張莉莎，倪菁潞，劉睿杰，常 明，金青哲，王興國(guó)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122)

脂質(zhì)伴隨物是植物油中一類具有生物活性的化學(xué)物質(zhì)總稱，包括酚類、植物甾醇、谷維素、角鯊烯、類胡蘿卜素等，這些伴隨物結(jié)構(gòu)中均含有活潑酚羥基，可捕獲過量自由基，因此具有很強(qiáng)的抗氧化能力[1]。

有研究表明，植物的強(qiáng)抗氧化能力并非單個(gè)化合物的貢獻(xiàn)，而是多個(gè)組分共同作用的結(jié)果。不同抗氧化劑聯(lián)用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)不同結(jié)果[2]。當(dāng)復(fù)合抗氧化劑效果大于單獨(dú)抗氧化劑效果時(shí)為協(xié)同作用，等于單獨(dú)抗氧化劑效果時(shí)為加和作用，而小于時(shí)則為拮抗作用[3]。在油脂復(fù)雜體系中，各脂質(zhì)伴隨物均具有抗氧化作用，相互之間必然也存在抗氧化作用。另有學(xué)者稱在不同溶劑體系中，抗氧化劑清除自由基的機(jī)制不同[4]，而這種不同機(jī)制可能會(huì)使抗氧化劑之間相互作用類型改變[5]。近年，乙酸乙酯作為有效溶解脂質(zhì)分子的理想溶劑在研究植物油脂溶性成分抗氧化等諸多方面均有應(yīng)用[6-7]。

鑒于此，本研究選擇乙酸乙酯作為理想化的非極性介質(zhì)，利用Bliss模型研究α-生育酚、γ-谷維素以及植物甾醇3種脂質(zhì)伴隨物抗氧化相互作用類型及機(jī)理。研究結(jié)果可為探討脂質(zhì)伴隨物在真實(shí)油脂介質(zhì)中的相互作用提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

植物甾醇(5%豆甾醇、75%β-谷甾醇和15%菜油甾醇)標(biāo)準(zhǔn)品、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；γ-谷維素(39%環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯、50% 24-亞甲基環(huán)木菠蘿醇阿魏酸酯和6%菜油甾醇阿魏酸酯)，購(gòu)自加拿大多倫多化學(xué)研究所；乙酸乙酯(分析純)，購(gòu)自上海國(guó)藥試劑公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

EL204電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-2100分光光度計(jì)，Unico公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單獨(dú)抗氧化劑與混合抗氧化劑儲(chǔ)備液配制

用乙酸乙酯分別配制1 mmol/Lα-生育酚、γ-谷維素及植物甾醇儲(chǔ)備液，并保存于-18℃。單獨(dú)抗氧化劑工作液用儲(chǔ)備液分別稀釋為:α-生育酚25、50、100、200、400、500、800、1 000 mg/kg，γ-谷維素和植物甾醇250、500、1 000、2 000、4 000、8 000、10 000、20 000 mg/kg。復(fù)合抗氧化劑溶液按照體積比1∶1配制，復(fù)配后體系中3種脂質(zhì)伴隨物實(shí)際含量見表1。

表1 復(fù)配后體系中3種脂質(zhì)伴隨物實(shí)際含量 mg/kg

1.2.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

在Espín等[8]的評(píng)價(jià)方法上略有改動(dòng)，用乙酸乙酯配制0.1 mmol/L DPPH溶液，取2.0 mL 于5 mL 離心管中，加入100 μL樣液，室溫下避光反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，于517 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度的變化。DPPH自由基清除能力(ESC)按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：A0為100 μL乙酸乙酯+2.0 mL DPPH溶液的吸光度；Ai為100 μL樣液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度；Aj為100 μL樣液+2.0 mL 乙酸乙酯的吸光度。

1.2.3 協(xié)同度計(jì)算

協(xié)同度(SE)按式(2)和式(3)計(jì)算。

(2)

(3)

式中：TSCmix表示復(fù)配體系中理論DPPH自由基清除能力；ESCmix表示復(fù)配體系中實(shí)際DPPH自由基清除能力；ESCA和ESCB分別表示復(fù)配體系中組分A和組分B的DPPH自由基清除能力。

