陳濤 孫旭超 張善磊 梁文化 周麗慧 趙慶勇 姚姝 趙凌 趙春芳 朱鎮(zhèn) 張亞東 王才林,*

稻瘟病廣譜抗性基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用

陳濤1, 2孫旭超1張善磊1梁文化1周麗慧1趙慶勇1姚姝1趙凌1趙春芳1朱鎮(zhèn)1張亞東1王才林1,*

(1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國(guó)家水稻改良中心 南京分中心, 南京 210014;2揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚(yáng)州 225009；*通信聯(lián)系人, E-mail: clwang@jaas.ac.cn)

【目的】來自秈稻品種谷梅4號(hào)的是一個(gè)對(duì)稻瘟病菌具有廣譜和持久抗性的重要基因。為有效提高基因的選擇效率，有必要開發(fā)具有特異性的共顯性分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種?！痉椒ā勘狙芯扛鶕?jù)谷梅4號(hào)位點(diǎn)存在的特異性核苷酸變異，利用Tetra-primer ARMS-PCR和KASP兩種不同的基因分型技術(shù)開發(fā)出分子標(biāo)記T-和K-，對(duì)不同品種(品系)以及淮稻9號(hào)/谷梅4號(hào)的F2分離群體進(jìn)行基因型檢測(cè)，并結(jié)合穗頸瘟人工接種鑒定，對(duì)標(biāo)記的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。【結(jié)果】序列比對(duì)分析表明，谷梅4號(hào)位點(diǎn)中基因起始密碼子上游515 bp處存在一個(gè)特殊的單核苷酸變異。利用已開發(fā)的兩種類型的分子標(biāo)記能夠有效區(qū)分3種不同的基因型，且基因型與穗頸瘟人工接種鑒定結(jié)果完全一致?！窘Y(jié)論】利用分子標(biāo)記T-和K-可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，加快抗稻瘟病水稻新品種的選育進(jìn)程。

稻瘟?。?；特異性標(biāo)記；四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR；競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR

稻瘟病是由子囊菌[(Hebert) Barr.，無性態(tài)]引起的一種重要的真菌性病害，給世界糧食安全造成嚴(yán)重威脅[1-3]。實(shí)踐證明，利用品種抗性是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的途徑。由于稻瘟病菌具有高度的遺傳多樣性和變異性，品種抗性極易喪失，如何選育具有廣譜、持久抗性的水稻品種一直是育種家關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和水稻基因組測(cè)序的完成，已有大量稻瘟病抗性基因被定位和克隆。迄今，至少報(bào)道了69個(gè)位點(diǎn)的100多個(gè)稻瘟病抗性主效基因，其中約45%來源于粳稻，51%來源于秈稻，4%來源于野生稻，并成功分離出30多個(gè)抗性基因[4]。從已克隆的基因來看，多數(shù)基因在染色體上具有成簇分布的特點(diǎn)。其中，、等是位于第6染色體短臂靠著絲粒附近的一個(gè)抗性基因簇，而、、、等則集中在第11染色體長(zhǎng)臂的另一個(gè)基因簇。目前已發(fā)掘的稻瘟病抗性基因雖然較多，但大多存在抗譜窄、抗性不強(qiáng)等缺陷，難以進(jìn)行育種利用[5-9]。

是來源于我國(guó)四川秈稻地方品種谷梅4號(hào)的一個(gè)廣譜、持久抗性基因，它對(duì)不同國(guó)家和地區(qū)收集的30個(gè)強(qiáng)致病菌株中的29個(gè)表現(xiàn)為高抗和免疫[10]。研究表明，位點(diǎn)是一個(gè)包含13個(gè)NBS-LRR類抗病基因的基因簇，其中6為位點(diǎn)的抗病基因()，而8為感病基因()。PigmR自身可以形成同源二聚體，發(fā)揮廣譜抗病功能，但導(dǎo)致千粒重降低；而受表觀遺傳調(diào)控的PigmS蛋白可以與PigmR競(jìng)爭(zhēng)形成異源二聚體抑制PigmR介導(dǎo)的廣譜抗病性，減輕病原菌產(chǎn)生致病性進(jìn)化的選擇壓力，使其具有持久抗性，同時(shí)提高結(jié)實(shí)率，抵消千粒重降低對(duì)產(chǎn)量的影響[11]。由于基因具有廣譜、持久抗性且不影響產(chǎn)量的優(yōu)點(diǎn)，因而在秈稻特別是雜交秈稻抗病改良中得到廣泛應(yīng)用。通過谷梅4號(hào)及其衍生品種選育出的不育系川谷A、中谷A、谷豐A、廣抗13A及其配制的雜交組合在生產(chǎn)中表現(xiàn)出良好的抗性。

