鄒 琳 楊 盛 李 陽 張 希 馮鳳琴

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310058）

小麥醇溶蛋白是分子質(zhì)量為30～70 ku的單體蛋白質(zhì)[1]，是谷朊粉的主要組分，能賦予面團(tuán)一定的延展性[2-3]。由于分子結(jié)構(gòu)中大量存在的亮氨酸、脯氨酸等非極性氨基酸殘基和不可解離的極性谷氨酰胺殘基，小麥醇溶蛋白在中性條件下主要以大的聚集體而非以單個(gè)分子存在[4]，溶解性較差，極大地限制了其在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。對(duì)小麥醇溶蛋白進(jìn)行改性，增加其溶解性，提高乳化性、黏合性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)，拓寬小麥醇溶蛋白的應(yīng)用，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前，主要采用物理法、化學(xué)法、酶法和基因工程法等對(duì)小麥醇溶蛋白進(jìn)行改性[5]。物理法作用有限且不可控；化學(xué)法雖可有效提高小麥醇溶蛋白的性能，但可能會(huì)帶來毒副作用，如谷朊粉用堿處理后，其蛋白質(zhì)分子中的氨基酸發(fā)生消旋，導(dǎo)致必需氨基酸的L-對(duì)映體減少且消化率降低，并產(chǎn)生有毒的D-氨基酸，從而大大降低谷朊粉的營養(yǎng)價(jià)值[6]；基因工程法周期長，見效慢，目前應(yīng)用并不多。相比之下，酶法改性條件溫和，具有可控性、高效性、低能耗等優(yōu)點(diǎn)。

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Microbial transglutaminase，MTGase）是一種通過微生物發(fā)酵、分離純化而制得的高效生物催化劑，具有成本低，作用溫度穩(wěn)定，pH值范圍廣，且不依賴鈣離子等優(yōu)勢(shì)[7-8]。其催化機(jī)理是以肽鏈中的谷氨酰胺殘基γ-甲酰胺基為?；w，與?；荏w發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)[9-10]，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、乳化性、凝膠性和持水性等功能性質(zhì)[11]。小麥醇溶蛋白分子中富含MTGase作用的良好底物谷氨酰胺[12]，這使得利用MTGase點(diǎn)修飾改性小麥醇溶蛋白具有可行性。Gerrard等[13]用SE-HPLC分析對(duì)比MTGase點(diǎn)修飾前、后面筋蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)面團(tuán)中醇溶蛋白的含量明顯增加，而麥谷蛋白的變化并不明顯。倪新華等[14]應(yīng)用MTGase對(duì)面粉進(jìn)行品質(zhì)改良研究，結(jié)果表明，MTGase可以增加面團(tuán)的形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間、斷裂時(shí)間，降低面團(tuán)的弱化度，從而明顯改善面團(tuán)的粉質(zhì)特性。由于小麥醇溶蛋白水溶性極差，因此在進(jìn)行MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng)前需要進(jìn)行一定的預(yù)處理打斷或展開其蛋白結(jié)構(gòu)，以暴露更多的反應(yīng)位點(diǎn)[15]。Wróblewska 等[16]在進(jìn)行 MTGase酶催化乳清蛋白點(diǎn)修飾反應(yīng)前，先應(yīng)用堿性蛋白酶對(duì)乳清蛋白進(jìn)行水解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水解后的乳清蛋白更易于發(fā)生點(diǎn)修飾反應(yīng)。

本研究以小麥醇溶蛋白的胃蛋白酶水解產(chǎn)物為底物，利用MTGase進(jìn)行點(diǎn)修飾，以點(diǎn)修飾產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性為指標(biāo)，探究3種外源氨基供體——甘氨酸乙酯（Ethylglycinate，Gly-O-Et）、6-氨基己酸（6-epsilon-aminocaproic acid，EACA）和乙醇胺（Monoethanolamine，MEA）對(duì)點(diǎn)修飾的調(diào)控作用，最后通過分析點(diǎn)修飾產(chǎn)物的熔融溫度、粒徑、電位和三相接觸角等理化性質(zhì)進(jìn)一步確認(rèn)點(diǎn)修飾改性對(duì)小麥醇溶蛋白底物乳化穩(wěn)定性的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷朊粉，河南蓮花味精股份有限公司，蛋白質(zhì)含量76.02%。

