劉麗莉 楊陳柳 尤曉顏 * 李 玉 梁嚴予

（1 河南科技大學食品與生物工程學院 河南洛陽 471023

2 食品加工與安全國家級教學示范中心 河南洛陽 471023）

我國作為畜產(chǎn)品生產(chǎn)大國，畜禽的生產(chǎn)總量居世界前列，具有豐富的牛骨資源，然而絕大多數(shù)牛骨資源尚未得到有效開發(fā)利用，造成資源嚴重浪費，環(huán)境過度污染[1-2]。生物酶工程技術的發(fā)展和進步對牛骨進行深加工具有深遠影響，利用此技術開發(fā)功能性骨蛋白肽，將使牛骨資源浪費問題得到解決，并有助于經(jīng)濟和社會效益的提高，為動物性骨骼資源加工附加值的提高提供新方式。膠原蛋白酶解成骨膠原多肽后雖然相比于氨基酸或膠原蛋白更易被人體吸收，且具有抗氧化，抗衰老，有利于礦物質(zhì)吸收的功效[3-5]，但在一定溫度和pH環(huán)境下只有為數(shù)有限的蛋白酶能使牛骨膠原蛋白降解。目前降解骨膠原的酶，有底物專一性強，水解效果不明顯等缺陷，不能滿足大批量工業(yè)化生產(chǎn)。

近年來，隨著分子生物學與生物信息學的蓬勃發(fā)展，假單胞菌W7[6]、芽孢桿菌MO-1[7]、白念珠菌URM 3622[8]、有溶組織梭菌[9]等牛骨膠原蛋白酶的酶產(chǎn)生菌已有前人報道，然而作為致病菌，在產(chǎn)生膠原蛋白酶的同時也伴有相應毒素的產(chǎn)生，不利于生產(chǎn)應用，導致市面上只有少量膠原蛋白酶菌株在售[10-11]。開發(fā)出安全有效的骨膠原蛋白酶資源，提高酶的降解效率成為解決牛骨膠原蛋白浪費問題的關鍵。采用基因定向改造、染色體重組、構建工程菌株等生物酶工程技術手段將有望解決上述問題，提高產(chǎn)酶效率，如：Teramura等[12]從霍氏格里蒙菌1706B克隆出膠原酶基因，確定其完整的核苷酸序列，并對重組酶酶活進行研究，發(fā)現(xiàn)純化重組酶具有5 314U/mg的比活性，是溶組織梭菌中膠原酶的4倍左右。Kato等[13]從牙齦卟啉單胞菌ATCC 53977中分離出一種表達膠原酶活性基因（prtC），通過該基因的序列推斷出氨基酸序列，預測其對應的堿性蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為37.8 ku，并由SDS電泳進行檢測。Lee等[14]獲取解淀粉芽孢桿菌中的γ-谷氨酰轉肽酶基因，使其在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中成功表達，并研究了所產(chǎn)酶的相關特性。Tsuruoka等[15]研究了來自嗜酸熱異養(yǎng)菌的絲氨酸膠原蛋白酶，并使其在大腸桿菌中成功表達。

本研究將菌株蠟樣芽孢桿菌MBL13-U作為目標菌，根據(jù)蠟樣芽孢桿菌MBL13-U的全基因組測序獲得膠原蛋白酶（ColM13）基因序列設計特異性引物，以蠟樣芽孢桿菌MBL13-U基因組DNA為模板進行PCR擴增，對PCR獲得的序列送檢測序。測序驗證正確后，克隆至質(zhì)粒pET-30a，然后轉化至典型的表達型菌株大腸桿菌[E.coli，BL21（DE3）]，獲得高效降解牛骨膠原蛋白的工程菌pET30a-ColM13/BL21（DE3）。對重組蛋白酶ColM13的誘導表達的最適條件和酶解膠原蛋白的效果進行初步探索，為科學合理地開發(fā)牛骨骼資源提供理論依據(jù)，同時為有效開發(fā)利用牛骨膠原蛋白資源提供突破口。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑 低分子量蛋白質(zhì)Marker，TaKaRa公司；Kana、IPTG，北京索萊寶公司；基因組提取試劑盒，德國Analytik Jena公司；DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，北京GENVIEW公司；牛跟腱Ⅰ型膠原蛋白，源葉生物有限公司；牛血清白蛋白，眾一生物公司。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒及工具酶與主要試劑 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）MBL13-U、宿主菌為大腸桿菌（Escherichia coli，BL21（DE3））、表達載體pET-30a均為課題組所保藏菌株。ExTaq DNA聚合酶、內(nèi)切酶（BamHⅠ和XhoⅠ）、T4 DNA連接酶，TaKaRa公司。

