王 璞 韋麗賓 倪廣曉 廉云敏 高 嵐

牙周組織缺損為臨床常見口腔疾病，該病治療中牙周組織工程發(fā)揮重要作用，治療關鍵為選擇恰當種子細胞。牙周膜干細胞（PDLSCs）是一種多能干細胞，有自我更新、多向分化潛能，可在不同誘導條件下向軟骨細胞、骨細胞等分化，為牙周組織缺損修復理想材料[1]。頜骨骨髓間充質(zhì)干細胞（JBMMSCs）具有多向分化、增殖潛能，且可調(diào)節(jié)免疫力，免疫排斥反應小，在牙周組織再生修復發(fā)揮重要作用[2，3]。近年來，臨床開始越來越多地關注來源于炎癥組織的細胞，為PDLSCs、JBMMSCs 取材探尋新途徑。自噬屬于機體內(nèi)維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的自我保護機制，可實現(xiàn)細胞自身代謝需求及部分細胞器更新需要，且與細胞凋亡密切相關[4]。本研究重點探討腫瘤壞死因子-α（TNF-α）對PDLSCs、JBMMSCs 自噬水平的影響，報道如下。

資料和方法

一、一般資料

Sigma 公司提供的Ⅰ型膠原酶、Olympus 公司提供的一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒、Applied Biosystem 公司提供的RT-PCR 儀、Gibco公司提供的α-MEM 培養(yǎng)基、杭州四季青生物工程材料有限公司的胎牛血清、Abcam 公司提供的鼠抗P62、Santa Cruz Biotechnology 公司提供的兔抗LC3、Qiagen公司提供的DNA 提取試劑盒、Eppendorf 公司提供的紫外線分光光度儀、Beckman Coulte 公司提供的流式細胞儀、BIO-TEK 公司提供的酶聯(lián)免疫檢測儀等。

二、研究方法

1.人JBMMSCs 分離、純化、培養(yǎng)：收集本院15例埋伏阻生智齒拔除患者（12～18 歲）需去除骨阻力時獲得的頜骨骨碎片，且患者知情同意，置于預冷α-MEM 培養(yǎng)液。PBS 液內(nèi)漂洗骨碎片，2～3 次。骨髓腔以PBS 液沖洗，持續(xù)3 次。收集吹出的骨髓基質(zhì)細胞、骨碎片。3000r/min 離心，持續(xù)15min，得細胞沉淀、骨碎片。細胞沉淀以α-MEM 培養(yǎng)基（含10%FBS）均勻吹散，連同骨碎片接種到6 孔培養(yǎng)板，靜置培養(yǎng)。細胞鋪滿6 孔板80%，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代，標記（第一代）。以有限稀釋法對細胞進行克隆分離、純化細胞，擴增至1×107數(shù)量級。

2.人PDLSCs 分離、純化、培養(yǎng)：收集本院15 例行正畸治療患者（12～18 歲）拔除的健康第一前磨牙，且患者知情同意。取材后置于預冷α-MEM 培養(yǎng)液。牙齒以PBS 液反復沖洗，刮取根中1/3 區(qū)域牙周膜組織，修剪為組織塊（大小1mm3）。3000r/min 離心，15min。棄上清液，避光，以1mLⅠ型膠原酶滴入，37℃孵箱消化，15min。3000r/min 離心，15min。于6孔板上平鋪組織塊，覆蓋以無菌蓋玻片，以1-2mLα-MEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）滴入。觀察細胞鋪滿6 孔板底約80%，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代，標記（第一代）。以有限稀釋法對細胞進行克隆分離、純化細胞，擴增至1×107數(shù)量級。

3.細胞凋亡檢測：收集生長良好的第三代人JBMMSCs、PDLSCs，接種于6 孔板（2×105個/孔），分別以0、20、50、100ng/mL TNF-α 作用于細胞，持續(xù)3d。收取各組細胞，以PBS 液沖洗2 次。1000r/min離心，5min，棄上清液。以PBS 液（含3% FBS）重懸細胞，吹勻，制作單細胞懸液，確保各Ep 管內(nèi)細胞數(shù)量＞5×105個。凋亡情況以流式細胞儀檢測。

4.收取不同濃度TNF-α 作用3d 的細胞，以TRIzol 一步法提取總RNA，實施完整性檢測，RNA濃度以酶標儀檢測，并合成cDNA。于CFX96TM實時定量PCR 儀中擴增、檢測。Western blot 檢測時，收取不同濃度TNF-α 作用3d 的細胞，預冷PBS 液清洗，持續(xù)3 次，棄PBS。各孔加入200μL 細胞裂解液PIPA（含1mmol/L 蛋白酶抑制劑PMSF），吹勻，提取細胞總蛋白，蛋白濃度以G250 法檢測?；旌系鞍讟颖?、上樣緩沖液，置于100℃水中，持續(xù)5min，置于-80℃冰箱內(nèi)備用。制備SDS-PAGE 膠，取出，轉(zhuǎn)膜，冰浴，200mA 恒流轉(zhuǎn)膜，持續(xù)2h。蛋白樣本轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。PVDF 膜置于5% BSA 中，室溫下封閉，持續(xù)2h。一抗滴入，4℃下過夜，次日復溫1h，TBST 洗膜，10min/次，共3 次。等量混合SuperSignal West Pico 發(fā)光液A 液、B 液，滴在PVDF 膜目的條帶處，凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。