傳統(tǒng)稻瘟病抗病育種是在充分發(fā)病的條件下根據(jù)植株癥狀進(jìn)行選擇，這種方式不僅費(fèi)時(shí)耗力而且極易受環(huán)境干擾，準(zhǔn)確性不高。為提高基因的選擇效率，已有研究者開發(fā)出不同類型的分子標(biāo)記來鑒定其抗性基因型，并篩選出一些目標(biāo)基因純合的新材料[6, 12-13]。然而，在實(shí)際應(yīng)用過程中這些標(biāo)記存在親本間多態(tài)性差、準(zhǔn)確性不高、無法有效區(qū)分抗病純合和雜合基因型等缺點(diǎn)，難以滿足育種需求。為進(jìn)一步開發(fā)高效、快捷且具有特異性的共顯性分子標(biāo)記，本研究根據(jù)谷梅4號(hào)Pigm位點(diǎn)存在的特異性核苷酸變異，利用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR(Tetra-primer Amplification Refractory Mutation System PCR，Tetra-primer ARMS-PCR)和競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele- Specific PCR，KASP)兩種不同的基因分型技術(shù)[14-15]，設(shè)計(jì)相關(guān)引物并對(duì)基因型進(jìn)行檢測(cè)，以期為高效選育廣譜、持久稻瘟病抗性品種提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種(系)包括含抗性基因的秈稻地方品種谷梅4號(hào)(四川)，以高感品種麗江新團(tuán)黑谷為輪回親本的4個(gè)近等基因系IRBL9-W()、IRBLz5-CA-1()、IRBLz-Fu()、IRBLzt-T()以及含該位點(diǎn)其他復(fù)等位基因材料IR65482-4-13()、二八占()；秈稻恢復(fù)系材料鎮(zhèn)恢084(江蘇)、93-11(江蘇)、中恢8006(浙江)、成恢727(四川)、宜恢1577(四川)、紅恢589(貴州)、先恢527(湖南)、明恢63(福建)、航1號(hào)(福建)、金恢2號(hào)(廣西)、廣恢998(廣東)；秈稻保持系材料寧香1B(江蘇)、川香29B(四川)、荃93-11B(安徽)、珍汕97B(江西)；秈稻兩系不育系03S(安徽)、Bph68S(湖北)、P88S(湖南)、培矮64S(湖南)；常規(guī)粳稻品種包括日本晴(日本)、越光(日本)、一品(韓國(guó))、珍富10號(hào)(韓國(guó))、楚粳39(云南)、畢粳44(貴州)、寶農(nóng)34(上海)、浙粳97(浙江)、嘉58(浙江)、南粳505(江蘇)、南粳9108(江蘇)、淮稻9號(hào)(江蘇)、豫粳8號(hào)(河南)、臨稻17(山東)、圣稻20(山東)、寧粳40號(hào)(寧夏)、伊粳12號(hào)(新疆)、新稻32號(hào)(新疆)、津稻263(天津)、沈農(nóng)265(遼寧)、遼粳10號(hào)(遼寧)、鹽豐47(遼寧)、吉粳88(吉林)、龍粳29(黑龍江)。其他材料包括以高感穗頸瘟粳稻品種淮稻9號(hào)為母本，谷梅4號(hào)為父本雜交配組的F1植株以及300個(gè)F2單株。50份水稻品種(系)由江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)和利用平臺(tái)提供，并在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物所南京試驗(yàn)田進(jìn)行播種、移栽，按常規(guī)栽培方式進(jìn)行田間管理。

