畢曉陽，張肖肖，劉雅倩，黃繼光

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642）

檸檬烯是一種常見的單環(huán)單萜類植物精油，具有d型、l型和dl型3 種構(gòu)型[1]，無色油狀液體，易溶于丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑，有特殊的檸檬芳香味[2-4]。d-檸檬烯是自然界常見的一種構(gòu)型，又稱d-苧烯，具有多種活性，可從柑橘類或檸檬類的果皮或果肉中提取。研究表明d-檸檬烯具有抗蟲、抑菌、消炎、減痛、預(yù)防和治療癌癥的作用[5-8]，也可作為增香劑、抗氧化劑等添加到食品中，還可作為綠色提取劑及空氣清潔劑等[9-10]。

隨著農(nóng)藥往高效、低毒方向發(fā)展，以及植物精油具有多種活性的特點(diǎn)，從植物中提取的d-檸檬烯被廣泛地用于害蟲防治，如螨蟲、粉虱、蚧殼蟲等，奧羅阿格瑞國際有限公司現(xiàn)已登記d-檸檬烯原藥和5%可溶液劑。柑橘類水果中普遍存在的d-檸檬烯通過什么方式對(duì)危害柑橘的紅蜘蛛表現(xiàn)出生物活性，未見相關(guān)報(bào)道。為弄清這個(gè)問題，本文重點(diǎn)測定了d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨的作用方式和生物活性，旨在為檸檬烯類精油的使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)

柑橘全爪螨（Panonychus citriMcGregor）采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地柑橘園，將成螨采集回來接種到干凈未接觸任何藥劑的柑橘苗上飼養(yǎng)擴(kuò)繁。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（28±1）℃，相對(duì)濕度（65±5）%，光周期16∶8。

1.2 供試試劑

d-檸檬烯：含量95%，購于悌希愛（上海）化工發(fā)展有限公司。魚藤酮：含量98%，購于Sigma。丙酮等常用有機(jī)溶劑均為分析純，市售。

1.3 藥劑配制

d-檸檬烯用少量丙酮溶解，再用0.1%吐溫-80 水溶液逐級(jí)稀釋至所需濃度?？刂谱罱K溶液中丙酮含量不超過2%。

1.4 測定方法

1.4.1 成螨采用FAO 推薦的玻片浸漬法進(jìn)行：將雙面膠粘貼在載玻片上，用零號(hào)毛筆挑取大小一致、健康活潑的柑橘全爪螨雌成螨，將其背部粘在雙面膠上，然后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察2 h，剔除死亡和不活潑的螨蟲。再將帶有螨蟲的載玻片在藥液中浸漬5 s，用濾紙吸干蟲體周圍藥液，晾干后置于培養(yǎng)箱中，24 h 觀察，記錄死亡情況。

每處理20 頭雌成螨，3 次重復(fù)，對(duì)照用相同含量的有機(jī)溶劑和乳化劑處理。

1.4.2 若螨采用噴霧法進(jìn)行：準(zhǔn)備干凈平整的豇豆葉片，剪成3 cm×5 cm 大小，葉背朝上，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，接入大小一致的柑橘全爪螨若螨。用手持小型噴霧器將藥液均勻噴至葉片和螨蟲表面，至葉片表面剛好布滿霧滴為止。處理后自然晾干，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)觀察，24 h 調(diào)查死亡情況。每處理20 頭，3 次重復(fù)，對(duì)照用相同含量的有機(jī)溶劑和乳化劑處理。

