包小蘭，袁興宇，李 歡，朝魯巴根，韓 博

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院， 呼和浩特 010065)

油葵作為主要油料作物之一在我國被廣泛種植[1]。長期以來，秋收后的油葵除葵花籽用作榨油外其余成分均未被有效利用，如葵花盤幾乎被廢棄，當(dāng)作牲畜飼料或垃圾焚燒，不僅污染環(huán)境還造成資源浪費(fèi)[2-3]?？ūP的利用近年來逐漸被重視，葵花盤富含一些活性物質(zhì)如多糖、綠原酸、果膠、多酚、黃酮等[4]，對于其果膠及綠原酸的提取技術(shù)目前已較為成熟[5]，但對葵花盤中一些醇溶物如多糖、多酚、黃酮的研究不甚詳盡，其有效生物活性的開發(fā)更是少之甚少?，F(xiàn)階段對于葵花盤中果膠的提取已經(jīng)投入商業(yè)生產(chǎn)且初見規(guī)模，隨之廢棄的大量脫除果膠后的葵花盤渣，造成了巨大的浪費(fèi)[6-8]。為此，本文以脫膠葵花盤渣為原料，探討脫膠葵花盤醇溶物提取工藝及抗氧化活性，為脫膠葵花盤的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考，提高葵花籽工業(yè)副產(chǎn)品資源利用率和綜合經(jīng)濟(jì)效益，為新型功能性食品開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

脫膠葵花盤渣，內(nèi)蒙古康斯特生物科技有限公司；ABTS、DPPH，美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、苯酚、無水碳酸鈉、福林酚試劑、三氯化鐵、三氯乙酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5-A型飛鴿牌系列離心機(jī)，LCJ-25C型冷凍干燥機(jī)，AL204型電子天平，PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，HJ-6型數(shù)顯恒溫磁力水浴鍋，HJ-1型磁力攪拌器，GZX-9140 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，F(xiàn)S-150型超聲波處理器，UV-5500 PC 型紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫膠葵花盤醇溶物的提取

將脫膠葵花盤渣用高速粉碎機(jī)粉碎，與蒸餾水混合均勻，4 000 r/min離心15 min收集沉淀，30℃烘干后粉碎過60目篩，得脫膠葵花盤粗粉。稱取該粗粉，按一定比例與一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液混合，超聲波輔助處理一定時間后在一定溫度下攪拌浸提，浸提結(jié)束后4 000 r/min離心20 min，取上清液濃縮后真空冷凍干燥獲得醇提物，于密封袋4℃保存?zhèn)溆?。以醇提物得率及其質(zhì)量濃度為1 mg/mL時的DPPH自由基清除率為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化。按下式計(jì)算醇提物得率。

醇提物得率=醇提物質(zhì)量/脫膠葵花盤粗渣質(zhì)量×100%

1.2.2 脫膠葵花盤醇提物抗氧化活性分析

1.2.2.1 DPPH 自由基清除率的測定[9]

取1 mL不同質(zhì)量濃度的脫膠葵花盤醇提物溶液，依次加入1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L，95%乙醇配制)充分混勻，室溫避光靜置30 min，517 nm測定吸光值；用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液為樣品參比組；空白組為1 mL的DPPH溶液與1 mL的95%乙醇溶液。DPPH自由基清除率根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算。

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Ai為樣品組吸光值；Aj為樣品參比組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.2.2.2 羥自由基清除率的測定[10]

取1 mL不同質(zhì)量濃度的脫膠葵花盤醇提物溶液，加入0.3 mL FeSO4、1 mL水楊酸、0.25 mL H2O2，混勻后37℃下水浴30 min，再加入0.45 mL蒸餾水離心，取上清液在510 nm處測吸光值。設(shè)置空白組。羥自由基清除率按下式計(jì)算。

