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        副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

        2020-01-15 08:59:34王紫薇趙曉娟
        中國食品學(xué)報(bào) 2020年1期
        關(guān)鍵詞:溶血性弧菌分值

        韓 笑 劉 莉 王紫薇 汪 琦 趙曉娟 曾 靜

        (北京海關(guān)技術(shù)中心 北京 100026)

        副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,簡(jiǎn)稱VP),隸屬弧菌科弧菌屬,是一種革蘭氏陰性致病菌。該菌廣泛分布在近海岸的海水、海底沉積物、海產(chǎn)品及腌制食品中[1]。人類主要因食用被污染的食品而感染副溶血性弧菌?;颊咄鶗?huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱等癥狀[2]。在我國,由副溶血性弧菌引起的腹瀉或食物中毒,其暴發(fā)規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)[3]。目前,副溶血性弧菌檢測(cè)手段主要以傳統(tǒng)方法為主[4-5],以及基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法,例如:普通PCR方法[6]、實(shí)時(shí)熒光PCR方法[7-8]、LAMP方法等。傳統(tǒng)方法以生化鑒定結(jié)果為依據(jù),操作繁瑣,耗時(shí)長;基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法雖然具有較好靈敏度,但是易于產(chǎn)生假陽性結(jié)果,PCR結(jié)果往往需要傳統(tǒng)檢測(cè)方法驗(yàn)證。

        基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種全新的微生物檢測(cè)技術(shù)[9]。其具體原理是細(xì)菌樣品與基質(zhì)溶液形成的共晶體在激光照射下發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移,使得樣品分子電離,同質(zhì)荷比(m/z)的離子在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道,根據(jù)到達(dá)飛行時(shí)間檢測(cè)器(TOF)時(shí)所用時(shí)間的不同而被分離和檢測(cè),測(cè)得的蛋白質(zhì)及多肽質(zhì)量指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫比對(duì),得到鑒定結(jié)果[10-11]。獲得良好的質(zhì)譜圖是進(jìn)行正確鑒定的前提[12],培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、樣品處理方法等對(duì)微生物質(zhì)譜圖的峰型分布都有一定影響[13-14]。優(yōu)化影響質(zhì)譜圖的各種因素,是得到正確鑒定結(jié)果的關(guān)鍵[15-16]。

        本文利用MALDI-TOF-MS來檢測(cè)副溶血性弧菌,并以2株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為參考菌株,對(duì)菌株培養(yǎng)時(shí)間、溫度及所用的培養(yǎng)基、前處理方法等影響譜圖質(zhì)量的主要因素進(jìn)行研究[17-18]。建立副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法,用461株副溶血性弧菌分離株對(duì)此方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 試驗(yàn)菌株 副溶血性弧菌參考菌株ATCC 17802,美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC);CGMCC 1.1997,中國普通微生物菌種保藏管理中心(China general microbiological culture collection center,CGMCC)。461株實(shí)驗(yàn)室自分離的副溶血性弧菌,經(jīng)VITEK2Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定均為副溶血性弧菌。

        1.1.2 試劑 甲酸(formicacid,F(xiàn)A)、乙腈(acetonitrile,ACN)、無水乙醇(色譜純),美國Fisher公司;三氟乙酸(trifluoracetic acid,TFA)(色譜純),德國Merck公司;校準(zhǔn)蛋白干粉(protein calibration standard)、基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(αcyano-4-hydroxy-cinnamic acid,HCCA),德 國Bruker公司;TCBS 瓊脂(TCBS agar)、2%氯化鈉-胰蛋白胨大豆瓊脂(2%NaCl-tryptic soy agar,2%NaCl-TSA)、T1N1 瓊脂(T1N1 agar),北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司;科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基(CHRO MagarTMVibrio),法國科瑪嘉公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Friocell 222L培養(yǎng)箱,德國MMM公司;Centrifuge 5424型臺(tái)式離心機(jī),德國Eppendorf公司;基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MicroflexTMMALDI-TOF-MS),德國Bruker公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 培養(yǎng)條件的確定 將副溶血性弧菌ATCC17802和CGMCC1.1997分別接種于2%NaCl-TSA、TCBS、T1N1和CHRO MagarTMVibrio 4種培養(yǎng)基,30℃和37℃培養(yǎng) 4,8,18,24 h。將不同培養(yǎng)條件下采集的兩株參考菌株質(zhì)譜圖與MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫相比對(duì),獲得最高匹配度鑒定結(jié)果,譜圖基線平滑,信噪比高,蛋白質(zhì)峰多的條件為最佳培養(yǎng)條件。