穗頸瘟人工抗性接種鑒定所采用的含ZB3生理小種的菌液由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，孢子濃度約為5×104個(gè)/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1序列對(duì)比、測(cè)序和引物設(shè)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載谷梅4號(hào)位點(diǎn)全長(zhǎng)DNA序列(KU904633)，選擇-基因5′端上游序列和內(nèi)含子序列分別與日本晴、明恢63、珍汕97和93-11基因組序列進(jìn)行在線BLAST分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov, http://rice.hzau.edu. cn)，發(fā)現(xiàn)谷梅4號(hào)中-基因起始密碼子上游515 bp處和其他4個(gè)秈、粳稻品種存在一個(gè)G-C的堿基變異，同時(shí)結(jié)合3K水稻SNP與InDel子數(shù)據(jù)庫(kù)以及設(shè)計(jì)引物對(duì)、、、、、復(fù)等位基因水稻材料測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，確定該變異特異性存在于谷梅4號(hào)位點(diǎn)中。在此基礎(chǔ)上，參照Ye等[14]報(bào)道的在線四引物分析軟件(http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html)設(shè)計(jì)Tetra-primer ARMS-PCR引物，由上海賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司(https://www. thermofisher. com/)合成；同時(shí)利用Oligo 7.57軟件設(shè)計(jì)KASP引物，并綜合考慮引物的Tm(Melting Temperature)值、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體、引物之間的互補(bǔ)情況，交由英國(guó)LGC公司北京辦事處(https://www.lgcgroup.com /cn)合成分別帶羧基熒光素(FAM)和5-六氯熒光素氨基磷酸酯(HEX)的引物。

1.2.2 DNA提取

水稻分蘗盛期，收集不同水稻品種、F1、F2群體的微量新鮮葉片，按CTAB法提取基因組DNA[16]。

1.2.3 四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR檢測(cè)

20 μL PCR體系包括DNA (10 ng/μL) 2.0 μL，四條引物(4 pmol/μL)各0.5 μL，10×緩沖液(含MgCl2)2.0 μL，dNTP (2.5 mmol/L)0.4 μL，(5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 13.1 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95℃下預(yù)變性5 min；95℃下變性30 s，55℃下復(fù)性30 s，72℃下延伸1 min，循環(huán)35次；72℃下延伸7 min，10℃冷卻10 min，將擴(kuò)增產(chǎn)物加溴酚藍(lán)指示劑后備用。反應(yīng)產(chǎn)物用加入DuRed核酸染料3.0%的瓊脂糖凝膠130 V電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記載。

1.2.4 競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR檢測(cè)

KASP基因分型在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI Step One Plus?）上進(jìn)行，并設(shè)置3個(gè)以雙蒸水代替模板DNA的空白對(duì)照。10 μL反應(yīng)體系包括 DNA(10 ng/μL)1.0 μL，熒光引物混合液0.1 μL，2×KASP預(yù)混液5.0 μL，雙蒸水 3.9 μL。反應(yīng)條件如下：94℃下激活15 min；94℃下變性20 s，61℃~55℃下退火60 s(每一個(gè)循環(huán)降低0.6℃)，10個(gè)循環(huán)；94℃下變性20 s，55℃下退火60 s，26個(gè)循環(huán)，數(shù)據(jù)分析在PCR儀自帶的Step One Software 2.2.2軟件上進(jìn)行。

1.2.5 淮稻9號(hào)/谷梅4號(hào)F2群體單株的穗頸瘟抗性鑒定與評(píng)價(jià)

在水稻孕穗破口前5 d，對(duì)淮稻9號(hào)/谷梅4號(hào)F2群體的單株進(jìn)行注射接種，每株注射3個(gè)稻穗，每穗接種1 mL菌液。接種選擇在當(dāng)天下午3：00后，以避免菌液的蒸發(fā)，影響接種效果。穗頸瘟發(fā)病調(diào)查的損失率為3個(gè)穗子損失率的平均值，病情分級(jí)參照NY/T 2646–2014進(jìn)行[17]。其中，0級(jí)(高抗，HR)：無??；1級(jí)(抗，R)：小枝梗發(fā)病，穗平均損失率≤5%；3級(jí)(中抗，MR)：主軸或穗頸發(fā)病，5%＜穗平均損失率≤20%；5級(jí)(中感，MS)：主軸或穗頸發(fā)病，谷粒半癟，20%＜穗平均損失率≤50%；7級(jí)(感，S)：穗頸發(fā)病，大部分癟谷，50%＜穗平均損失率≤70%；9級(jí)(高感，HS)：穗頸發(fā)病，穗平均損失率>70%，其中0、1、3 級(jí)記為抗病，5、7、9級(jí)記為感病。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷梅4號(hào)Pigm位點(diǎn)中特異SNP變異的發(fā)掘和引物設(shè)計(jì)

