何新澤，田 沖，李 芹,楊 濤，林書卿,于立志，王成剛，孫金占，王 培

(1. 濱州市中心醫(yī)院，山東 濱州 251700;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手足外科，河北 承德 067000)

顱腦損傷是現(xiàn)代社會飛速發(fā)展的副產(chǎn)物，同時合并周圍神經(jīng)損傷的患者臨床工作中并不罕見。神經(jīng)損傷后的病理生理變化復(fù)雜、神經(jīng)損傷后的恢復(fù)受多種因素的影響，恢復(fù)不全，致殘率較高[1]。何新澤等研究發(fā)現(xiàn)，實驗大鼠在顱腦損傷后損傷的坐骨神經(jīng)修復(fù)速度加快，但修復(fù)機制尚不清楚[2]；查閱大量研究文獻發(fā)現(xiàn)應(yīng)用FK506后損傷的周圍神經(jīng)修復(fù)明顯優(yōu)于對照組[3]。FK506促進神經(jīng)修復(fù)的主要機制是通過免疫抑制作用、神經(jīng)營養(yǎng)作用[4-10]。本實驗擬通過借鑒FK506促進神經(jīng)損傷恢復(fù)機制，對比實驗結(jié)果，推測顱腦損傷促進神經(jīng)損傷恢復(fù)可能的機制，指導(dǎo)進一步的深入研究。

1 材料和方法

1.1造模動物及材料：實驗在2018年11月～2019年4月在濱州市中心醫(yī)院完成。

實驗動物：選用SPF級雄性SD大鼠160只，200～220 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK (京) 2012-0001]。飼養(yǎng)在晝夜各12 h節(jié)律下，實驗室溫度維持在(23±1)℃。將大鼠完全隨機分為四組，每組40只。實驗經(jīng)過濱州市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，按照國際動物實驗標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

主要設(shè)備及試劑：手術(shù)顯微鏡(LZL-6A型，鎮(zhèn)江中天公司)，光學(xué)顯微鏡(BH-3型，Olympus公司)，電子分析天平(ESJ200-4 ±0.0001g)，F(xiàn)K506(Tacrolimus)100 mg(Selleck)，頭孢唑啉納(魯抗制藥，國藥準(zhǔn)字H19993050)、BL-420F系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、熒光金(Sigma)，冰凍切片機(Leica819)。

1.2造模步驟

1.2.1造模術(shù)前準(zhǔn)備：禁食水4 h，術(shù)前30 min，肌內(nèi)注射頭孢唑啉鈉10 mg/100 g預(yù)防感染，手術(shù)區(qū)域約2 cm2備皮剪毛。麻醉：10%水合氯醛按照0.35 ml/100 g進行腹腔全身麻醉；手術(shù)步驟：實驗組(A1組、A2組)(顱腦損傷+坐骨神經(jīng)損傷)：消毒，沿頭部正中矢狀切開，在顱骨冠狀線后1.5 mm、中線偏左5 mm處開直徑5 mm骨窗，撞擊造成中度腦損傷；右側(cè)臀部，顯微鏡下完全切斷坐骨神經(jīng)，9-0無損傷線縫合坐骨神經(jīng)外膜4～6針[11-12]。對照組(B1組、B2組) (坐骨神經(jīng)損傷)：SD大鼠僅于顯微鏡下完全切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)，縫合坐骨神經(jīng)外膜。

1.2.2造模后的干預(yù)：分籠飼養(yǎng)在同樣環(huán)境中。FK506用0.9% NaCl溶液稀釋，1 ml 0.9% NaCl溶液+1 mg FK506，現(xiàn)用現(xiàn)配制，4℃恒溫保存；造模手術(shù)12 h后，A1組SD大鼠給予FK506按1 mg/200 mg腹腔注射，A2組給予生理鹽水按1 ml/200 mg腹腔注射，B1組大鼠給予FK506按1 mg/200 mg腹腔注射，B2組大鼠給予生理鹽水按1 ml/200 mg腹腔注射。每天應(yīng)用1次，連續(xù)2周。SD大鼠均存活。

1.3主要觀察指標(biāo)

1.3.1坐骨神經(jīng)指數(shù)(sciatic nerve function index，SFI)的測量：分別于造模后4周、8周、12周，每組每次隨機取10只大鼠。根據(jù)Schiaveto de Souza A的方法[8]，實驗側(cè)足3個參數(shù)分別為：實驗側(cè)足印長度(SPL)、實驗側(cè)足趾寬度(STS)、實驗側(cè)中間足趾距離(SIT)；正常側(cè)足3個參數(shù)分別為正常側(cè)足印長度(ZPL)、正常側(cè)足趾寬度(ZTS)、正常側(cè)中間足趾距離(ZIT)。