        1.3.2 處理方法的確定 直接涂抹法:用無菌棉棒直接挑取單菌落,涂布于樣品靶板上,同時(shí)點(diǎn)1 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液(校準(zhǔn)),室溫條件下晾干,再覆蓋1μL HCCA溶液,晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

        擴(kuò)展直接涂抹法:用無菌棉棒直接挑取單菌落,涂于樣品靶板上,室溫條件下晾干,在上述樣品點(diǎn)上覆蓋1μL 70%甲酸水溶液,同時(shí)點(diǎn)1μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液(校準(zhǔn)),在室溫下自然晾干,再覆蓋1 μL HCCA溶液,晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

        甲酸-乙腈提取法:挑取適量(約 5~10mg)菌落樣品于1.5mL離心管中,加入300μL純水,混勻,再加入900μL無水乙醇,混勻;12 000 r/min離心2min,棄去上清液;加入50μL 70%甲酸,仔細(xì)混勻,再加入50μL乙腈,仔細(xì)混勻,12 000 r/min離心2min,吸取1μL上清液點(diǎn)在靶板上,同時(shí)點(diǎn)1μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液(校準(zhǔn)),自然晾干后再點(diǎn)1 μL基質(zhì)覆蓋,晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

        1.3.3 培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖背景信號(hào)的影響 選取4種培養(yǎng)基,在無微生物生長的區(qū)域,用無菌棉拭子接觸培養(yǎng)基表面進(jìn)行取樣,后續(xù)處理方法相同,然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

        1.3.4 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)采集對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并保存,每次試驗(yàn)前都要在采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍內(nèi)使用肽蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn),校正后進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

        儀器參數(shù):選擇線性操作模式,正離子模式;檢測(cè)范圍m/z 2 000~20 000 u;激光點(diǎn)擊數(shù):每張圖譜240次;離子源加速電壓:20 kV;激光頻率:60.0Hz。

        1.3.5 副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的穩(wěn)定性試驗(yàn) 將副溶血性弧菌ATCC17802、CGMCC1.1997按照1.3.1和1.3.2節(jié)中確定的最適培養(yǎng)條件和樣品處理方法,每個(gè)菌株重復(fù)測(cè)定10次,以考察最優(yōu)條件下鑒定結(jié)果的穩(wěn)定性。

        1.3.6 副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的驗(yàn)證 用MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法對(duì)461株副溶血性弧菌分離菌株進(jìn)行質(zhì)譜分析,每株分離株做2個(gè)平行靶點(diǎn)。用Biotyper數(shù)據(jù)庫獲得鑒定分值,鑒定結(jié)果以對(duì)數(shù)值0~3作為評(píng)判分?jǐn)?shù),分值在2.000~3.000之間,表示可確認(rèn)菌種鑒定結(jié)果;分值在1.700~1.999之間,表示可能的菌屬鑒定或該菌種鑒定為不確定結(jié)果;分值在0.000~1.699之間,表示不可信的鑒定結(jié)果。對(duì)鑒定結(jié)果不是副溶血性弧菌或鑒定分值低于2.000的分離菌株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒定,具體方法引用自《出口食品中食源性致病菌檢測(cè)方法——實(shí)時(shí)熒光PCR法》(SN/T 1870-2016),并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 最適培養(yǎng)條件的確定

        2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)副溶血性弧菌鑒定結(jié)果的影響 將參考菌株ATCC17802和CGMCC1.1997分別接種于T1N1、CHRO MagarTMVibrio、2%NaCl-TSA和TCBS 4種培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),比較不同培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明,2株參考菌株經(jīng)MALDITOF-MS鑒定全部為副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus),ATCC17802鑒定分值分別為2.379,2.327,2.446,2.022,CGMCC1.1997鑒定分值分別為2.346,2.321,2.416,2.100。

        TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的副溶血性弧菌所得的MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)指紋圖譜和其它3種培養(yǎng)基有所差異,出峰數(shù)位點(diǎn)有所變化,并且鑒定分值略低于其它3種培養(yǎng)基。2%NaCl-TSA、T1N1和CHRO MagarTMVibrio這3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的副溶血性弧菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)譜圖基本一致,圖譜類型基本相同(圖1),并且均能達(dá)到可完全確認(rèn)菌株的鑒定結(jié)果。經(jīng)2%NaCl-TSA培養(yǎng)的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖信噪比高,峰強(qiáng)度遠(yuǎn)高于T1N1和CHRO MagarTMVibrio培養(yǎng)的副溶血性弧菌,質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中的特征性質(zhì)譜圖匹配效果更好。