1.1.3 PCR引物 根據(jù)產(chǎn)酶基因和表達載體的特征，設計出擴增目的基因引物，如表1所示。

表1 擴增ColM13基因的引物序列Table1 Primer sequence for amplifying the ColM13 gene

1.1.4 主要培養(yǎng)基 B.cereus MBL13-U種子培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基配制方法參照劉麗莉等[16]的方法，制備后冷卻備用。

LB培養(yǎng)基（含卡那霉素）及配制方法：根據(jù)LB培養(yǎng)基的配方制備，結束后冷卻，另外向其中加入50mg/mL卡那霉素100μL。

明膠平板及配制方法：向100mL的去離子水中加入明膠1.5 g，瓊脂1.6 g，于121℃滅菌鍋中滅菌20min，冷卻待用。

固體培養(yǎng)基：加1.5%瓊脂于上述的培養(yǎng)基中，即成相應固體培養(yǎng)基。

1.1.5 儀器與設備 超聲波細胞破碎儀，寧波新芝科技有限公司；電泳儀，美國BIO-RAD公司；UV2600紫外分光光度儀，日本日立公司；PCR儀，美國Applied Biosystems公司；TM3030Plus電子掃描顯微鏡，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的DNA提取、全基因組測序及ColM13基因克隆 挑取B.cereus MBL13-U單菌落，接種到5mL B.cereus MBL13-U種子培養(yǎng)基中，180 r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，按照試劑盒提取說明書提取B.cereus MBL13-U全基因組，抽取部分基因組送至上海源序生物有限公司進行全基因組測序。使用特異性引物對提取的目的DNA為模板進行擴增。

PCR 擴增條件：預變性（94℃、4min）→變性（95℃、1min）→退火（51℃、1min）→延伸（72℃、1.5min）→終止延伸（72℃、10min），35 個循環(huán)。反應結束后在4℃條件下保存，抽取PCR產(chǎn)物并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 大腸桿菌BL21感受態(tài)的制備 參照代軍[17]、張跡等[18]的研究方法制備感受態(tài)細胞。將80 mmol/L MgCl2-20mmol/L CaCl2溶液滅菌冷卻后，使其對菌體進行重懸，離心后去除上清，溶于0.1 mol/L CaCl2溶液（含30%甘油），振蕩使細胞再次重懸，再將菌液以200μL/管進行分裝，以上操作均在冰塊上進行，并于-70℃保存。

1.2.3 重組表達載體pET30a-ColM13及工程菌的構建表達載體pET30a-ColM13的重組及工程菌pET30a-ColM13/BL21的構建參照劉麗莉等[16]的方法。無菌環(huán)境下抽取菌液涂于含Kana的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)12 h。將單克隆菌落挑出并接入固體平板，振蕩培養(yǎng)過夜。用試劑盒提取工程菌中的重組質(zhì)粒并進行酶切鑒定及測序。

1.2.4 重組酶的誘導表達 按1%接種量將工程菌及空載體對照菌接種至含Kana的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜（37℃、180 r/min）；向含卡那霉素的培養(yǎng)液（5mL）中加入1%培養(yǎng)物，再恒溫培養(yǎng)至細菌的OD600達到0.3～1.0。向含工程菌的培養(yǎng)液中加入1‰、100mmol/L的IPTG誘導4 h。將培養(yǎng)物離心除去上清液并用PBS溶液吹打洗滌，經(jīng)超聲波破碎后離心，上清即為ColM13。取上清20μL與等量的上樣緩沖液混合，沸水處理10min，最后進行SDS-PAGE電泳檢測[19-20]。

1.2.5 誘導條件對ColM13酶活力的影響

1.2.5.1 不同IPTG濃度對ColM13酶活力的影響 按1.2.4節(jié)的方法進行預培養(yǎng)，直到細菌進入對數(shù)生長期。向培養(yǎng)液中分別加入1‰，2‰，4‰，6‰，8‰，10‰，100mmol/L的IPTG 誘導 4 h 并表達，取出2mL的培養(yǎng)物離心10min，收集沉淀。按照1.2.4節(jié)的菌體破粹方法進行超聲破碎處理。然后采用茚三酮顯色法對不同處理的ColM13酶活進行測定[21]。

1.2.5.2 不同誘導時間對ColM13酶活力的影響按1.2.4節(jié)的方法進行預培養(yǎng)，直到細菌進入對數(shù)生長期。向培養(yǎng)液添加最適濃度的IPTG（100 mmol/L），分別放入30℃、37℃恒溫搖床以180 r/min 進行誘導，時間梯度為2，4，6，8，10 h。按相同的方法進行菌體處理，最后對經(jīng)過不同處理的ColM13酶活進行測定。