谷梅4號(hào)位點(diǎn)基因組序列全長(zhǎng)178 704 bp，由13個(gè)NBS-LRR類抗病基因(-~-)和大量轉(zhuǎn)座元件(1個(gè)Ty3/gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、13個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列和33個(gè)DNA轉(zhuǎn)座子)組成[11]。由于位點(diǎn)中-廣泛存在該座位的其他復(fù)等位基因內(nèi)，具有高度的保守性，同時(shí)考慮到-與-、-的編碼序列(Coding Sequence，CDS)同源性較高，因此選擇-基因5′端上游序列和內(nèi)含子序列與測(cè)序粳稻品種日本晴的基因組序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明，谷梅4號(hào)和日本晴在相關(guān)區(qū)域存在多個(gè)SNP變異。選擇這些SNP位點(diǎn)上下游各200 bp的序列，利用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的明恢63、珍汕97和93-11基因組序列進(jìn)行再次比對(duì)，發(fā)現(xiàn)谷梅4號(hào)中-基因起始密碼子上游515 bp處的堿基G在4個(gè)測(cè)序品種中均為C。為確定該堿基變異的是否具有廣泛的特異性，在3K水稻SNP與InDel子數(shù)據(jù)庫(kù)(RFGB，http:// rmbreeding.cn/Jbrowse)中對(duì)2859份水稻相關(guān)位點(diǎn)的序列進(jìn)行檢索，沒有發(fā)現(xiàn)該堿基為G的品種。由于與已克隆的、等均為同一位點(diǎn)的復(fù)等位基因，為有效區(qū)分同座位的其他基因，我們?cè)O(shè)計(jì)一對(duì)引物對(duì)含、、、、、基因水稻材料的相關(guān)序列進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，該單核苷酸G的變異確實(shí)僅存在于谷梅4號(hào)的中(圖1)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)出Tetra-primer ARMS-PCR和KASP分子標(biāo)記T-和K-(表1)。

數(shù)字表示堿基在水稻基因組中的物理位置；斜體堿基表示有差異的核酸變異；灰色堿基表示起始密碼子上游515 bp處存在的特異單核苷酸變異。

Fig. 1. Sequence alignment of Gumei 4, sequencing varieties and other varieties(lines) carrying,,,,,.

2.2 T-Pigm標(biāo)記對(duì)不同品種(系)及F2群體Pigm基因型的檢測(cè)

利用T-標(biāo)記對(duì)50份秈、粳稻品種(系)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從圖2可以看出由正向外引物-O-F和反向外引物-O-R擴(kuò)增起陽(yáng)性對(duì)照作用的684 bp條帶在每個(gè)品種(系)中都出現(xiàn)，這說明所有樣品的DNA都能進(jìn)行有效擴(kuò)增。除該條帶外，所有材料中只有谷梅4號(hào)能檢測(cè)出一條295 bp的條帶，它是由正向內(nèi)引物T--I-F和反向外引物T--O-R擴(kuò)增產(chǎn)生的，其特異擴(kuò)增-基因起始密碼子上游515 bp核苷酸為G的等位位點(diǎn)，為純合的基因型；而其他49份包括含、、、、、基因的水稻材料，除684 bp的條帶外，則只能擴(kuò)增出一條444 bp的條帶。它是由正向外引物T--O-F和反向內(nèi)引物T--I-R擴(kuò)增產(chǎn)生，其特異擴(kuò)增核苷酸為C的等位位點(diǎn)，為純合的基因型。為驗(yàn)證T-標(biāo)記對(duì)雜合基因型的檢測(cè)效果，對(duì)淮稻9號(hào)/谷梅4號(hào)F2群體300個(gè)單株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其電泳產(chǎn)物出現(xiàn)三種類型的條帶，其對(duì)應(yīng)的基因型、、比例為1∶2∶1，符合1對(duì)基因的分離規(guī)律(χ2=4.08<χ20.05,2，0.10<<0.25)(圖3)。

表1 檢測(cè)水稻Pigm基因特異SNP變異的測(cè)序引物和相關(guān)標(biāo)記

M－DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1－谷梅4號(hào)；2－IRBL9-W(Pi9)；3－IRBLz5-CA-1(Pi2)；4－IRBLz-Fu(Piz)；5－IRBLzt-T(Piz-t)；6－IR65482-4-13(Pi40)；7－二八占(Pi50)；8－24－部分秈、粳稻品種(系)依次為93-11、中恢8006、成恢727、紅恢589、先恢527、明恢63、廣恢998、川香29B、珍汕97B、培矮64S、日本晴、嘉58、淮稻9號(hào)、南粳9108、鹽豐47、吉粳88、龍粳29。

Fig. 2. Electrophoresis detection ofgenotypes by T-marker in different rice varieties or lines.