甘氨酸乙酯鹽酸鹽（Gly-O-Et·HCl）、6-氨基己酸（EACA）、乙醇胺（MEA）和豬源胃蛋白酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MTGase，泰興市東圣食品科技有限公司；4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯（Dabsyl-Cl，CAS：56512-49-3），上海百靈威科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波破碎儀，上海生析超聲儀器有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀，瑞典福斯公司；反相高效液相色譜（RP-HPLC），美國安捷倫科技有限公司；差示掃描熱量儀，瑞士梅特勒-托利多公司；接觸角測(cè)量儀，德國Dataphysics公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；粒徑分析儀，英國馬爾文公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥醇溶蛋白的提取 將100mL乙醇檸檬酸緩沖溶液放入60℃水浴鍋預(yù)熱2min后，啟動(dòng)磁力攪拌，緩慢加入50 g/L的谷朊粉，保溫?cái)嚢?0min后，20 kHz，150W 超聲處理 30min。處理后的懸濁液在2 000 r/min，12℃條件下離心10 min。取上清液4℃保存。

將上清液緩慢加到水中，制備得到體積分?jǐn)?shù)12.5%蛋白乙醇水懸液。減壓旋蒸后，采用凱氏定氮法測(cè)定小麥醇溶蛋白粗提物（Wheat gliadin crude extracts，EXTs）的蛋白得率。

1.3.2 MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng) 將EXTs和0.01 mol/L HCl溶液按照體積比1∶4混勻，得到終質(zhì)量濃度為6.4 g/L EXTs懸濁體系。40℃恒溫?cái)嚢柘?，以酶底物質(zhì)量比為1∶64添加胃蛋白酶進(jìn)行水解。將水解0，0.5，1 h的粗提物100℃滅酶10min后，以相同濃度分別添加4 g/L甘氨酸乙酯鹽酸鹽，3.8 g/L 6-氨基己酸和0.17%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇胺，調(diào)節(jié)pH值至7.5。55℃恒溫?cái)嚢柘?，以酶底物質(zhì)量比為1∶64添加 MTGase，分別在反應(yīng) 1，2，4 h時(shí)取樣，85～100℃滅酶10min。

1.3.3 利用RP-HPLC測(cè)定氨基供體反應(yīng)量點(diǎn)修飾產(chǎn)物過0.22μm有機(jī)濾膜后用蒸餾水稀釋10倍，取0.2mL稀釋過濾液與0.2mL碳酸鈉緩沖液（pH 9，0.05 mol/L Na2CO3∶0.1 mol/L NaHCO3=1∶9）混合均勻，再加入0.8mL 15mmol/L 4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯乙腈反應(yīng)液，混勻，在72℃水浴條件下反應(yīng)15min，再加入1.2mL pH值為6.5的終止液（40mmol/L磷酸緩沖液∶無水乙醇=1∶1），置于10 000 r/min條件下離心10min，取上清液過0.22μm有機(jī)膜后用于檢測(cè)。

取濾液10μL進(jìn)行檢測(cè)：C18柱溫維持40℃，波長 436 nm，流動(dòng)相 A（乙腈）與流動(dòng)相 B（0.2%HAC水溶液）的比例維持7∶3，流速0.6 mL/min，持續(xù)15min。計(jì)算公式如下：

式中，LN，x——反應(yīng)x h后氨基供體殘留量，g；LN，0——反應(yīng)前氨基供體添加量，g。

1.3.4 點(diǎn)修飾產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性分析 取3mL點(diǎn)修飾產(chǎn)物在4℃下10 000 r/min離心5min，去掉上清后加入3mL的5mmo/L檸檬酸緩沖液（pH 4）重懸沉淀，再加入 3mL大豆油，混勻，20 kHz，150W超聲乳化1min，得到底物質(zhì)量濃度為3.2 g/L的乳化體系。將制備的乳液靜置36 h記錄析出水層高度。乳液穩(wěn)定系數(shù)計(jì)算公式如下：