1.2.6 ColM13的透明圈試驗 用明膠平板對誘導表達的ColM13進行透明圈試驗，將接過不同酶處理液的明膠平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h左右觀察。試驗中以轉化pET-30a的BL21（DE3）為對照，分別測定了經(jīng)IPTG誘導的pET30a/BL21，經(jīng)IPTG誘導的pET30a-ColM13/BL21和未經(jīng)IPTG誘導的pET30a-ColM13/BL21的ColM13酶活性。

1.2.7 ColM13作用于膠原蛋白的UV掃描光譜分析 將經(jīng)ColM13處理的膠原蛋白與未處理的膠原蛋白分別進行紫外全波長掃描，設定200～400 nm的波長范圍。

1.2.8 ColM13作用于膠原蛋白的掃描電鏡SEM分析 分別將膠原蛋白及酶解后的膠原蛋白真空冷凍干燥后噴金處理，使用掃描電鏡觀察表面形態(tài)變化。

2 結果與分析

2.1 B.cereus MBL13-U全基因組測序及ColM13基因克隆

對B.cereus MBL13-U全基因組進行測序，ColM13的測序結果表明其序列長度為2 916 bp。以菌株B.cereus MBL13-U基因組DNA為模板，利用設計合成的1對特異性引物PCR擴增ColM13基因，抽取5μL PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果見圖1。

由圖1可知，目的條帶在2號泳道中出現(xiàn)，大小約2 916 bp與預期的DNA片段大小相符。PCR擴增產(chǎn)物的回收采用DNA快速純化回收試劑盒（來自GENVIEW公司），抽取少許樣品送檢測序，證明PCR結果正確。

2.2 工程菌的構建及鑒定

對轉化后獲得的工程菌pET30a-ColM13/BL21提取重組質(zhì)粒，質(zhì)粒提取方法參照GENVIEW公司質(zhì)粒提取試劑盒的說明書。采用相同方法對重組的質(zhì)粒進行檢測，結果見圖2。

由圖2可知，在5號泳道中出現(xiàn)了3個條帶，其中間條帶出現(xiàn)的位置與2號泳道中目的片段（ColM13基因）條帶位置相接近，片段大小約為2 916 bp，酶切產(chǎn)物片段大小與克隆基因大小相符，表明工程菌pET30a-ColM13/BL21構建成功?；厥针p酶切片段進行測序，測序結果表明載體構建成功。

2.3 ColM13的誘導表達

誘導表達優(yōu)化后，將工程菌和空質(zhì)粒菌在37℃下，與 6‰IPTG混合，誘導6 h。ColM13表達情況如圖3所示。

由圖3可知，在2號泳道中重組菌pET30a-ColM13/BL21在IPTG誘導下出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶，目的蛋白表達明顯，表達的蛋白分子質(zhì)量約46 ku；而在3、4號泳道中并未有明顯的目的蛋白條帶，這表明所構建的工程菌成功表達出ColM13。

圖1 擴增產(chǎn)物檢測Fig.1 Amplification product detection

圖2 重組子酶切驗證Fig.2 The recombinant enzyme verification

2.4 不同IPTG濃度對ColM13酶活力的影響

在37℃的培養(yǎng)條件下，向5mL試管內(nèi)分別加入 1‰，2‰，4‰，6‰，8‰，10‰的IPTG（100 mmol/L）進行誘導表達，誘導時間為4 h。將上述培養(yǎng)液進行離心處理并收集菌體，在菌體中加入PBS緩沖液超聲破粹后離心收集上清液。對不同IPTG濃度下，所得的ColM13進行酶活力測定，結果如圖4所示。

由圖4可知，在誘導時間一定的條件下，加入1‰IPTG進行誘導，ColM13酶活力為15.31 U/mL；增加IPTG的添加量，ColM13酶活力隨而升高；當IPTG添加量為6‰時，ColM13酶活達到最高，活力達25.47U/mL；繼續(xù)增加IPTG的添加量，ColM13酶活呈下降趨勢，可能是過高濃度的IPTG殺死了細菌細胞。因此，本試驗確定的誘導目的蛋白進行表達的IPTG最適添加量為6‰。

圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 The SDS-PAGE analysis of the expressed product

圖4 IPTG添加量對酶活力的影響Fig.4 Effects of IPTG addition on enzyme activity

2.5 不同誘導時間對ColM13酶活力的影響

在30℃和37℃培養(yǎng)條件下，在5mL試管內(nèi)向培養(yǎng)物中加入6‰IPTG（100mmol/L）進行小劑量誘導表達，時間梯度為2，4，6，8，10 h。采用超聲對收集的菌體破碎處理，保留上清液。采用相同的方法測定上清液中的ColM13酶活，在30℃和37℃條件下表達的ColM13酶活力結果如圖5a、圖5b所示。