M－DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1－谷梅4號(hào)；2－淮稻9號(hào)；3－淮稻9號(hào)/谷梅4號(hào) F1；4－24為部分F2分離單株。

Fig. 3. Electrophoresis detection ofgenotypes by Tmarker in F2population derived from Huaidao 9/Gumei 4.

2.3 K-Pigm標(biāo)記對(duì)不同品種(系)及F2群體Pigm基因型的檢測(cè)

為了進(jìn)一步提高對(duì)大量分離群體單株的篩選效率，我們根據(jù)谷梅4號(hào)存在的特異單核苷酸變異，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的KASP標(biāo)記，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)樣品DNA進(jìn)行分析。通過對(duì)50份秈、粳稻新品種(系)以及F2群體基因型的鑒定，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記可以有效區(qū)分上述不同材料的基因型。在此基礎(chǔ)上，與T-標(biāo)記已鑒定的基因型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果完全一致(圖4和圖5)。

黑色方框代表無DNA模板的空白對(duì)照；藍(lán)色和紅色圓點(diǎn)分別代表純合基因型(堿基G的等位變異)和純合基因型(堿基C的等位變異)。

供試品種(系)分別為谷梅4號(hào)、IRBL9-W()、IRBLz5-CA-1 ()、IRBLz-Fu()、IRBLzt-T()、IR65482-4-13()、二八占()、鎮(zhèn)恢084、93-11、中恢8006、成恢727、宜恢1577、紅恢589、先恢527、明恢63、航1號(hào)、金恢2號(hào)、廣恢998、寧香1B、川香29B、荃93-11B、珍汕97B、03S、Bph68S、P88S、培矮64S、日本晴、越光、一品、珍富10號(hào)、楚粳39、畢粳44、寶農(nóng)34、浙粳97、嘉58、南粳505、南粳9108、淮稻9號(hào)、豫粳8號(hào)、臨稻17、圣稻20、寧粳40號(hào)、伊粳12號(hào)、新稻32號(hào)、津粳263、沈農(nóng)265、遼粳10號(hào)、鹽豐47、吉粳88和龍粳29。

Black boxes indicate the negative controls with no DNA template; Blue and red dots showedhomozygous genotype (allelic variation G) andhomozygous genotype (allelic variation C), respectively.

The DNA of the tested varieties (lines) are Gumei 4, IRBL9-W(), IRBLz5-CA-1, IRBLz-Fu (), IRBLzt-T (), IR65482-4-13(), Erbazhan(), Zhenhui 084, 93-11, Zhonghui 8006, Chenghui 727, Yihui 1577, Honghui 589, Xianhui 527, Minghui 63, Hang 1, Jinghui 2, Guanghui 998, Ningxiang 1B, Chuanxiang 29B, Quan 93-11B, Zhenshan 97B, 03S, Bph68S, P88S, Peiai 64S, Nippobare, Koshihikari, Yipin, Zhenfu 10, Chujing 39, Bijing 44, Baonong 34, Zhejing 97, Jia 58, Nanjing 505, Nanjing 9108, Huaidao 9, Yujing 8, Lindao 17, Shengdao 20, Ningjing 40, Yijing 12, Xindao 32, Jinjing 263, Shennong 265, Liaojing10, Yanfeng 47, Jijing 88 and Longjing 29, respectively.

圖4 K-標(biāo)記對(duì)不同水稻品種(系)基因型的檢測(cè)

Fig. 4. Detection of Pigm genotypes by K-marker in different rice varieties or lines.

黑色方框代表無DNA模板的空白對(duì)照；藍(lán)色、綠色和紅色圓點(diǎn)分別代表PigmPigm純合基因型(堿基G的等位變異), Pigmpigm雜合基因型(同時(shí)具有堿基G/C的等位變異)和pigm pigm純合基因型(堿基C的等位變異)。

Fig. 5. Detection ofgenotypes by K-marker in F2population derived from Huaidao 9 and Gumei 4.

