肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，劉 軍，周 全，姜明姣

(1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000； 2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；3.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004； 4.湖南中威制藥有限公司，湖南 株洲 412000)

亞鐵(Fe2+)是含鐵蛋白(酶)的關(guān)鍵組分，在生物體氧運(yùn)輸、生物大分子合成、生物氧化、髓磷脂生成、神經(jīng)元樹(shù)狀結(jié)構(gòu)發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化以及基因表達(dá)等生理過(guò)程有重要作用[1-2]。Fe2+含量不足時(shí)易引發(fā)缺鐵性貧血(IDA)，以及帕金森病、阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病，缺鐵嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素和含鐵酶活性降低，供氧不足，電子傳遞和能量代謝過(guò)程紊亂，機(jī)體免疫功能下降和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等代謝疾病，但可通過(guò)食物或藥物進(jìn)行補(bǔ)充。食物中大部分以高鐵(Fe3+)形式存在，吸收效率低，只有以亞鐵形式存在時(shí)，生物利用率才高且結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，易被人體胃腸道消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)；藥物補(bǔ)充主要以無(wú)機(jī)鐵鹽或簡(jiǎn)單有機(jī)酸鐵鹽形式進(jìn)行，存在穩(wěn)定性差、胃腸刺激大、易受腸內(nèi)容物干擾、生物利用率低和存在一定毒副作用等缺陷，補(bǔ)充效果不理想[3]。生物多肽與亞鐵經(jīng)配位螯合后可明顯改善亞鐵吸收利用率和穩(wěn)定性，并能減少金屬元素間拮抗[4]。多肽結(jié)構(gòu)中的氫鍵、表面配位鍵及動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵等可與亞鐵螯合，并能以完整多肽被腸上皮細(xì)胞吸收，經(jīng)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟代謝利用，是制備亞鐵營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的重要新策略，具有吸收率高、毒副作用少和安全邊際高等優(yōu)點(diǎn)[5]。

花生肽亞鐵作為亞鐵營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑常采用口服給藥方式，其在人體胃腸道的消化行為及降解規(guī)律是亟待研究的問(wèn)題。食物的人胃腸仿生消化行為可采取胃腸仿生系統(tǒng)進(jìn)行體外模擬，利用消化酶模擬人體內(nèi)的消化進(jìn)程，可快速、簡(jiǎn)單、直觀地對(duì)消化過(guò)程進(jìn)行研究，具有消化用時(shí)短、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)[6]。目前，體外模擬消化以?xún)刹轿改c消化較常見(jiàn)[7-9]，雙酶三階段法研究較為鮮見(jiàn)。張凱等[10]利用體外胃腸模擬消化系統(tǒng)考察了產(chǎn)物在胃腸道環(huán)境中螯合率的變化情況；杜芬等[7]用胃腸仿生消化手段研究并評(píng)價(jià)了鱈魚(yú)皮膠原蛋白源金屬螯合肽(多肽M)的胃腸消化耐受性，認(rèn)為多肽M體外模擬胃腸消化耐受性高；Sangsawad等[11]研究了雞胸肽的體外胃腸模擬消化，研究認(rèn)為1.0 kDa多肽具有更好的生物活性，更容易穿透結(jié)直腸單層腺癌細(xì)胞。為了客觀地評(píng)價(jià)花生肽亞鐵的胃腸仿生消化過(guò)程和闡明花生肽亞鐵的胃腸消化耐受性，本研究將腸道仿生消化細(xì)分為十二指腸消化和小腸消化，采用雙酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)三階段(模擬人胃-十二指腸-小腸消化)法研究花生肽亞鐵在人胃腸仿生條件下的消化行為，明晰花生肽亞鐵的胃腸仿生消化行為及消化降解規(guī)律，為花生肽亞鐵營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的口服制劑提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生肽，自制；胃蛋白酶(5 500 U/g)、胰蛋白酶(3 500 U/g)，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DK-98-11A型電熱恒溫水浴箱；UV-2500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津；TAS990原子吸收光譜；IRPrestige-21島津傅里葉變換紅外光譜儀；HERMLE Z323K冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hermle公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生肽亞鐵的制備

