韓 笑 劉 莉 王紫薇 汪 琦 趙曉娟 曾 靜

（北京海關(guān)技術(shù)中心 北京 100026）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡(jiǎn)稱VP），隸屬弧菌科弧菌屬，是一種革蘭氏陰性致病菌。該菌廣泛分布在近海岸的海水、海底沉積物、海產(chǎn)品及腌制食品中[1]。人類主要因食用被污染的食品而感染副溶血性弧菌。患者往往會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱等癥狀[2]。在我國(guó)，由副溶血性弧菌引起的腹瀉或食物中毒，其暴發(fā)規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)[3]。目前，副溶血性弧菌檢測(cè)手段主要以傳統(tǒng)方法為主[4-5]，以及基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法，例如：普通PCR方法[6]、實(shí)時(shí)熒光PCR方法[7-8]、LAMP方法等。傳統(tǒng)方法以生化鑒定結(jié)果為依據(jù)，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)；基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法雖然具有較好靈敏度，但是易于產(chǎn)生假陽性結(jié)果，PCR結(jié)果往往需要傳統(tǒng)檢測(cè)方法驗(yàn)證。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年來發(fā)展起來的一種全新的微生物檢測(cè)技術(shù)[9]。其具體原理是細(xì)菌樣品與基質(zhì)溶液形成的共晶體在激光照射下發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，使得樣品分子電離，同質(zhì)荷比（m/z）的離子在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)飛行時(shí)間檢測(cè)器（TOF）時(shí)所用時(shí)間的不同而被分離和檢測(cè)，測(cè)得的蛋白質(zhì)及多肽質(zhì)量指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到鑒定結(jié)果[10-11]。獲得良好的質(zhì)譜圖是進(jìn)行正確鑒定的前提[12]，培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、樣品處理方法等對(duì)微生物質(zhì)譜圖的峰型分布都有一定影響[13-14]。優(yōu)化影響質(zhì)譜圖的各種因素，是得到正確鑒定結(jié)果的關(guān)鍵[15-16]。

本文利用MALDI-TOF-MS來檢測(cè)副溶血性弧菌，并以2株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為參考菌株，對(duì)菌株培養(yǎng)時(shí)間、溫度及所用的培養(yǎng)基、前處理方法等影響譜圖質(zhì)量的主要因素進(jìn)行研究[17-18]。建立副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法，用461株副溶血性弧菌分離株對(duì)此方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 副溶血性弧菌參考菌株ATCC 17802，美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）；CGMCC 1.1997，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC）。461株實(shí)驗(yàn)室自分離的副溶血性弧菌，經(jīng)VITEK2Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定均為副溶血性弧菌。

1.1.2 試劑 甲酸（formicacid，F(xiàn)A）、乙腈（acetonitrile，ACN）、無水乙醇（色譜純），美國(guó)Fisher公司；三氟乙酸（trifluoracetic acid，TFA）（色譜純），德國(guó)Merck公司；校準(zhǔn)蛋白干粉（protein calibration standard）、基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（αcyano-4-hydroxy-cinnamic acid，HCCA），德 國(guó)Bruker公司；TCBS 瓊脂（TCBS agar）、2%氯化鈉-胰蛋白胨大豆瓊脂（2%NaCl-tryptic soy agar，2%NaCl-TSA）、T1N1 瓊脂（T1N1 agar），北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基（CHRO MagarTMVibrio），法國(guó)科瑪嘉公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Friocell 222L培養(yǎng)箱，德國(guó)MMM公司；Centrifuge 5424型臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MicroflexTMMALDI-TOF-MS），德國(guó)Bruker公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)條件的確定 將副溶血性弧菌ATCC17802和CGMCC1.1997分別接種于2%NaCl-TSA、TCBS、T1N1和CHRO MagarTMVibrio 4種培養(yǎng)基，30℃和37℃培養(yǎng) 4，8，18，24 h。將不同培養(yǎng)條件下采集的兩株參考菌株質(zhì)譜圖與MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)相比對(duì)，獲得最高匹配度鑒定結(jié)果，譜圖基線平滑，信噪比高，蛋白質(zhì)峰多的條件為最佳培養(yǎng)條件。

1.3.2 處理方法的確定 直接涂抹法：用無菌棉棒直接挑取單菌落，涂布于樣品靶板上，同時(shí)點(diǎn)1 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液（校準(zhǔn)），室溫條件下晾干，再覆蓋1μL HCCA溶液，晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