2.4 淮稻9號(hào)/谷梅4號(hào)F2群體不同Pigm基因型單株與穗頸瘟抗性的關(guān)系

為探究不同基因型與穗頸瘟抗性之間的關(guān)系，2017年采用人工接種的方法對(duì)感病品種淮稻9號(hào)、抗病品種谷梅4號(hào)、F1植株及F2群體的單株進(jìn)行穗頸瘟抗性鑒定?；吹?號(hào)、谷梅4號(hào)及其F1的穗損失率為82.65%、6.82%和7.65%，對(duì)應(yīng)的病情等級(jí)分別為高感、抗、抗。通過對(duì)F2群體300個(gè)單株病情等級(jí)的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記鑒定出的基因型為的228個(gè)單株全部表現(xiàn)為高抗、抗和中抗水平，而基因型為的72個(gè)單株中只有67個(gè)表現(xiàn)為中感、感和高感，而有5個(gè)單株則表現(xiàn)出抗和中抗(表2)。為排除由于接種不當(dāng)造成的誤判，繼續(xù)收集上述5個(gè)單株的種子，2018年種成株系繼續(xù)進(jìn)行接種鑒定，每個(gè)株系連續(xù)接種5株，每株3穗，并統(tǒng)計(jì)病情等級(jí)，結(jié)果5個(gè)單株有4個(gè)表現(xiàn)為中感，1個(gè)表現(xiàn)為感。這說明開發(fā)出兩個(gè)分子標(biāo)記能準(zhǔn)確地對(duì)基因型進(jìn)行鑒定。

3 討論

品種稻瘟病抗性弱、抗譜窄，抗性不持久，一直是江蘇水稻特別是粳稻育種難以攻克的難題。已有研究表明，目前江蘇常規(guī)粳稻中已利用的抗性基因主要有、、、、、、[18-19]。這些基因廣泛分布在現(xiàn)有栽培粳稻品種中，易于雜交聚合育成抗病新品種。然而，長(zhǎng)期使用上述基因，容易出現(xiàn)抗性減弱或喪失的問題，如廣譜抗性基因的抗性近年來就有明顯減弱的趨勢(shì)[20]。因此，在抗稻瘟病育種中必須引入和利用新的廣譜抗性基因。

表2 淮稻9號(hào)/谷梅4號(hào)F2群體中三種Pigm基因型單株對(duì)穗頸瘟的抗性表現(xiàn)

、、、、是位于水稻第6染色體同一座位的復(fù)等位基因，它們雖然存在一定的抗譜差異，但對(duì)不同地區(qū)來源的絕大多數(shù)稻瘟病菌都具有良好的抗性。基因結(jié)構(gòu)和功能解析證實(shí)這些基因是由不同數(shù)目的NBS-LRR元件串聯(lián)排列而成。其中，、有9個(gè)NBS-LRR元件，起主要作用，其編碼產(chǎn)物僅在3個(gè)LRRs區(qū)域有8個(gè)氨基酸的差異；有6個(gè)NBS-LRR元件，與抗性直接相關(guān)；有12個(gè)NBS-LRR元件，只有具有主要的抗性功能；而則含有13個(gè)NBS-LRR元件，且受與共同作用來維持水稻抗性與產(chǎn)量的平衡[21-23, 11]。這些同源抗病基因通過多個(gè)串聯(lián)重復(fù)形成基因堆疊也是水稻抗病基因演化的一個(gè)重要途徑[24]。已有研究表明，對(duì)不同粳稻地區(qū)的優(yōu)勢(shì)稻瘟病菌具有良好的抗性，特別是對(duì)強(qiáng)毒力的南方小種[13, 25-27]。不僅如此，該基因還可以與其他抗稻瘟病基因“兼容”，即使在不同親本背景條件下，也能有效提升對(duì)稻瘟病的抗性等級(jí)[28-29]。這為進(jìn)一步在粳稻中利用這一抗性基因，培育具有廣譜、持久抗性的優(yōu)良品種提供了理論依據(jù)。然而，從利用成效來看，目前并沒有育成相關(guān)抗病粳稻品種在生產(chǎn)上推廣。分析其主要原因可能是基因來源于特定的秈稻地方品種，抗源本身農(nóng)藝性狀不理想，與粳稻雜交親和性差、后代分離大導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)很難選育出兼具抗病、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)于一體的商業(yè)化品種。因此，在粳稻中對(duì)基因進(jìn)行有效利用，尤其需要借助分子標(biāo)記輔助選擇這一高效、快捷、準(zhǔn)確的技術(shù)手段。