        圖1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的副溶血性弧菌(ATCC17802)質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of V.parahaemolyticus(ATCC17802)strains in different culture medium

        2.1.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)副溶血性弧菌鑒定結(jié)果的影響 將參考菌株ATCC17802、CGMCC1.1997接種于2%NaCl-TSA培養(yǎng)基,分別于30,37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),比較不同培養(yǎng)溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明,2株參考菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定全部為副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus),ATCC17802 鑒定分值分別為2.210和2.475。CGMCC1.1997鑒定分值分別為2.259和2.432。30℃和37℃溫度條件對(duì)副溶血性弧菌的鑒定結(jié)果沒有影響。MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖基本保持不變,圖譜類型基本相同(圖2),經(jīng)37℃培養(yǎng)的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖信噪比高,峰強(qiáng)度高于30℃培養(yǎng)的副溶血性弧菌,且質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中的特征性質(zhì)譜圖匹配效果更好。

        圖2 不同培養(yǎng)溫度的副溶血性弧菌(ATCC17802)鑒定質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of V.parahaemolyticus(ATCC17802)strains in different temperature

        2.1.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)副溶血性弧菌鑒定結(jié)果的影響 將參考菌株ATCC17802、CGMCC1.1997于2%NaCl-TSA 培養(yǎng)基 37℃分別培養(yǎng) 4,8,18,24 h,對(duì)菌株進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定,比較培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)譜圖的影響。結(jié)果表明,2株參考菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定全部為副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus),ATCC17802 鑒定分值分別為2.395,2.412,2.408和2.497,CGMCC1.1997 鑒定分值分別為2.365,2.398,2.402和2.481。在不同生長階段的副溶血性弧菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)譜圖基本保持不變,圖譜類型基本相同,都可以得到完全確認(rèn)菌種的鑒定結(jié)果(圖3)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,峰強(qiáng)度逐漸升高、出峰數(shù)量有所增加。在培養(yǎng)24 h后的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖信噪比最高,出峰數(shù)量最多,且質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中的特征性質(zhì)譜圖匹配效果最好。

        2.2 最適前處理方法的確定

        以 ATCC17802、CGMCC1.1997作為參考菌株,在2%NaCl-TSA培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h之后分別用直接涂抹法、擴(kuò)展直接涂抹法和甲酸-乙腈提取法對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行處理,然后對(duì)菌株進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),比較不同處理方法對(duì)蛋白質(zhì)譜圖的影響。結(jié)果表明,2株參考菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定都為副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus),ATCC17802 鑒定分值分別為2.074,1.903和2.394。CGMCC1.1997鑒定分值分別為2.186,1.899和2.408。這3種方法處理后的副溶血性弧菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)譜圖基本保持不變,圖譜類型基本相同(圖4),而甲酸-乙腈提取法處理的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖信噪比高,峰強(qiáng)度遠(yuǎn)高于直接涂抹法、擴(kuò)展直接涂抹法處理的副溶血性弧菌,且質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中的特征性質(zhì)譜圖匹配效果更好,并達(dá)到可完全確認(rèn)菌種的鑒定結(jié)果。

        圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)的副溶血性弧菌(ATCC17802)鑒定質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of V.parahaemolyticus(ATCC17802)strains cultured during different time

        圖4 不同處理方法的副溶血性弧菌(ATCC17802)鑒定質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of V.parahaemolyticus(ATCC17802)strains cultured during different sample treatments

        2.3 培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖信號(hào)的影響

        選取未生長微生物的區(qū)域進(jìn)行蛋白質(zhì)量圖譜的采集,單純的培養(yǎng)基峰信號(hào)集中在m/z 2 000~4 000 u之間,將這些信號(hào)與培養(yǎng)24 h的微生物峰信號(hào)相比,培養(yǎng)基的峰信號(hào)不包含在微生物的特征峰中,所以不考慮培養(yǎng)基對(duì)副溶血性弧菌質(zhì)譜圖帶來的影響。(圖5)。

        圖5 不同培養(yǎng)基背景信號(hào)的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of different mediums

        2.4 副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

        將ATCC17802、CGMCC1.1997接種于2%NaCl-TSA培養(yǎng)基,在37℃培養(yǎng)24 h后用甲酸-乙腈提取法對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行處理,然后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),重復(fù)采集10次質(zhì)譜圖,確定該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,2株參考菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定全部為副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus),10次檢測(cè)的鑒定分值比較接近均超過2.400,全部達(dá)到可完全確認(rèn)菌種的鑒定結(jié)果,并且MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖變化也很?。▓D6)。這說明副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法具有很好的穩(wěn)定性,對(duì)于參考菌株ATCC17802、CGMCC1.1997的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。