以不同相對(duì)分子質(zhì)量(<1.0 kDa、1.0～3.0 kDa和>3.0 kDa)的花生肽為載體，以氯化亞鐵為金屬螯合配體，在多肽與亞鐵質(zhì)量比4.31∶1、溫度25.4℃和pH 7.5條件下螯合28.5 min后，用無(wú)水乙醇沉淀，靜置2 h并于8 000 r/min離心20 min，得到花生肽亞鐵配位螯合物(沉淀部分)，簡(jiǎn)稱(chēng)為花生肽亞鐵(PPC)[5，12]。以相對(duì)分子質(zhì)量小于1.0 kDa、1.0～3.0 kDa、大于3.0 kDa的花生肽為載體制備的花生肽亞鐵分別命名為L(zhǎng)-PPC、M-PPC和H-PPC。

1.2.2 花生肽亞鐵的pH穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱(chēng)取花生肽亞鐵配制10.0 mg/L的花生肽亞鐵溶液，用0.5 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至1.0～13.0，于37℃保溫1 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定鐵含量，計(jì)算花生肽亞鐵螯合率。

1.2.3 花生肽亞鐵的熱穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱(chēng)取花生肽亞鐵配制10.0 mg/L的花生肽亞鐵溶液(pH自然)，于10～100℃下保溫1 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定鐵含量，計(jì)算花生肽亞鐵螯合率。

1.2.4 模擬胃腸仿生消化液的配制

1.2.4.1 胃仿生消化液

參考《中國(guó)藥典》(2010版)第二部附錄XA方法配制[13]。移取23.4 mL濃HCl，加水100 mL配制成稀HCl溶液，取稀HCl溶液1.64 mL加入80.0 mL去離子水，加入胃蛋白酶1.0 g混勻，加水稀釋至100.0 mL即為模擬胃仿生消化液，pH為2.0左右。

1.2.4.2 腸仿生消化液

參考《中國(guó)藥典》(2010版)第二部附錄XVD方法配制[13]。稱(chēng)取0.68 g KH2PO4，用去離子水50.0 mL溶解，調(diào)節(jié)pH至7.6，另取胰蛋白酶1.0 g于適量水溶解，合并上述溶液并加水稀釋至100.0 mL，即為模擬十二指腸仿生消化液。將pH調(diào)節(jié)到6.8即為模擬小腸仿生消化液。

所有模擬胃腸仿生消化液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.5 花生肽亞鐵的人胃腸仿生消化過(guò)程

人胃腸仿生消化參考Cruz-Huerta等[14]方法并作修改。采用雙酶三階段法進(jìn)行連續(xù)人胃腸仿生消化，分為胃仿生消化、十二指腸仿生消化和小腸仿生消化。具體仿生消化過(guò)程為：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 mg花生肽亞鐵加入至100.0 mL胃仿生消化液中，于(37±0.5)℃和100 r/min條件下進(jìn)行胃仿生消化2 h，每間隔30 min取樣，收集的樣品命名為SGF1～SGF4(分別對(duì)應(yīng)消化30、60、90、120 min)。胃仿生消化完成后，用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.6，終止胃仿生消化，8 000 r/min離心20 min，收集沉淀。沉淀用十二指腸仿生消化液溶解并于(37±0.5)℃和50 r/min條件下十二指腸仿生消化1 h，每間隔30 min取樣，收集的樣品命名SDF1、SDF2(分別對(duì)應(yīng)消化30、60 min)。十二指腸仿生消化完成后，調(diào)pH至6.8，繼續(xù)在(37±0.5)℃、50 r/min條件下仿生小腸消化3 h，每間隔30 min取樣，收集的樣品命名SIF1～SIF6 (分別對(duì)應(yīng)消化30、60、90、120、150、180 min)。

1.2.6 花生肽亞鐵螯合率的測(cè)定

采用改進(jìn)的乙醇沉淀法[7,10,15]測(cè)定花生肽亞鐵螯合率。取待測(cè)樣2.00 mL，加入8.00 mL無(wú)水乙醇混勻，靜置2 h后于8 000 r/min離心20 min，去除沉淀后將上清液濃縮至2 mL，加入8倍體積的無(wú)水乙醇，靜置2 h后8 000 r/min離心20 min，測(cè)定上清液中亞鐵含量，鐵含量采取鄰菲羅琳510 nm比色法[12]測(cè)定，樣品總鐵含量采用GB 5009.90—2016火焰原子吸收光譜法測(cè)定。按下式計(jì)算亞鐵螯合率。