圖5 誘導時間對酶活力的影響Fig.5 Effects of induction time on enzyme activity

通過圖5a、圖5b對比可知，在IPTG濃度一定的情況下，隨著誘導時間的延長，ColM13酶活力隨之升高；37℃條件下的酶活普遍高于30℃。誘導 6 h，37℃誘導表達的ColM13酶活力達到64.99U/mL，明顯高于30℃時ColM13酶活力。繼續(xù)延長誘導時間，ColM13酶活力無明顯變化。由此可知，37℃條件下ColM13酶活力較好，最優(yōu)誘導時間為6 h。

2.6 ColM13的透明圈試驗結果

將重組質(zhì)粒pET30a-ColM13轉化大腸桿菌BL21（DE3）菌株進行水解圈試驗，以轉化pET30a質(zhì)粒的BL21（DE3）為對照，分別測定了經(jīng) IPTG誘導的pET30a/BL21，經(jīng)IPTG誘導的pET30a-ColM13/BL21和未經(jīng)IPTG誘導的pET30a-ColM13/BL21的ColM13酶活性。試驗結果如圖6所示。

由圖6可知，對轉入大腸桿菌BL21（DE3）的重組質(zhì)粒pET30a-ColM13和質(zhì)粒pET30a進行不同的處理，對培養(yǎng)的菌液進行離心并收集菌體，采用超聲波破碎菌體取上清液。在經(jīng)IPTG誘導的pET30a-ColM13/BL21的大腸桿菌BL21（DE3）上清液中檢測到ColM13酶活性，說明ColM13基因在大腸桿菌BL21（DE3）中得到了表達。

圖6 轉化子破菌上清液在明膠平板上形成的水解圈Fig.6 Hydrolytic circle formed on gelatin plate by the supernatant of transformant destroying bacteria

2.7 ColM13作用于膠原蛋白的UV光譜分析

由于膠原蛋白含有多種生色官能團，蛋白溶液中紫外生色官能團的綜合作用，形成了紫外吸收光譜[22]。因此，對酶解前、后的牛跟踺Ⅰ型膠原蛋白進行紫外全波長掃描，結果如圖7所示。

由圖7可知，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的特征峰均在220～230 nm波長范圍內(nèi)，說明經(jīng)ColM13酶解后的膠原蛋白能較好地保持I型膠原蛋白的特征。這與前人報道的哺乳動物的I型膠原蛋白的吸收峰同樣在218 nm[23]。與添加空質(zhì)粒pET30a的溶液相比，ColM13酶處理后的溶液在220 nm波長處的吸光度升高，這可能與膠原蛋白被酶解成多肽，導致溶液中的-COOH、-CONH2等生色基團增加有關，從而表明ColM13在工程菌中已成功表達。

圖7 樣品酶解前、后的紫外光譜Fig.7 UV spectrum before and after sample digestion

2.8 ColM13作用于膠原蛋白的掃描電鏡分析

將表達的ColM13作用于膠原蛋白，對酶解前、后的膠原蛋白進行掃描電鏡分析，結果如圖8所示。

圖8 樣品酶解前、后掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscope images of samples before and after enzymolysis

由圖8可知，ColM13酶的作用使膠原蛋白的表觀結構發(fā)生了明顯改變。在酶解處理前膠原蛋白的表面呈凹凸不平、比較完整的顆粒狀態(tài)，酶解處理后變?yōu)楸砻婀饣⒕鶆蚣毮伒膶訝罨蚱瑺?。由于骨膠原蛋白在ColM13的酶解作用下，使其原本的大分子結構被打破，從而導致表面結構改變，表明ColM13在工程菌中已成功表達。

3 結論

本研究以B.cereus MBL13-U為目標菌株，根據(jù)B.cereus MBL13-U的全基因組測序獲得ColM13基因序列，以其基因組序列為模板進行PCR擴增，使質(zhì)粒pET-30a獲得目的DNA克隆表達，成功建構出表達型大腸桿菌菌株（E.coli，BL21（DE3））。經(jīng)過對 ColM13酶活力的測定，研究誘導時間和誘導濃度對其的影響，最終確定在37℃條件下，以6‰IPTG（100mmol/L）誘導6 h，ColM13酶活力最高達64.99 U/mL。與加入1‰IPTG（100mmol/L），37℃培養(yǎng) 4 h時 ColM13的表達量15.31U/mL相比，較優(yōu)化前提高了4.24倍。通過水解圈試驗、全波長紫外掃描光譜和掃描電鏡，對異源表達產(chǎn)物ColM13酶活進行了驗證試驗。本研究對膠原蛋白酶活性的相關研究，及其在生產(chǎn)領域的應用具有重要意義。