當(dāng)SE<1時(shí)，表明兩種物質(zhì)復(fù)配呈現(xiàn)拮抗作用；SE>1時(shí)，表明兩種物質(zhì)復(fù)配呈現(xiàn)協(xié)同作用；SE接近1時(shí)，兩種物質(zhì)復(fù)配呈現(xiàn)加和作用。協(xié)同作用、拮抗作用或加和作用取決于DPPH自由基清除能力的理論值與實(shí)驗(yàn)值之間是否存在數(shù)學(xué)上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2.4 單獨(dú)抗氧化劑及復(fù)合抗氧化劑動(dòng)力學(xué)探究

通過監(jiān)測(cè)最大波長(zhǎng)處的DPPH吸光度隨時(shí)間的變化確定3種脂質(zhì)伴隨物以及復(fù)配體系清除DPPH自由基過程[9]。反應(yīng)在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中進(jìn)行。通過將100 μL樣品與100 μL DPPH溶液(1 mmol/L)加入至96孔酶標(biāo)板，波長(zhǎng)為517 nm，每隔20 s記錄一次吸光度的變化，計(jì)算DPPH自由基清除能力，直至反應(yīng)達(dá)到平衡，以此進(jìn)行樣品的動(dòng)力學(xué)分析。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜探究相互作用機(jī)理

使用分辨率為±0.5 cm-1的傅里葉變換紅外光譜儀評(píng)估形成的氫鍵。傅里葉變換紅外光譜儀由OMNIC軟件控制，通過在瑪瑙研缽中與溴化鉀(KBr)粉末混合制備樣品，在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)，每次測(cè)量收集平均32次掃描。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

以上所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用SPSS22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。組間差異采用One-way ANOVA方差分析，Post-Hot 采用Duncan檢驗(yàn)，P<0.05，差異具有顯著性；P<0.01，差異具有極顯著性。數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種脂質(zhì)伴隨物DPPH自由基清除能力(見圖1)

圖1 3種脂質(zhì)伴隨物DDPH自由基清除能力

由圖1可知，α-生育酚(25～1 000 mg/kg)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，在含量為1 000 mg/kg時(shí)，DPPH自由基清除能力達(dá)到98.1%，雖然其分子結(jié)構(gòu)中只含有一個(gè)供氫原子的酚羥基，但被認(rèn)為是植物油微量物質(zhì)中最有效的自由基清除化合物[10]。γ-谷維素在250～20 000 mg/kg范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，在含量為1 000 mg/kg時(shí)，DPPH自由基清除能力達(dá)到38.4%。γ-谷維素是阿魏酸與甾醇的酯化物，其之所以具有抗氧化能力，得益于其結(jié)構(gòu)上的阿魏酸。在同等含量下，α-生育酚DPPH自由基清除能力約為γ-谷維素的2.55倍。當(dāng)γ-谷維素的含量增大至8 000 mg/kg時(shí)，其DPPH自由基清除能力達(dá)到91.2%，之后基本保持不變。而植物甾醇在250～20 000 mg/kg范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力僅為2%左右，這與前人的研究結(jié)果相同[11]。植物甾醇幾乎沒有清除DPPH自由基能力。可見，在乙酸乙酯介質(zhì)中3種脂質(zhì)伴隨物清除DPPH自由基能力大小為α-生育酚>γ-谷維素>植物甾醇。

2.2 復(fù)合抗氧化劑DDPH自由基清除能力及相互作用類型

圖2為3種脂質(zhì)伴隨物在乙酸乙酯中的相互作用結(jié)果，分別顯示了在乙酸乙酯介質(zhì)中，α-生育酚+γ-谷維素、α-生育酚+植物甾醇以及γ-谷維素+植物甾醇復(fù)配后采用Bliss模型所計(jì)算的清除DPPH自由基相互作用類型。