1.4.3 殺卵采用浸漬法進(jìn)行：準(zhǔn)備新鮮干凈3 cm×5 cm 大小豇豆葉片，鋪于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接入產(chǎn)卵盛期的柑橘全爪螨成螨30 頭，置于培養(yǎng)箱中產(chǎn)卵24 h 后，剔除雌成螨，然后將帶有卵的葉片小心地在不同濃度的d-檸檬烯溶液中浸漬5 s，取出放回原處晾干。在雙目解剖鏡下記錄各處理卵的數(shù)量后，轉(zhuǎn)移至正常環(huán)境中培養(yǎng)，48 h 后觀察卵孵化情況，未孵化的卵粒視為死亡，計(jì)算殺卵效果。每處理重復(fù)3 次，用相同含量的有機(jī)溶劑和乳化劑處理當(dāng)做空白對(duì)照。

1.4.4 產(chǎn)卵抑制采用噴霧法進(jìn)行：將處于產(chǎn)卵期的雌成螨接入到新鮮、干凈的豇豆葉片背面，立即用噴霧器將不同濃度藥液噴至葉片表面，至葉片表面均勻布滿霧滴為止。然后將處理的雌成螨置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察。72 h 調(diào)查卵的數(shù)量。每處理20 頭，3 次重復(fù)。對(duì)照用相同含量的有機(jī)溶劑和乳化劑處理。

1.5 盆栽

采用噴霧法進(jìn)行。用直徑12 cm 和高度16 cm 的塑料缽種植豇豆，待植株長至4～6 葉后，選取長勢基本一致的豇豆進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。每個(gè)盆栽保留1 顆生長良好的植株，選取3 片葉，接入柑橘雌成螨50 頭，莖桿基部涂抹凡士林和爽身粉以防螨蟲逃逸。4 h 后檢查蟲口基數(shù)，不足50 頭的補(bǔ)足到50 頭，然后進(jìn)行噴霧處理。以噴至葉片正反面均勻布滿霧滴、剛好滴水時(shí)為止。

藥后1，3，5 d 調(diào)查盆栽植株上的活蟲數(shù)，藥后3、5 d 同時(shí)還調(diào)查所有葉片上的卵粒，以此計(jì)算防治效果和產(chǎn)卵抑制效果。

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析

成螨、若螨、卵的活性測定采用死亡率和校正死亡率的公式進(jìn)行計(jì)算：

產(chǎn)卵抑制作用采用如下產(chǎn)卵抑制率的公式進(jìn)行計(jì)算：

盆栽防效采用蟲口減退率和防效公式進(jìn)行：

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，多重比較采用Turkey。毒力分析采用幾率值進(jìn)行線性回歸，計(jì)算出致死中濃度及95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

采用玻片浸漬法、噴霧法測定后，d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨雌成螨、若螨和卵的毒力活性，以及對(duì)雌成螨的產(chǎn)卵抑制活性見表1。

表1 d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨不同蟲態(tài)的生物活性

從表1可以看出，d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨的成螨、若螨和卵雖表現(xiàn)出一定的毒力活性，LC50值分別為541.07 mg/L、630.45 mg/L 和231.73 mg/L，但均在200 mg/L 以上，說明d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨的觸殺作用并不顯著。同時(shí)，筆者在試驗(yàn)過程中也采用浸葉法進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)在供試濃度下螨蟲死亡率很低導(dǎo)致無法計(jì)算出LC50值（超過2 000 mg/L），表明d-檸檬烯對(duì)螨蟲無明顯的毒殺作用。

但是，噴霧法處理后，d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨雌成螨的產(chǎn)卵表現(xiàn)出較明顯的抑制活性，72 h 的產(chǎn)卵抑制作用中濃度為54.19 mg/L。相比于其他幾種作用方式，d-檸檬烯的產(chǎn)卵抑制活性更為明顯。

為弄清d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨的綜合防控作用，在室內(nèi)活性測定基礎(chǔ)上，以植物源成分魚藤酮原藥（96%）作為對(duì)照藥劑，進(jìn)一步通過盆栽試驗(yàn)研究了d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨雌成螨的控制效果和產(chǎn)卵抑制作用。結(jié)果見表2。