隨著基因研究的深入和標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為尋找基因內(nèi)部或鄰近區(qū)域差異序列從而開發(fā)實(shí)用性分子標(biāo)記提供了可能。本研究通過對(duì)位點(diǎn)基因組序列的相關(guān)位點(diǎn)的測(cè)序以及比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)谷梅4號(hào)中-基因起始密碼子上游515 bp處的一個(gè)堿基G與已測(cè)序的秈、粳稻品種以及其他復(fù)等位基因、、、、、材料不同，進(jìn)而開發(fā)出Tetra-primer ARMS-PCR和KASP標(biāo)記。至于谷梅4號(hào)如何在-上游區(qū)域形成這一特異的單核苷酸變異，還有待進(jìn)一步研究。由于位點(diǎn)直接與抗病有關(guān)的基因是和，從嚴(yán)格意思上講本研究中涉及的分子標(biāo)記并不是根據(jù)這兩個(gè)基因的差異序列開發(fā)的功能標(biāo)記，其與、之間仍有45.6和79.1 kb的物理距離，但一般種植規(guī)模的遺傳群體很難打破這種連鎖而發(fā)生交換。因此，這些標(biāo)記對(duì)基因型的鑒定具有非常高的準(zhǔn)確性。

從實(shí)際應(yīng)用效果來看，兩種類型的分子標(biāo)記各具優(yōu)勢(shì)。盡管KASP標(biāo)記分型過程中需要使用熒光定量PCR儀或帶熒光模塊的酶標(biāo)儀，對(duì)引物、技術(shù)、設(shè)備的要求相對(duì)較高，但節(jié)省了后續(xù)電泳檢測(cè)的時(shí)間，在設(shè)施條件完備的科研機(jī)構(gòu)適合對(duì)大量群體單株的檢測(cè)；而Tetra-primer ARMS-PCR標(biāo)記檢測(cè)僅需簡(jiǎn)單的一步PCR擴(kuò)增和瓊脂糖電泳，具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)。因此，更符合基層育種單位的實(shí)際需求。

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Development and Verification of Specific Molecular Markers forGeneAssociated with Broad-spectrum Resistance to Rice Blast

CHEN Tao1, 2, SUN Xuchao1, ZHANG Shanlei1, LIANG Wenhua1, ZHOU Lihui1, ZHAO Qingyong1, YAO Shu1, ZHAO Ling1, ZHAO Chunfang1, ZHU Zhen1, ZHANG Yadong1, WANG Cailin1,*

(1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu High Quality Rice R&D Center / Nanjing Branch of China National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, China;2Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;?Corresponding author, E-mail: clwang@jaas.ac.cn)

【Objective】from anrice variety Gumei 4, is one of the most important genes with broad-spectrum and durable resistance to rice blast. It is very necessary to improve its selection efficiency by developing specific and co-dominant markers in breeding. 【Method】The molecular markersT-and K-were developing with Tetra-primer ARMS-PCR and KASP technique, based on the specific nucleotide mutation inlocus. Then, the consistency of the genotype and phenotype was evaluated in different varieties and the F2population derived from Huaidao 9/ Gumei 4 by artificial inoculation methods of panicle blast.【Result】The sequence alignment analysis indicated that a specific SNP was at -515 bp of thegene initiation codon in Gumei 4. The three different genotypes oflocus could be distinguished by the Tetra-primer ARMS-PCR and KASP markers, which exactly conformed to the results of artificial inoculation.【Conclusion】 T-and K-markers could be used to detect the genotype ofgene rapidly and accurately, and improved the selection efficiency of blast resistant rice varieties in breeding.

rice blast;; specific marker; tetra-primer ARMS-PCR; competitive allele-specific PCR

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2020)01-0028-09

10.16819/j.1001-7216.2020.9082

2019-07-12;

2019-11-20。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)(2017YFD0100305)；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(BE2018357)；江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目(PZCZ201703)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(CARS-01-62)；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所科研基金資助項(xiàng)目(LZS17-7)。