擴(kuò)展直接涂抹法：用無菌棉棒直接挑取單菌落，涂于樣品靶板上，室溫條件下晾干，在上述樣品點(diǎn)上覆蓋1μL 70%甲酸水溶液，同時(shí)點(diǎn)1μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液（校準(zhǔn)），在室溫下自然晾干，再覆蓋1 μL HCCA溶液，晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

甲酸-乙腈提取法：挑取適量（約 5～10mg）菌落樣品于1.5mL離心管中，加入300μL純水，混勻，再加入900μL無水乙醇，混勻；12 000 r/min離心2min，棄去上清液；加入50μL 70%甲酸，仔細(xì)混勻，再加入50μL乙腈，仔細(xì)混勻，12 000 r/min離心2min，吸取1μL上清液點(diǎn)在靶板上，同時(shí)點(diǎn)1μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液（校準(zhǔn)），自然晾干后再點(diǎn)1 μL基質(zhì)覆蓋，晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.3 培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖背景信號(hào)的影響 選取4種培養(yǎng)基，在無微生物生長(zhǎng)的區(qū)域，用無菌棉拭子接觸培養(yǎng)基表面進(jìn)行取樣，后續(xù)處理方法相同，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.4 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)采集對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并保存，每次試驗(yàn)前都要在采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍內(nèi)使用肽蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，校正后進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

儀器參數(shù)：選擇線性操作模式，正離子模式；檢測(cè)范圍m/z 2 000～20 000 u；激光點(diǎn)擊數(shù)：每張圖譜240次；離子源加速電壓：20 kV；激光頻率：60.0Hz。

1.3.5 副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的穩(wěn)定性試驗(yàn) 將副溶血性弧菌ATCC17802、CGMCC1.1997按照1.3.1和1.3.2節(jié)中確定的最適培養(yǎng)條件和樣品處理方法，每個(gè)菌株重復(fù)測(cè)定10次，以考察最優(yōu)條件下鑒定結(jié)果的穩(wěn)定性。

1.3.6 副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的驗(yàn)證 用MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法對(duì)461株副溶血性弧菌分離菌株進(jìn)行質(zhì)譜分析，每株分離株做2個(gè)平行靶點(diǎn)。用Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)獲得鑒定分值，鑒定結(jié)果以對(duì)數(shù)值0～3作為評(píng)判分?jǐn)?shù)，分值在2.000～3.000之間，表示可確認(rèn)菌種鑒定結(jié)果；分值在1.700～1.999之間，表示可能的菌屬鑒定或該菌種鑒定為不確定結(jié)果；分值在0.000～1.699之間，表示不可信的鑒定結(jié)果。對(duì)鑒定結(jié)果不是副溶血性弧菌或鑒定分值低于2.000的分離菌株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒定，具體方法引用自《出口食品中食源性致病菌檢測(cè)方法——實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T 1870-2016），并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適培養(yǎng)條件的確定

2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)副溶血性弧菌鑒定結(jié)果的影響 將參考菌株ATCC17802和CGMCC1.1997分別接種于T1N1、CHRO MagarTMVibrio、2%NaCl-TSA和TCBS 4種培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，比較不同培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，2株參考菌株經(jīng)MALDITOF-MS鑒定全部為副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus），ATCC17802鑒定分值分別為2.379，2.327，2.446，2.022，CGMCC1.1997鑒定分值分別為2.346，2.321，2.416，2.100。

TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的副溶血性弧菌所得的MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)指紋圖譜和其它3種培養(yǎng)基有所差異，出峰數(shù)位點(diǎn)有所變化，并且鑒定分值略低于其它3種培養(yǎng)基。2%NaCl-TSA、T1N1和CHRO MagarTMVibrio這3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的副溶血性弧菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)譜圖基本一致，圖譜類型基本相同（圖1），并且均能達(dá)到可完全確認(rèn)菌株的鑒定結(jié)果。經(jīng)2%NaCl-TSA培養(yǎng)的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖信噪比高，峰強(qiáng)度遠(yuǎn)高于T1N1和CHRO MagarTMVibrio培養(yǎng)的副溶血性弧菌，質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征性質(zhì)譜圖匹配效果更好。

圖1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的副溶血性弧菌（ATCC17802）質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of V.parahaemolyticus（ATCC17802）strains in different culture medium