1.3.2動作電位幅值恢復(fù)率：分別于造模術(shù)后8周、12周，每組每次隨機取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉后，暴露坐骨神經(jīng)，取神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)端0.5 cm放置刺激電極1，近端放置刺激電極2，誘導(dǎo)電極、記錄電極放在近神經(jīng)根部，將記錄到的電信號直接輸入BL-420F系統(tǒng)中記錄神經(jīng)干的動作電位幅值恢復(fù)率，以評價神經(jīng)再生情況。

1.3.3熒光金示蹤：分別于造模術(shù)后12周，于坐骨神經(jīng)斷端以遠(yuǎn)0.5 cm處，注入4%的熒光金溶液5 μl，2 min后緩慢退針。術(shù)后7 d，深麻醉下開胸，左心室置入灌注針至升主動脈，剪開右心耳，灌流固定，取坐骨神經(jīng)相應(yīng)脊髓節(jié)段，冰凍切片機切片脊髓橫斷面20 μm。熒光顯微鏡下觀察脊髓前角熒光金陽性運動神經(jīng)元數(shù)目。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料間接化法計算率，進行統(tǒng)計分析，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1造模后大鼠基本生活狀態(tài)的觀察：造模后所有動物均存活，未發(fā)現(xiàn)切口感染情況。造模手術(shù)后5 d B2組SD大鼠出現(xiàn)足部紅腫明顯，其他組紅腫較輕。3周后，A2組、B1組、B2組SD大鼠足跟出現(xiàn)程度不同的潰瘍面，A1組SD大鼠足部未見明顯潰瘍；12周時，各組SD大鼠足部潰瘍基本痊愈，B2組SD大鼠出現(xiàn)足部的自食現(xiàn)象。

2.2大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)：暗箱測試結(jié)果顯示，造模后第4周，A1組與A2組、B1組與B2組SD大鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，A1組SFI優(yōu)于B1組、B2組，A2組SFI優(yōu)于B1組、B2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；第4周后大鼠SFI逐漸降低，第8、12周時，A2組與B1組大鼠SFI接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，A1組SFI優(yōu)于A2組、B1組、B2組大鼠，A2組SFI優(yōu)于B2組，B1組SFI優(yōu)于B2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 腦損傷、FK506對周圍神經(jīng)損傷大鼠SFI的影響

2.3腦損傷、FK506對周圍神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)干動作電位幅值恢復(fù)率的影響：實驗在屏蔽櫥內(nèi)進行，室溫保持在(25±0.5)℃之間，實驗條件：刺激強度1.2 mV、波寬0.05 ms。動作電位幅值恢復(fù)率：將刺激電極1記錄的動作電位幅值作分子，刺激電2記錄的動作電位幅值作分母，將兩者的比值轉(zhuǎn)化為百分率。造模后第8周，各組大鼠坐骨神經(jīng)干的動作電位幅值恢復(fù)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，A1組優(yōu)于A2組、B1組、B2組，A2組優(yōu)于B1組、B2組，B1組優(yōu)于B2組；第12周時，A2組與B1組大鼠坐骨神經(jīng)干的動作電位幅值恢復(fù)率接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，A1組優(yōu)于A2組、B1組、B2組，A2組優(yōu)于B2組，B1組優(yōu)于B2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 腦損傷、FK506對周圍神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)干動作電位幅值恢復(fù)率的影響

2.4熒光金示蹤標(biāo)記：光鏡下，觀察各組相應(yīng)脊髓節(jié)段前角神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中熒光顆粒。每高倍視野下進行計數(shù)，統(tǒng)計分析結(jié)果；造模后第12周，各組脊髓神經(jīng)元胞漿熒光金標(biāo)記陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，A2組與B1組大鼠脊髓神經(jīng)元胞漿HRP標(biāo)記陽性率接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，A1組高于A2組、B1組、B2組，A2組高于B2組，B1組高于B2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。第12周時，A2組HRP標(biāo)記脊髓前角陽性率(77.24±1.52)%與B1組大鼠脊髓神經(jīng)元胞漿熒光金標(biāo)記陽性率(78.60±2.23)%接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，A1組熒光金標(biāo)記脊髓前角陽性率(82.37±1.33)%高于A2組(77.24±1.52)%、B1組(78.60±2.23)%、B2組(42.63±2.12)%，A2組熒光金標(biāo)記脊髓前角陽性率高于B2組(42.63±2.12)%，B1組熒光金標(biāo)記陽性率(78.60±2.23)%高于B2組(42.63±2.12)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