式中：M1為2 mL待測(cè)樣對(duì)應(yīng)的花生肽亞鐵所含的鐵含量，mg；M2為上清液中游離亞鐵含量，mg。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 花生肽亞鐵的pH穩(wěn)定性(見(jiàn)圖1)

注：圖中字母相同表示3種PPC的亞鐵螯合率差異不顯著(p>0.05)，字母不同表示差異極顯著(p<0.01)，下同。

由圖1可看出：L-PPC比M-PPC和H-PPC具有更好的pH穩(wěn)定性，在pH 1～9范圍內(nèi)能保持較好的穩(wěn)定性，與M-PPC和H-PPC有極顯著差異；pH為10.0時(shí)，L-PPC亞鐵螯合率小于60%，隨著pH的進(jìn)一步增加，亞鐵螯合率呈遞減趨勢(shì)。相同pH條件下，H-PPC穩(wěn)定性最差，主要是由于H-PPC配位螯合載體為大于3.0 kDa的花生肽，相對(duì)分子質(zhì)量較大。研究認(rèn)為，花生肽亞鐵pH穩(wěn)定性與載體相對(duì)分子質(zhì)量成反比，低相對(duì)分子質(zhì)量載體制備的花生肽具有更好的穩(wěn)定性。H-PPC在極端pH條件下(如pH<2和pH>9)，亞鐵螯合率不足50%，主要是由于相對(duì)分子質(zhì)量大的多肽載體在酸性或堿性條件下易發(fā)生分解，從而使已螯合的亞鐵離子由共價(jià)結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)[16]。L-PPC在酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性，仍保持較高的亞鐵螯合率，意味著L-PPC具有較好的酸耐受性。

2.2 花生肽亞鐵的熱穩(wěn)定性(見(jiàn)圖2)

圖2 花生肽亞鐵的熱穩(wěn)定性

由圖2可以看出，60℃以下L-PPC亞鐵螯合率可保持80%以上，M-PPC在50℃以下可保持75%以上的亞鐵螯合率，與L-PPC差異不顯著，而與H-PPC有極顯著差異。當(dāng)溫度達(dá)70℃以上，L-PPC、M-PPC和H-PPC的亞鐵螯合率均顯著下降，且隨著溫度上升，亞鐵螯合率呈線(xiàn)性下降。作為花生肽亞鐵金屬營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的口服制劑，以低溫或常溫儲(chǔ)存較為普遍，因此60℃以下能保持較好的穩(wěn)定性，基本上可滿(mǎn)足生產(chǎn)技術(shù)要求[17-18]。從L-PPC、M-PPC和H-PPC的熱耐受性來(lái)看，低相對(duì)分子質(zhì)量載體制備的花生肽亞鐵具有更好的熱耐受性。在60℃時(shí)，L-PPC亞鐵螯合率仍保持在(80.65±1.02)%，而H-PPC在37℃時(shí)亞鐵螯合率僅為(54.38±0.95)%。隨著溫度的持續(xù)上升，H-PPC 的亞鐵螯合率呈顯著下降趨勢(shì)，特別是在溫度高于50℃后，其亞鐵螯合率低于50%。說(shuō)明對(duì)于H-PPC 來(lái)說(shuō)，溫度的持續(xù)上升使超過(guò)50%的結(jié)合態(tài)亞鐵由于多肽鏈的破壞而變?yōu)橛坞x的亞鐵離子[19]，主要是由于多肽載體相對(duì)分子質(zhì)量較大時(shí)熱穩(wěn)定性較差，特別當(dāng)溫度較高時(shí)，容易引起多肽載體的熱沉凝聚[10]，亞鐵螯合率相應(yīng)顯著降低。

2.3 花生肽亞鐵胃仿生消化耐受性(見(jiàn)圖3)