表2 d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨盆栽防效和產(chǎn)卵抑制作用

表2結(jié)果表明，d-檸檬烯噴霧處理后，對(duì)柑橘全爪螨雌成螨的1、3、5 d 防效分別為10.06%、15.04%和18.97%，均不超過20%，與魚藤酮的防效之間存在顯著差異，說明該化合物對(duì)成螨的防治效果較差，不會(huì)引起成螨快速死亡。而通過調(diào)查產(chǎn)卵數(shù)量發(fā)現(xiàn)，d-檸檬烯在盆栽試驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的產(chǎn)卵抑制作用，藥后5 d 的產(chǎn)卵抑制率高達(dá)83.31%，明顯優(yōu)于對(duì)照藥劑魚藤酮，說明該藥劑可明顯地減少雌成螨在植株上的產(chǎn)卵量。

3 結(jié)論與討論

對(duì)柑橘全爪螨不同蟲態(tài)的毒力測定結(jié)果表明，噴霧或浸漬處理后，d-檸檬烯對(duì)螨蟲的致死作用不明顯，在實(shí)驗(yàn)中，課題組還測定了浸葉法的毒力，發(fā)現(xiàn)活性更低以致無法計(jì)算出LC50值，說明觸殺和胃毒均不是這種精油成分的主要作用方式，與普遍認(rèn)為的精油類成分能破壞昆蟲體壁蠟質(zhì)層或在昆蟲體表形成油膜引起昆蟲死亡的作用方式不同。

胡軍華等[11]研究發(fā)現(xiàn)柑橘提取物對(duì)柑桔全爪螨具有較好的生物活性，并在GC-MS 確定組分的基礎(chǔ)上測定了檸檬烯等4 種主要組分的毒力，結(jié)果表明檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨雌成螨、若螨和卵的LC50值分別為59.2、230.1 和65.8 mg/L，與本文結(jié)果不一致，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與檸檬烯的構(gòu)型和純度不同有關(guān)。文獻(xiàn)中采用的是dl構(gòu)型（CAS 號(hào)為138-86-3），含量未述及，本研究采用的是d構(gòu)型（CAS 號(hào)為5989-27-5），含量95%。

另外，Abdelgaleil 等[12]通過殘毒法測定表明檸檬烯對(duì)赤擬谷盜24 h 觸殺活性LC50值為494.18 μg/cm2、熏蒸活性LC50值為33.37 mg/L，袁海濱等[13]測定水蒿精油對(duì)綠豆象6 h 觸殺活性LC50值為1.562 4 mg/L，活性大小差異很大，說明檸檬烯對(duì)不同試蟲表現(xiàn)的作用方式不同，不同精油的主要作用方式也存在差異。

植物精油一般具有觸殺、熏蒸、抑制產(chǎn)卵、驅(qū)避、拒食和引誘等多種活性[14-16]。本研究表明d-檸檬烯能抑制雌成螨產(chǎn)卵以及具有一定的殺卵作用，進(jìn)而控制螨蟲種群增長。但d-檸檬烯對(duì)柑橘全爪螨是否還有拒食等其他作用方式，以及是否能夠減少成螨產(chǎn)卵的生物學(xué)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

Oboh 等[17]發(fā)現(xiàn)桔皮主要成分d-檸檬烯對(duì)Na+/K+三磷酸酸腺苷的活性有抑制作用，Abdelgaleil 等[12]發(fā)現(xiàn)檸檬烯可抑制米象和赤擬谷盜的乙酰膽堿酯酶，也有報(bào)道指出植物精油可以破壞昆蟲體壁蠟質(zhì)層，破壞細(xì)胞和神經(jīng)[18]或通過物理方式形成油膜的覆蓋，引起昆蟲窒息死亡[19]。d-檸檬烯是否也具有類似的作用機(jī)制，值得進(jìn)一步探索。

總之，d-檸檬烯來源于植物，廣譜、低毒，易降解，能很好地滿足現(xiàn)代農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)的用藥需要，必將有廣闊的發(fā)展前景。