三、觀察指標

觀察TNF-α 不同濃度對細胞凋亡的影響；觀察TNF-α 作用后細胞自噬、凋亡的短期、長期變化。

四、統(tǒng)計學分析

以SPSS20.0 軟件分析。連續(xù)變量進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，以t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

不同濃度TNF-α 作用3d 時，JBMMSCs、PDLSCs 在20、50ng/mL TNF-α 下幾乎不發(fā)生凋亡，與0ng/mL 時差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；JBMMSCs、PDLSCs 在100ng/mL TNF-α 下細胞凋亡增加，高于20、50ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

圖1 TNF-α 作用1d 后細胞自噬、凋亡變化。其中A’、A 分別為PDLSCs 的對照組與TNF-α 實驗組；B’、B 分別為JBMMSCs 的對照組與TNF-α 實驗組

圖2 TNF-α 作用7d 后細胞自噬、凋亡變化。其中A’、A 分別為PDLSCs 的對照組與TNF-α 實驗組；B’ 、B 分別為JBMMSCs 的對照組與TNF-α 實驗組

JBMMSCs、PDLSCs 經(jīng)TNF-α 作用1d 后，自噬相關基因LC3 表達升高，泛素化蛋白P62 表達降低，凋亡相關蛋白Bcl-2 表達升高，如圖1。JBMMSCs、PDLSCs 經(jīng)TNF-α 作用7d 后，自噬相關基因LC3 表達降低，泛素化蛋白P62 表達升高，凋亡相關蛋白Bcl-2 表達下降，如圖2。

表1 TNF-α 不同濃度下JBMMSCs、PDLSCs 目的基因相對表達量（±s）

表1 TNF-α 不同濃度下JBMMSCs、PDLSCs 目的基因相對表達量（±s）

TNF-α 濃度0ng/mL 20ng/mL 50ng/mL 100ng/mL F P JBMMSCs 1.01±0.02 1.02±0.04 1.02±0.03 1.49±0.11 226.952 0.000 PDLSCs 1.01±0.01 1.02±0.02 1.02±0.02 1.48±0.12 208.816 0.000

討論

牙周組織缺損在臨床上較為常見，屬于多發(fā)口腔炎癥性疾病，其治療核心為修復牙周缺損骨質(zhì)[5]。干細胞增殖、分化在牙周組織缺損修復中發(fā)揮重要作用，特別是JBMMSCs、PDLSCs，在這一過程中扮演重要角色[6，7]。JBMMSCs、PDLSCs 具有取材方便、損傷小、無免疫排斥反應等特點，為優(yōu)秀的組織工程種子細胞，可有效修復缺損關節(jié)軟骨[8]。近年來，研究報道微炎癥環(huán)境可抑制JBMMSCs 再生能力，影響干細胞移植效果，但其具體調(diào)控機制仍不完全清楚[9]。TNF-α 為常見炎性因子，其水平變化與炎癥程度呈正相關[10]。動物學實驗發(fā)現(xiàn)，10～1000ng/mL TNF-α 可促進大鼠BMSCs 增殖,且隨TNF-α 濃度增加，大鼠BMSCs 分泌促炎因子IL-6 能力降低，分泌抑炎因子IL-10 的能力升高[11]。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)微炎癥環(huán)境可誘導PDLSCs 自噬，經(jīng)由調(diào)控細胞自噬水平，增強對疾病的治療效果[12]。

本研究自表1 可以看出，TNF-α 作用3d 時，JBMMSCs、PDLSCs 在20ng/mL、50ng/mL TNF-α 下幾乎不發(fā)生凋亡，而TNF-α 濃度增加至100ng/mL時，JBMMSCs、PDLSCs 細胞凋亡明顯增加，且較20、50ng/mL 差異顯著。這說明TNF-α 濃度增加至100ng/mL，可提升細胞凋亡發(fā)生風險，100ng/mL 考慮可作為TNF-α 短時間內(nèi)不使細胞出現(xiàn)凋亡的最大濃度應用于臨床。本研究中，自圖1、圖2 可以發(fā)現(xiàn)，JBMMSCs、PDLSCs 經(jīng)TNF-α 作用1d 后，自噬相關基因LC3 表達升高，泛素化蛋白P62 表達降低，凋亡相關蛋白Bcl-2 表達升高，說明TNF-α 短期作用可激活JBMMSCs、PDLSCs 自噬，降低細胞凋亡水平。而TNF-α 作用7d 后，JBMMSCs、PDLSCs自噬相關基因LC3 表達降低，泛素化蛋白P62 表達升高，凋亡相關蛋白Bcl-2 表達下降，說明TNF-α長期作用可導致JBMMSCs、PDLSCs 長期處于炎性微環(huán)境中，使得細胞自噬現(xiàn)象逐漸消失，誘導細胞凋亡。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，JBMMSCs、PDLSCs 自噬、凋亡呈負相關，隨著自噬水平提升，其細胞凋亡下降，而自噬水平降低，細胞凋亡增高。這說明臨床采取積極措施激活JBMMSCs、PDLSCs 自噬水平，可有效預防細胞凋亡，使得JBMMSCs、PDLSCs 更好發(fā)揮功能。