圖3 花生肽亞鐵胃仿生消化耐受性

由圖3可以看出，不同相對(duì)分子質(zhì)量載體制備的花生肽亞鐵表現(xiàn)出不同的胃酸耐受性。在胃仿生消化30 min時(shí)，L-PPC和M-PPC亞鐵螯合率差異不顯著，亞鐵螯合率分別為(89.50±0.70)%和(89.01±0.66)%，但與H-PPC亞鐵螯合率((72.74±0.68)%)差異極顯著。隨著胃仿生消化時(shí)間的延長(zhǎng)，L-PPC、M-PPC和H-PPC表現(xiàn)的胃酸耐受性呈現(xiàn)極顯著性差異。胃仿生消化90 min和120 min時(shí)，M-PPC和H-PPC的亞鐵螯合率分別為(71.83±1.32)%、(56.61±1.16)%和(61.46±1.25)%和(53.90±1.33)%。胃仿生消化120 min時(shí)，相對(duì)于胃仿生消化30 min，L-PPC、M-PPC和H-PPC的亞鐵螯合率殘存率分別為91.15%、69.05%和74.10%。因此，L-PPC胃酸耐受性明顯高于M-PPC和H-PPC，與前述的pH穩(wěn)定性結(jié)果一致。主要是由于L-PPC的載體相對(duì)分子質(zhì)量較小，具有較好的穩(wěn)定性，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的載體則穩(wěn)定性較差[7]。

2.4 花生肽亞鐵腸仿生消化耐受性(見(jiàn)圖4)

由圖4可看出，L-PPC與M-PPC和H-PPC的亞鐵螯合率在十二指腸仿生消化和小腸仿生消化過(guò)程中均存在極顯著差異，其中L-PPC腸耐受性最好。L-PPC在十二指腸仿生消化階段，亞鐵螯合率保持在75%以上，而M-PPC和H-PPC經(jīng)十二指腸仿生消化60 min，亞鐵螯合率分別下降至(57.93±0.83)%和(45.65±0.87)%。在小腸仿生消化階段，L-PPC亞鐵螯合率呈小幅下降，小腸仿生消化180 min，亞鐵螯合率為(66.96±1.73)%，而M-PPC降至(38.42±0.85)%，H-PPC腸耐受性最差，小腸仿生消化180 min，其亞鐵螯合率僅為(18.34±0.72)%。主要是由于H-PPC載體在小腸仿生消化時(shí)遭到破壞，使共價(jià)結(jié)合的亞鐵變成游離態(tài)的亞鐵[20]。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)分別以小于1.0 kDa、1.0～3.0 kDa和大于3.0 kDa的花生肽為載體，以氯化亞鐵為配體，采用液相合成法制備L-PPC、M-PPC和H-PPC，研究了其pH、熱穩(wěn)定性和胃腸消化耐受性。研究表明：L-PPC具有較好的pH穩(wěn)定性和酸耐受性，與M-PPC 和H-PPC存在極顯著差異，H-PPC的pH穩(wěn)定性最差；L-PPC具良好熱穩(wěn)定性，60℃條件下亞鐵螯合率仍保持在(80.65±1.02)%，H-PPC在37℃時(shí)亞鐵螯合率僅有(54.38±0.95)%；胃仿生消化30 min，L-PPC和M-PPC亞鐵螯合率差異不顯著，與H-PPC差異極顯著，L-PPC胃酸耐受性明顯高于M-PPC和H-PPC；在十二指腸仿生消化階段，L-PPC亞鐵螯合率與M-PPC和H-PPC亞鐵螯合率差異極顯著；在小腸仿生消化階段，L-PPC 仿生消化180 min，亞鐵螯合率為(66.96±1.73)%，而M-PPC降至(38.42±0.85)%，H-PPC腸耐受性最差。研究結(jié)果說(shuō)明，低相對(duì)分子質(zhì)量載體制備的花生肽亞鐵具有更好的pH穩(wěn)定性、熱耐受性和胃腸消化耐受性，經(jīng)胃腸仿生消化后仍保持相對(duì)較高的亞鐵螯合率。制備花生肽亞鐵時(shí)應(yīng)選擇低相對(duì)分子質(zhì)量的花生肽作為載體，以提高花生肽亞鐵的消化吸收率、穩(wěn)定性和胃腸耐受性。