體積比1∶3），室溫靜置15 min。1×PBS緩沖液輕洗小室2遍。向下室加入0.6 mL 0.1%結(jié)晶紫，染色20 min，用1×PBS緩沖液輕洗。Transwell小室置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，取平均值作為該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)均取雙側(cè)α=0.05。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Cariporide對(duì)BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM細(xì)胞系內(nèi)NHE1活性的影響

采用BCECF-AM熒光探針分析U251細(xì)胞（BRAFWT）和AM38細(xì)胞（BRAFV600E）內(nèi)NHE1的活性，發(fā)現(xiàn)AM38細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)NHE1活性的FIR值顯著高于U251細(xì)胞（t=12.825，P=0.006）。采用0.16 nmol/L的NHE1抑制劑Cariporide和DMSO分別處理兩種細(xì)胞24 h后，Cariporide處理組U251和AM38細(xì)胞內(nèi)NHE1的活性分別顯著低于DMSO處理的U251和AM38細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U251：t=9.016，P=0.012；AM38：t=13.143，P=0.006）（圖1）。

圖1 BCECF-AM熒光探針分析Cariporide對(duì)U251細(xì)胞和AM38細(xì)胞內(nèi)NHE1活性的影響

二、Cariporide對(duì)BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響

采用MTT分析結(jié)果顯示AM38細(xì)胞的增殖能力顯著高于U251細(xì)胞（t=10.000，P=0.010）。采用0.16 nmol/L的NHE1抑制劑Cariporide和DMSO分別處理兩種細(xì)胞24 h后，Cariporide處理的U251和AM38細(xì)胞的生長(zhǎng)活性分別顯著低于DMSO處理的U251和AM38細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U251：t=6.410，P=0.023；AM38：t=39.460，P=0.001）（圖2）。

三、Cariporide對(duì)BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM細(xì)胞侵襲能力的影響

基質(zhì)膠-Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AM38細(xì)胞的侵襲能力顯著高于U251細(xì)胞（t=4.269，P=0.047）。采用0.16 nmol/L的Cariporide和DMSO分別處理2種細(xì)胞24 h后，Cariporide處理組U251和AM38細(xì)胞的侵襲能力分別顯著低于DMSO處理的U251和AM38細(xì)胞（U251：t=4.621，P=0.044；AM38：t=4.975，P=0.038）（圖3）。

圖2 MTT法分析Cariporide對(duì)U251細(xì)胞和AM38細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響

圖3 基質(zhì)膠-Transwell實(shí)驗(yàn)分析Cariporide對(duì)U251細(xì)胞和AM38細(xì)胞侵襲能力的影響

討 論

微環(huán)境是影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的重要因素。NHE1表達(dá)上調(diào)或激活導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)堿外酸的微環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[7-9]。已有研究表明，NHE1在乳腺癌、白血病和GBM等惡性腫瘤中高表達(dá)，在腎癌細(xì)胞、GBM細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞等多種惡性腫瘤細(xì)胞中被激活[10-16]。本文主要分析NHE1抑制劑Cariporide對(duì)BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM細(xì)胞系增殖活性和侵襲能力的影響。

本研究通過BCECF-AM熒光探針、MTT分析和基質(zhì)膠-Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AM38細(xì)胞的NHE1活性、增殖和侵襲能力均顯著高于U251細(xì)胞。本課題組的前期研究亦發(fā)現(xiàn)BRAF的表達(dá)水平正向調(diào)控GBM細(xì)胞中NHE1的活性[17]。這說明BRAF的表達(dá)和活性均可正向調(diào)控NHE1的活性，NHE1是BRAF的下游蛋白。此外，本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，采用siRNA敲低NHE1可抑制GBM細(xì)胞的侵襲能力，提示NHE1是GBM的治療靶點(diǎn)[18]。本研究結(jié)果顯示，采用NHE1抑制劑Cariporide處理的U251和AM38細(xì)胞內(nèi)NHE1的活性、細(xì)胞生長(zhǎng)活性、侵襲能力分別顯著低于DMSO處理的U251和AM38細(xì)胞。這提示Cariporide可抑制BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM細(xì)胞的NHE1的活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸外堿的微環(huán)境，從而抑制GBM細(xì)胞生長(zhǎng)活性、侵襲能力。已有文獻(xiàn)報(bào)道，Cariporide可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，可抑制膽管上皮癌細(xì)胞的增殖，可誘導(dǎo)膽管上皮癌細(xì)胞的凋亡，還可促進(jìn)惡性間皮瘤的DNA損傷和凋亡[16,19-22]。結(jié)合這些結(jié)果，提示NHE1抑制劑Cariporide可在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮治療作用，是治療GBM等惡性腫瘤的潛在藥物。

目前BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM的臨床治療方式主要為手術(shù)治療，術(shù)后輔助放射治療、化學(xué)治療，對(duì)于復(fù)發(fā)患者可聯(lián)合抗血管生成藥。對(duì)于BRAFV600E突變的GBM患者，臨床上有采用BRAFV600E突變抑制劑Vemurafenib治療有BRAFV600E突變的小兒GBM達(dá)到臨床完全緩解的病例報(bào)道[23,24]。但近期研究發(fā)現(xiàn)BRAFV600E抑制劑單藥治療對(duì)BRAFV600E突變的GBM細(xì)胞（AM38、DBTRG-05MG和NMC-G1）中MAPK信號(hào)通路的抑制不具有持久性，可能是由于產(chǎn)生耐藥或者啟動(dòng)了代償機(jī)制[25,26]。聯(lián)合用藥可在一定程度上解決耐藥和代償問題。Guan等[6,27]的研究發(fā)現(xiàn)Cariporide聯(lián)合化學(xué)治療藥物替莫唑胺或抗PD-1抗體可增加替莫唑胺對(duì)BRAFWTGBM細(xì)胞的毒性，提高免疫治療的腫瘤免疫原性，顯著延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤小鼠模型的中位生存期。此外，Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用BRAFV600E抑制劑和MEK抑制劑可防止MAPK通路的再激活，提高抗腫瘤療效，并降低由于BRAFV600E抑制劑導(dǎo)致的繼發(fā)性皮膚鱗狀細(xì)胞癌。Brown等[28]報(bào)道了2例使用BRAF抑制劑Dabrafenib聯(lián)合MEK抑制劑Trimetinib成功治療BRAFV600E突變型多形性黃原性星形膠質(zhì)瘤瘤患者的案例。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為NHE1抑制劑Cariporide聯(lián)合其他治療方案（如BRAFV600E抑制劑、替莫唑胺或PD-1抗體）可能是成人BRAFV600E突變型GBM患者臨床治療的新思路。

綜上所述，采用Cariporide阻斷NHE1活性可有效抑制BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究為BRAFWT和BRAFV600E突變型GBM患者的治療提供了新思路和基礎(chǔ)依據(jù)。