2.1.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)副溶血性弧菌鑒定結(jié)果的影響 將參考菌株ATCC17802、CGMCC1.1997接種于2%NaCl-TSA培養(yǎng)基，分別于30，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，比較不同培養(yǎng)溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，2株參考菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定全部為副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus），ATCC17802 鑒定分值分別為2.210和2.475。CGMCC1.1997鑒定分值分別為2.259和2.432。30℃和37℃溫度條件對(duì)副溶血性弧菌的鑒定結(jié)果沒有影響。MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖基本保持不變，圖譜類型基本相同（圖2），經(jīng)37℃培養(yǎng)的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖信噪比高，峰強(qiáng)度高于30℃培養(yǎng)的副溶血性弧菌，且質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征性質(zhì)譜圖匹配效果更好。

圖2 不同培養(yǎng)溫度的副溶血性弧菌（ATCC17802）鑒定質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of V.parahaemolyticus（ATCC17802）strains in different temperature

2.1.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)副溶血性弧菌鑒定結(jié)果的影響 將參考菌株ATCC17802、CGMCC1.1997于2%NaCl-TSA 培養(yǎng)基 37℃分別培養(yǎng) 4，8，18，24 h，對(duì)菌株進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，比較培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)譜圖的影響。結(jié)果表明，2株參考菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定全部為副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus），ATCC17802 鑒定分值分別為2.395，2.412，2.408和2.497，CGMCC1.1997 鑒定分值分別為2.365，2.398，2.402和2.481。在不同生長(zhǎng)階段的副溶血性弧菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)譜圖基本保持不變，圖譜類型基本相同，都可以得到完全確認(rèn)菌種的鑒定結(jié)果（圖3）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，峰強(qiáng)度逐漸升高、出峰數(shù)量有所增加。在培養(yǎng)24 h后的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖信噪比最高，出峰數(shù)量最多，且質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征性質(zhì)譜圖匹配效果最好。

2.2 最適前處理方法的確定

以 ATCC17802、CGMCC1.1997作為參考菌株，在2%NaCl-TSA培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h之后分別用直接涂抹法、擴(kuò)展直接涂抹法和甲酸-乙腈提取法對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行處理，然后對(duì)菌株進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，比較不同處理方法對(duì)蛋白質(zhì)譜圖的影響。結(jié)果表明，2株參考菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定都為副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus），ATCC17802 鑒定分值分別為2.074，1.903和2.394。CGMCC1.1997鑒定分值分別為2.186，1.899和2.408。這3種方法處理后的副溶血性弧菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到的蛋白質(zhì)譜圖基本保持不變，圖譜類型基本相同（圖4），而甲酸-乙腈提取法處理的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖信噪比高，峰強(qiáng)度遠(yuǎn)高于直接涂抹法、擴(kuò)展直接涂抹法處理的副溶血性弧菌，且質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征性質(zhì)譜圖匹配效果更好，并達(dá)到可完全確認(rèn)菌種的鑒定結(jié)果。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)的副溶血性弧菌（ATCC17802）鑒定質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of V.parahaemolyticus（ATCC17802）strains cultured during different time

圖4 不同處理方法的副溶血性弧菌（ATCC17802）鑒定質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of V.parahaemolyticus（ATCC17802）strains cultured during different sample treatments

2.3 培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖信號(hào)的影響

選取未生長(zhǎng)微生物的區(qū)域進(jìn)行蛋白質(zhì)量圖譜的采集，單純的培養(yǎng)基峰信號(hào)集中在m/z 2 000～4 000 u之間，將這些信號(hào)與培養(yǎng)24 h的微生物峰信號(hào)相比，培養(yǎng)基的峰信號(hào)不包含在微生物的特征峰中，所以不考慮培養(yǎng)基對(duì)副溶血性弧菌質(zhì)譜圖帶來的影響。（圖5）。

圖5 不同培養(yǎng)基背景信號(hào)的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of different mediums

2.4 副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

將ATCC17802、CGMCC1.1997接種于2%NaCl-TSA培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)24 h后用甲酸-乙腈提取法對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行處理，然后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，重復(fù)采集10次質(zhì)譜圖，確定該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，2株參考菌株經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定全部為副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus），10次檢測(cè)的鑒定分值比較接近均超過2.400，全部達(dá)到可完全確認(rèn)菌種的鑒定結(jié)果，并且MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖變化也很小（圖6）。這說明副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法具有很好的穩(wěn)定性，對(duì)于參考菌株ATCC17802、CGMCC1.1997的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。