注：*為P<0.05，**為P<0.01，表示理論值和實(shí)驗(yàn)值有顯著差異。

圖2 復(fù)合抗氧化劑DPPH自由基清除能力及相互作用類型

由圖2(a)可以看出，α-生育酚與γ-谷維素在所有復(fù)配含量下組成的復(fù)合抗氧化劑的SE值都小于1，表現(xiàn)為拮抗作用，且復(fù)配后其清除DPPH自由基能力的實(shí)驗(yàn)值與理論值之間存在極顯著差異(P<0.01)。500 mg/kgα-生育酚與10 000 mg/kgγ-谷維素復(fù)配(M6)的SE值最高，為0.96，DPPH自由基清除能力實(shí)際值為92.63%，理論值為96.81%，降低4.3%。由圖2(b)可以看出，α-生育酚與植物甾醇的相互作用類型幾乎全表現(xiàn)為拮抗作用。500 mg/kgα-生育酚與10 000 mg/kg植物甾醇復(fù)配(M12)，其相互作用類型為加和作用，SE值為1.00，DPPH自由基清除能力實(shí)際值比理論值低0.5%，理論值與實(shí)驗(yàn)值之間無顯著性差異。由圖2(c)可以看出，γ-谷維素與植物甾醇在前兩種含量復(fù)配(M13，M14)下表現(xiàn)為加和作用，而10 000 mg/kgγ-谷維素和10 000 mg/kg植物甾醇復(fù)配(M18)，SE值等于0.93，DPPH自由基清除能力實(shí)際值為88.01%，理論值為94.40%，降低了6.8%，兩者之間存在極顯著性差異，表現(xiàn)為拮抗作用?？梢姡|(zhì)伴隨物的含量會(huì)影響物質(zhì)相互作用程度甚至相互作用類型[12]。有研究表明，在同一介質(zhì)中抗氧化劑的相互作用類型與其氧化還原電動(dòng)勢(shì)有關(guān)。γ-谷維素與植物甾醇的氧化還原電動(dòng)勢(shì)比α-生育酚高，可能會(huì)抑制α-生育酚的重生，從而導(dǎo)致拮抗作用的產(chǎn)生[13]。

2.3 單獨(dú)抗氧化劑及復(fù)合抗氧化劑動(dòng)力學(xué)探究

為了進(jìn)一步探索在α-生育酚分別與γ-谷維素和植物甾醇復(fù)配以及谷維素與植物甾醇復(fù)配后在乙酸乙酯非極性介質(zhì)中清除自由基相互作用機(jī)理，運(yùn)用動(dòng)力學(xué)進(jìn)一步監(jiān)測(cè)200 s內(nèi)吸光度的變化。通過比較抗氧化劑單獨(dú)和復(fù)配后清除自由基的速率，進(jìn)一步揭示3種脂質(zhì)伴隨物復(fù)配后的抗氧化機(jī)理。DPPH自由基清除能力和時(shí)間依賴性的數(shù)學(xué)模型是指數(shù)函數(shù)，公式如下：

y=a(1-e-bx)

(4)

式中：y為DPPH自由基清除能力；a和b為擬合系數(shù)；x為時(shí)間。

基于等式(4)中的參數(shù)a和b進(jìn)行非線性回歸擬合，繪制得圖3中的曲線，擬合參數(shù)見表2。

注：?jiǎn)为?dú)抗氧化劑中α-生育酚含量500 mg/kg，γ-谷維素和植物甾醇含量均為10 000 mg/kg。下同。

圖3 3種單獨(dú)和復(fù)合抗氧化劑DPPH自由基清除動(dòng)力學(xué)曲線

由圖3可以看出，在實(shí)驗(yàn)含量范圍內(nèi)，幾種脂質(zhì)伴隨物及其組合反應(yīng)速率快慢為α-生育酚≈α-生育酚+γ-谷維素≈α-生育酚+植物甾醇>γ-谷維素≈γ-谷維素+植物甾醇>植物甾醇。表明當(dāng)復(fù)配體系中主抗氧化劑含量達(dá)到一定程度后，將會(huì)決定體系清除DPPH自由基的速率。

DPPH自由基清除速率(RS)可用來比較3種脂質(zhì)伴隨物單獨(dú)及復(fù)配后與DPPH自由基的反應(yīng)快慢。對(duì)于所有非線性動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，唯一有用的速率是最大值[14]。因此，對(duì)等式(4)進(jìn)行求導(dǎo)，通過計(jì)算每條曲線的速率，進(jìn)而求得時(shí)間等于2 s時(shí)各自的實(shí)際速率大小，結(jié)果見表2。

表2 DPPH自由基清除動(dòng)力學(xué)參數(shù)