羥自由基清除率=(A0-Ai)/A0×100%

式中：A0為空白組吸光值；Ai為樣品組吸光值。

1.2.2.3 ABTS自由基清除率的測定[11]

將5 mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液與88 μL 2.6 mmol/L的過硫酸鉀混勻后室溫放置16 h，配制成ABTS工作液，室溫條件下波長734 nm處吸光值為0.70±0.02。0.2 mL ABTS工作液與10 μL不同質(zhì)量濃度的脫膠葵花盤醇提物混合后靜置6 min，在734 nm處測定吸光值。ABTS自由基清除率按下式計(jì)算。

ABTS自由基清除率=(A0-Ai)/A0×100%

式中：A0為空白組吸光值；Ai為樣品組吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫膠葵花盤醇溶物提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，分別以1∶8、1∶11、1∶14、1∶17、1∶20的料液比，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波處理15 min，50℃下恒溫攪拌提取1.0 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 料液比對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

由圖1可知，當(dāng)料液比從1∶8增加到1∶17時，脫膠葵花盤醇提物得率和DPPH自由基清除率一直處于上升狀態(tài)，當(dāng)料液比為1∶17時，脫膠葵花盤醇提物得率達(dá)到最大值(19.94%)，DPPH自由基清除率也達(dá)到最大值(69.27%)。但當(dāng)料液比從1∶17增加到1∶20時，脫膠葵花盤醇提物得率及DPPH自由基清除率分別下降至18.11%和68.11%。在此反應(yīng)體系中，料液比過高或過低都不利于醇溶物的提取。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適料液比為1∶17。

2.1.2 超聲波處理時間對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，以1∶17的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波分別處理15、30、45、60、75 min，50℃下恒溫攪拌提取1.0 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲波處理時間對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

由圖2可知，當(dāng)超聲波處理時間從15 min延長至30 min時，醇提物得率和DPPH自由基清除率均呈上升趨勢，當(dāng)超聲波處理時間為30 min時，脫膠葵花盤醇提物得率達(dá)到最大值(17.21%)，同時，DPPH自由基清除率也達(dá)到最大值(70.91%)，當(dāng)超聲波處理時間從30 min延長至75 min時，脫膠葵花盤醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈下降趨勢。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適超聲波處理時間為30 min。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，以1∶17的料液比加入體積分?jǐn)?shù)分別為60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波處理30 min，50℃下恒溫攪拌提取1.0 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從60%增加到70%時，醇提物得率從10.88%上升到15.31%，DPPH自由基清除率從62.49%上升到70.57%，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從70%增加到80%時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均下降。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

2.1.4 浸提溫度對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，以1∶17的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波處理30 min，分別在20、35、50、65、80℃下恒溫攪拌提取1.0 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸提溫度對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

由圖4可知，當(dāng)浸提溫度從20℃升至50℃時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均處于上升趨勢，醇提物得率從11.87%上升到18.23%，DPPH自由基清除率從65.44%上升到70.92%。當(dāng)浸提溫度從50℃升至80℃時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈下降趨勢。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適浸提溫度為50℃。

2.1.5 浸提時間對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，以1∶17的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波處理30 min，50℃下分別恒溫攪拌提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，當(dāng)浸提時間從0.5 h延長至1.0 h時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均處于上升趨勢，醇提物得率從13.01%上升到16.19%，DPPH自由基清除率從64.62%上升到69.13%。當(dāng)浸提時間從1.0 h延長到2.5 h時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適浸提時間為1.0 h。

圖5 浸提時間對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

2.2 脫膠葵花盤醇溶物提取的正交實(shí)驗(yàn)

按照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇浸提溫度(A)、浸提時間(B)、超聲波處理時間(C)、料液比(D)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(E)進(jìn)行五因素四水平正交實(shí)驗(yàn)，確定醇溶物最佳提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

續(xù)表2

實(shí)驗(yàn)號ABCDE得率/%DPPH自由基清除率/%DPPH自由基清除率k164.0064.2666.0765.3665.63k265.6169.0968.3567.3866.72k365.7665.6762.7265.1466.55k468.9465.2867.1666.4365.41R4.944.835.632.241.31