2.5 MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

對(duì)副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，被測(cè)副溶血性弧菌分離株的MALDI-TOF-MS鑒定分值97.6%（450/461）大于2.000，報(bào)告為副溶血性弧菌。其余11株分離株鑒定結(jié)果不是副溶血性弧菌或鑒定分值低于2.000，針對(duì)11株分離株進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表1。

3 討論

副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法建立中，在培養(yǎng)條件優(yōu)化方面，采用2%NaCl-TSA、T1N1和CHRO MagarTMVibrio 3種培養(yǎng)基，30，37℃培養(yǎng)4，8，18，24 h對(duì)副溶血性弧菌的蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果沒有明顯影響，說明副溶血性弧菌對(duì)生長(zhǎng)條件要求較寬泛。然而，從譜圖中可以看出，各種條件下生長(zhǎng)的副溶血性弧菌獲得的質(zhì)譜圖的特征峰強(qiáng)度和數(shù)量方面略有差異。TCBS培養(yǎng)基對(duì)副溶血性弧菌的蛋白質(zhì)譜鑒定分值略低于其它3種培養(yǎng)基，且譜圖也明顯有異于其它3種培養(yǎng)基。在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，由于攝取的營(yíng)養(yǎng)成分不同，蛋白質(zhì)表達(dá)的種類和含量也有所差異，反映在質(zhì)譜圖上特征峰的數(shù)量、位置、強(qiáng)度和峰形不一，這與Rychert等[19]對(duì)于TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)后的弧菌經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)后質(zhì)譜圖與其它培養(yǎng)基不一致結(jié)論相同。因此，要根據(jù)待鑒定菌株的實(shí)際情況選擇最佳的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等條件。

圖6 副溶血性弧菌參考菌株（ATCC17802）鑒定質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrum and identification results of reference strains（ATCC17802）

表1 11株副溶血性弧菌分離菌株檢測(cè)結(jié)果Table1 Detection results of 11 strains of Vibrio parahaemolyticus isolates

在處理方法方面，直接涂抹法和擴(kuò)展直接涂抹法雖然快速易操作，但易受菌體其它代謝物干擾[20]，鑒定分值也略低（2.074、1.903）；甲酸-乙腈提取法可以將副溶血性弧菌內(nèi)部和表面的蛋白質(zhì)提取出來[21-22]，所得譜圖提供的信息量多，離子峰的個(gè)數(shù)和強(qiáng)度均較好，從而得到較好的試驗(yàn)結(jié)果。

在對(duì)副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法的驗(yàn)證中，有11株鑒定結(jié)果不是副溶血性弧菌或鑒定分值低于2.000。采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)一步鑒定，除BJ-VP-388外，其余10株分離株MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法與實(shí)時(shí)熒光PCR方法的鑒定結(jié)果一致。其中8株分離株鑒定結(jié)果為溶藻性弧菌（V.alginolyticus），與 VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致，這是由于VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)在程序上檢測(cè)到的生化反應(yīng)組合模式與數(shù)據(jù)庫(kù)中某種細(xì)菌編碼吻合就會(huì)終止鑒定，這可能導(dǎo)致細(xì)菌在“種”水平上的鑒定出現(xiàn)錯(cuò)誤，這與林杰等[23]在2016年發(fā)表的文章中對(duì)VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)在“種”水平鑒定出現(xiàn)錯(cuò)誤的原因結(jié)論一致。BJ-VP-388用MALDI-TOF-MS檢測(cè)方法與VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果一致，然而與實(shí)時(shí)熒光PCR方法的鑒定結(jié)果不一致。本研究將在后續(xù)試驗(yàn)中對(duì)這株分離株做進(jìn)一步的全基因組測(cè)序，以確定這些分離株的正確種屬。

本研究結(jié)果表明建立的副溶血性弧菌MALDITOF-MS檢測(cè)方法用于鑒定副溶血性弧菌具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定副溶血性弧菌。該方法與傳統(tǒng)的鑒定方法相比較，具有操作簡(jiǎn)單、高通量、快速等優(yōu)點(diǎn)[24-25]。因此，該方法可用于副溶血性弧菌的日常檢測(cè)和鑒定。