由表2可知，單獨(dú)抗氧化劑(除植物甾醇外)和復(fù)合抗氧化劑清除DPPH自由基動(dòng)力學(xué)曲線決定系數(shù)及校正系數(shù)均達(dá)到0.9以上，指數(shù)函數(shù)擬合曲線較好。復(fù)合抗氧化劑反應(yīng)速率取決于復(fù)配體系中主抗氧化劑的反應(yīng)速率。在時(shí)間為2 s時(shí)，α-生育酚單獨(dú)清除DPPH自由基的反應(yīng)速率為9.114 s-1，而α-生育酚+植物甾醇在同一時(shí)間下的反應(yīng)速率最快，為10.346 s-1。500 mg/kgα-生育酚與10 000 mg/kg植物甾醇復(fù)配(M12)后，清除DPPH自由基能力達(dá)到61.46%(見圖2(b))，與等含量下α-生育酚清除DPPH自由基能力60.31%接近(見圖1)，表明此含量下植物甾醇對(duì)α-生育酚清除DPPH自由基能力的影響很小。500 mg/kgα-生育酚+10 000 mg/kgγ-谷維素復(fù)配之后的反應(yīng)速率略微加快，但整體清除DPPH自由基能力的實(shí)驗(yàn)值較理論值低，呈現(xiàn)拮抗作用(見圖2(a))。10 000 mg/kgγ-谷維素與10 000 mg/kg植物甾醇復(fù)配的反應(yīng)速率較單獨(dú)γ-谷維素的低，兩者復(fù)配(M18)的DPPH自由基清除能力達(dá)到88%(見圖2(c))，較單獨(dú)10 000 mg/kgγ-谷維素DPPH自由基清除能力(92%)(見圖1)低，在同樣反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，使得復(fù)配體系清除DPPH自由基的能力較弱。

2.4 傅里葉變換紅外光譜探究相互作用機(jī)理

在乙酸乙酯介質(zhì)中，單獨(dú)抗氧化劑、抗氧化劑兩兩以溶液形式進(jìn)行復(fù)配后，均用N2將溶劑吹干。然后通過傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)體系中的羥基鍵，通過羥基鍵的變動(dòng)推測(cè)復(fù)配后體系中有無氫鍵存在。圖4顯示了3種脂質(zhì)伴隨物及復(fù)配后的紅外光譜圖。

圖4 α-生育酚、γ-谷維素、植物甾醇及復(fù)配后的紅外光譜圖

由圖4可以看出，當(dāng)α-生育酚與γ-谷維素復(fù)配后，羥基的波數(shù)為3 458 cm-1，與單獨(dú)α-生育酚羥基波數(shù)3 460 cm-1相比較，有輕微地向低波數(shù)方向移動(dòng)。當(dāng)α-生育酚與植物甾醇復(fù)配后，羥基的波數(shù)為3 428 cm-1，與單獨(dú)α-生育酚羥基處波數(shù)相比，向右移動(dòng)了32 cm-1。當(dāng)γ-谷維素與植物甾醇復(fù)配后，羥基波數(shù)為3 444 cm-1，而單獨(dú)的γ-谷維素波數(shù)為3 454 cm-1，右移了10 cm-1?？梢?，3種脂質(zhì)伴隨物復(fù)配后體系內(nèi)均存在氫鍵締合，減少了羥基數(shù)目，降低供電子能力，從而削弱了與DPPH自由基反應(yīng)能力。

3 結(jié) 論

乙酸乙酯非極性介質(zhì)中，3種脂質(zhì)伴隨物α-生育酚(25～500 mg/kg)、γ-谷維素(250～10 000 mg/kg)和植物甾醇(250～10 000 mg/kg)兩兩復(fù)配后主要呈拮抗作用。500 mg/kgα-生育酚分別與10 000 mg/kgγ-谷維素、10 000 mg/kg植物甾醇復(fù)配后，呈現(xiàn)拮抗與加和作用，10 000 mg/kgγ-谷維素+10 000 mg/kg 植物甾醇協(xié)同度等于0.93,為拮抗作用；隨后在上述復(fù)配含量范圍內(nèi)，通過動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)非極性介質(zhì)復(fù)配體系的反應(yīng)速率主要由體系中主抗氧化劑決定；同時(shí)采用傅里葉變換紅外光譜儀檢測(cè)復(fù)配脂質(zhì)伴隨物光譜，發(fā)現(xiàn)羥基右移，進(jìn)而推測(cè)氫鍵的形成可能是導(dǎo)致3種脂質(zhì)伴隨物在乙酸乙酯中產(chǎn)生拮抗作用的原因。