由表2可知，5個因素對醇提物得率的影響程度順序?yàn)榻釡囟?浸提時間>超聲波處理時間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比，最佳組合是A4B2C2D2E2，5個因素對醇提物的DPPH自由基清除率的影響程度順序?yàn)槌暡ㄌ幚頃r間>浸提溫度>浸提時間>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)，最佳組合是A4B2C2D2E2，與醇提物得率的最佳提取工藝條件一致。即本實(shí)驗(yàn)醇溶物的最佳提取工藝條件為浸提溫度60℃、超聲波處理時間30 min、料液比1∶17、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸提時間1.0 h，經(jīng)驗(yàn)證，在此工藝條件下脫膠葵花盤醇提物得率達(dá)到20.32%，DPPH自由基清除率達(dá)到72.13%。

2.3 脫膠葵花盤醇提物的抗氧化活性

2.3.1 脫膠葵花盤醇提物質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，常被用來評價抗氧化劑對自由基的清除能力，對DPPH自由基的清除效果可反映抗氧化劑的供氫能力[12-13]。分析了脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖6所示。

圖6 脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率

由圖6可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，脫膠葵花盤醇提物DPPH自由基清除率呈上升趨勢，但低于相同質(zhì)量濃度VC的DPPH自由基清除率。VC對DPPH 自由基的清除能力始終保持在較高水平。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率為50.03%，VC的DPPH自由基清除率為90.69%；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率為81.02%，VC的DPPH自由基清除率為95.82%，兩者的差距明顯縮小?？梢婋S著質(zhì)量濃度的升高，脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率逐漸接近VC。

2.3.2 脫膠葵花盤醇提物質(zhì)量濃度對羥自由基清除率的影響

羥自由基可通過細(xì)胞膜與脂質(zhì)、DNA以及蛋白質(zhì)等生物大分子對組織造成損傷，或引起氧化損傷[14]。脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率如圖7所示。

圖7 脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率

由圖7可知，脫膠葵花盤醇提物對羥自由基有一定的清除作用，但清除能力低于VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率為25.52%，VC的羥自由基清除率為79.68%；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率為48.22%；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率為49.58%，VC的羥自由基清除率為97.69%，表明質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物羥自由基清除率已經(jīng)達(dá)到較高值，繼續(xù)提高質(zhì)量濃度，羥自由基清除率變化無顯著性差異。說明前期醇提物質(zhì)量濃度對羥自由基清除率影響呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.3.3 脫膠葵花盤醇提物質(zhì)量濃度對ABTS自由基清除率的影響

ABTS在氧化劑的作用下會形成藍(lán)綠色的單陽離子自由基[15]，當(dāng)有抗氧化劑存在時，該自由基的形成會受到抑制，顏色變淺，吸光值減小[16]。脫膠葵花盤醇提物的ABTS自由基清除率如圖8所示。

圖8 脫膠葵花盤醇提物的ABTS自由基清除率

由圖8可知，脫膠葵花盤醇提物具有一定的ABTS自由基清除活力，但相比VC較低。當(dāng)脫膠葵花盤醇提物質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，其ABTS自由基清除率為28.95%，隨著質(zhì)量濃度的增大，脫膠葵花盤醇提物的ABTS自由基清除能力增加，當(dāng)脫膠葵花盤醇提物質(zhì)量濃度達(dá)到1.6 mg/mL時，其ABTS自由基清除率為49.92%，呈劑量依賴性。

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得到脫膠葵花盤醇溶物的最佳提取工藝條件為：料液比1∶ 17，超聲波處理時間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，浸提溫度60℃，浸提時間1.0 h。在最佳工藝條件下，脫膠葵花盤醇提物得率達(dá)到20.32%，DPPH自由基清除率達(dá)到72.13%。脫膠葵花盤醇提物對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基均具有一定的清除能力。脫膠葵花盤醇提物隨質(zhì)量濃度的增大，DPPH自由基清除率越接近VC，羥自由基清除率及ABTS自由基清除率低于VC，不同自由基清除率與醇提物質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)一定劑量依賴性。以上結(jié)果表明脫膠葵花盤醇提物具有較好的抗氧化活性。