        2.5 MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

        對(duì)副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,被測(cè)副溶血性弧菌分離株的MALDI-TOF-MS鑒定分值97.6%(450/461)大于2.000,報(bào)告為副溶血性弧菌。其余11株分離株鑒定結(jié)果不是副溶血性弧菌或鑒定分值低于2.000,針對(duì)11株分離株進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行鑒定,結(jié)果見表1。

        3 討論

        副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法建立中,在培養(yǎng)條件優(yōu)化方面,采用2%NaCl-TSA、T1N1和CHRO MagarTMVibrio 3種培養(yǎng)基,30,37℃培養(yǎng)4,8,18,24 h對(duì)副溶血性弧菌的蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果沒有明顯影響,說明副溶血性弧菌對(duì)生長條件要求較寬泛。然而,從譜圖中可以看出,各種條件下生長的副溶血性弧菌獲得的質(zhì)譜圖的特征峰強(qiáng)度和數(shù)量方面略有差異。TCBS培養(yǎng)基對(duì)副溶血性弧菌的蛋白質(zhì)譜鑒定分值略低于其它3種培養(yǎng)基,且譜圖也明顯有異于其它3種培養(yǎng)基。在不同培養(yǎng)基上生長的微生物,由于攝取的營養(yǎng)成分不同,蛋白質(zhì)表達(dá)的種類和含量也有所差異,反映在質(zhì)譜圖上特征峰的數(shù)量、位置、強(qiáng)度和峰形不一,這與Rychert等[19]對(duì)于TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)后的弧菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)后質(zhì)譜圖與其它培養(yǎng)基不一致結(jié)論相同。因此,要根據(jù)待鑒定菌株的實(shí)際情況選擇最佳的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等條件。

        圖6 副溶血性弧菌參考菌株(ATCC17802)鑒定質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum and identification results of reference strains(ATCC17802)

        表1 11株副溶血性弧菌分離菌株檢測(cè)結(jié)果Table1 Detection results of 11 strains of Vibrio parahaemolyticus isolates

        在處理方法方面,直接涂抹法和擴(kuò)展直接涂抹法雖然快速易操作,但易受菌體其它代謝物干擾[20],鑒定分值也略低(2.074、1.903);甲酸-乙腈提取法可以將副溶血性弧菌內(nèi)部和表面的蛋白質(zhì)提取出來[21-22],所得譜圖提供的信息量多,離子峰的個(gè)數(shù)和強(qiáng)度均較好,從而得到較好的試驗(yàn)結(jié)果。

        在對(duì)副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的驗(yàn)證中,有11株鑒定結(jié)果不是副溶血性弧菌或鑒定分值低于2.000。采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)一步鑒定,除BJ-VP-388外,其余10株分離株MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法與實(shí)時(shí)熒光PCR方法的鑒定結(jié)果一致。其中8株分離株鑒定結(jié)果為溶藻性弧菌(V.alginolyticus),與 VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致,這是由于VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)在程序上檢測(cè)到的生化反應(yīng)組合模式與數(shù)據(jù)庫中某種細(xì)菌編碼吻合就會(huì)終止鑒定,這可能導(dǎo)致細(xì)菌在“種”水平上的鑒定出現(xiàn)錯(cuò)誤,這與林杰等[23]在2016年發(fā)表的文章中對(duì)VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)在“種”水平鑒定出現(xiàn)錯(cuò)誤的原因結(jié)論一致。BJ-VP-388用MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法與VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果一致,然而與實(shí)時(shí)熒光PCR方法的鑒定結(jié)果不一致。本研究將在后續(xù)試驗(yàn)中對(duì)這株分離株做進(jìn)一步的全基因組測(cè)序,以確定這些分離株的正確種屬。

        本研究結(jié)果表明建立的副溶血性弧菌MALDITOF-MS檢測(cè)方法用于鑒定副溶血性弧菌具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,可以快速、準(zhǔn)確地鑒定副溶血性弧菌。該方法與傳統(tǒng)的鑒定方法相比較,具有操作簡(jiǎn)單、高通量、快速等優(yōu)點(diǎn)[24-25]。因此,該方法可用于副溶血性弧菌的日常檢測(cè)和鑒定。

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