何新澤等動物實驗發(fā)現(xiàn)大鼠腦損傷后損傷的坐骨神經(jīng)的修復(fù)重建有明顯促進作用，但具體修復(fù)機制尚不清楚[13-15]。本文通過動物實驗比較顱腦損傷聯(lián)合應(yīng)用FK506的坐骨神經(jīng)損傷大鼠損傷后的坐骨神經(jīng)損傷恢復(fù)的情況。在所有的實驗觀測項目中，顱腦損傷聯(lián)合FK506組(A1組)的坐骨神經(jīng)修復(fù)效果要優(yōu)于其他組(A2組、B1組、B2組)，這也證實了顱腦損傷可以與FK506協(xié)同促進坐骨神經(jīng)損傷后的修復(fù)，推測腦損傷其誘導(dǎo)神經(jīng)再生作用機制與FK506促進神經(jīng)恢復(fù)機制可能不完全相同。

在Sunderland V型的外圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)損傷切斷了神經(jīng)軸突內(nèi)分泌的養(yǎng)分，不能將其輸送到靶子器官上，靶子器官將失去活性和營養(yǎng)的支持，同時靶器官分泌的物質(zhì)不能反饋給上一級中樞[16-18]。根據(jù)目前的FK506促進神經(jīng)機制，促進外圍神經(jīng)修復(fù)相對明確是兩個功能領(lǐng)域，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能，形成一個FKBP12的綜合體，加入功能地區(qū)后表達GAP-43，一個超蛋白質(zhì)神經(jīng)生長，并促進形成和擴大神經(jīng)的生長由神經(jīng)脈沖生成的生物電能，靶器官再生軸突的內(nèi)徑上升，厚厚的神經(jīng)膜層作用范圍增加[19-23]。這證實了FK506有助于恢復(fù)外圍神經(jīng)的營養(yǎng)功能，萎縮身體的部分看起來更容易潰瘍，SFI、神經(jīng)干動作電位恢復(fù)幅值率FK506組(A1組、A2組)恢復(fù)較好，提示促進損傷的修復(fù)作用，結(jié)合功能或復(fù)雜的FKBP12 區(qū)來促進表達GAP-43。

在周圍神經(jīng)損傷后，軸突的退化立即發(fā)生，軸突碎片是由巨噬細(xì)胞吞噬清除的，新的軸突、未退化的神經(jīng)元延伸到由Schwann細(xì)胞組成的內(nèi)膜神經(jīng)的間隙，靶器官逐漸建立聯(lián)系和營養(yǎng)[24-26]。FK506結(jié)合FKBP12，形成鈣復(fù)合物抑制堿(CAN)，抑制T細(xì)胞的衰減，并抑制白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)的表達，以生產(chǎn)免疫抑制物被神經(jīng)接收[27-28]。周圍神經(jīng)的損傷伴隨著血液神經(jīng)屏障的破壞，刺激纖維增生和巨噬細(xì)胞的擴散，形成影響神經(jīng)修復(fù)的疤痕[29-30]。FK506可以抑制纖維素的擴散、遷移和生物活性，抑制纖維素的擴散，并通過免疫抑制作用促進神經(jīng)損傷的重建和修復(fù)。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，創(chuàng)造微型環(huán)境的因素、Schwann細(xì)胞的信號有助于促進軸突再生[31]。神經(jīng)交換的物質(zhì)是軸漿的運輸器官和再生軸芽器官通過內(nèi)膜管再生作用于目標(biāo)器官[29]。軸突內(nèi)物質(zhì)更好地恢復(fù)運輸功能和靶器官的反饋是相互促進的[2]。脊髓前角熒光金標(biāo)記證明A1組比 A2組、B1組、B2組的免疫神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)在腦損傷期間的關(guān)系更加密切[32-33]，自主神經(jīng)系統(tǒng)的中心結(jié)構(gòu)被摧毀，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)紊亂、改變或喪失，功能腦細(xì)胞的變性，導(dǎo)致Caspase瀑布反應(yīng)性的激活，導(dǎo)致神經(jīng)凋亡。

本試驗結(jié)果提示，腦損傷伴隨周圍神經(jīng)損傷動物早期應(yīng)用FK506后，周圍神經(jīng)修復(fù)再生方面較好，腦損傷、FK506均可促進周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)，并且協(xié)同促進神經(jīng)損傷的修復(fù)效果更好，為腦損傷合并周圍神經(jīng)損傷的患者提供了新的治療思路。但腦損傷促進周圍神經(jīng)損傷的具體機制仍需進一步深入研究。