式中，Hw，36——靜置36 h時(shí)乳層高度，cm；He，0——靜置0 h時(shí)乳層高度，cm。

1.3.5 小麥醇溶蛋白點(diǎn)修飾產(chǎn)物特征分析 將滅酶后的點(diǎn)修飾產(chǎn)物均分成3份，10 000 r/min離心5min，取沉淀分別添加到等體積的pH 6.99純凈水、5mmo/L pH 3.30檸檬酸緩沖液和5mmo/L pH 8.01碳酸鈉緩沖液中，20 kHz，150W超聲破碎、分散沉淀1min，最后將復(fù)分散的懸濁體系冷凍干燥，用于后續(xù)分析?？瞻捉M為添加已滅活的MTGase的小麥醇溶蛋白微粒懸濁體系。

1.3.5.1 差示掃描量熱儀（DSC）分析 取點(diǎn)修飾產(chǎn)物及其對(duì)應(yīng)空白組的凍干樣品分別置于40μL鋁坩堝中，沖壓封閉，線性升溫速率10℃/min，溫度從25℃升至250℃，氮?dú)饬魉?0mL/min。

1.3.5.2 粒徑、電位分析 向點(diǎn)修飾產(chǎn)物及其對(duì)應(yīng)空白組的凍干樣品加入19倍體積而pH值不同（為3.31，4.31，5.34，6.01，6.38，6.96和8.01）的5mmo/L緩沖液中，然后測(cè)定其粒徑及電位，連續(xù)相黏度為0.8872mPa·s，折射系數(shù)為1.450，室溫下測(cè)定。

1.3.5.3 三相接觸角分析 將點(diǎn)修飾產(chǎn)物及其對(duì)應(yīng)空白樣品溶解于60%乙醇水溶液中，滴一滴在載玻片上，待其風(fēng)干后測(cè)定，每次滴加1μL水相，拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS statistics 22和Origin Pro 9.2軟件進(jìn)行相關(guān)性和線性回歸處理分析。

2 結(jié)果分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化小麥醇溶蛋白提取工藝

在評(píng)價(jià)乙醇體積分?jǐn)?shù)、檸檬酸緩沖液濃度和超聲時(shí)間3個(gè)單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平CCD響應(yīng)面，考察各因素之間的交互作用對(duì)小麥醇溶蛋白提取的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1、表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及其水平Table1 Factors and levels used in response surface analysis

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Response surface design with experimental results

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到EXTs蛋白得率（Y）關(guān)于乙醇含量（A）、檸檬酸緩沖液濃度（B）、超聲時(shí)間（C）的二次回歸方程為：

Y=81.08+1.21A-1.37B-0.96C-1.14AB-0.26AC+0.06BC-13.81A2-3.57B2-6.23C2+13.6AB2

表3模型方差分析結(jié)果表明，該模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.5613＞0.05），說明該模型擬合度好。同時(shí)，可以得到各因素對(duì)EXTs蛋白得率影響強(qiáng)弱順序?yàn)锽（檸檬酸緩沖液濃度）、C（超聲時(shí)間）、A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）。

表3 EXTs蛋白得率的響應(yīng)面二次模型方差分析Table3 Analysis of variance of regression equation of EXTs rate

通過EXTs蛋白得率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得出在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，檸檬酸緩沖液濃度為5mmo/L，超聲時(shí)間為29.67min的工藝條件下，EXTs蛋白最大得率為81.0476%。

2.2 MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng)對(duì)EXTs乳化穩(wěn)定性的影響

2.2.1 MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng)對(duì)氨基供體反應(yīng)量的影響 小麥醇溶蛋白的復(fù)合改性可彌補(bǔ)單種改性方法改善功能性質(zhì)受到限制的缺點(diǎn)。在進(jìn)行MTGase點(diǎn)修飾改性前，利用胃蛋白酶催化小麥醇溶蛋白內(nèi)肽鍵斷裂成小分子多肽，增加蛋白質(zhì)的水溶性[17]，暴露出更多點(diǎn)修飾反應(yīng)的位點(diǎn)，提高點(diǎn)修飾反應(yīng)的效率。胃蛋白酶水解時(shí)間和MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng)時(shí)間對(duì)不同氨基供體反應(yīng)量的影響見圖1。

隨著點(diǎn)修飾反應(yīng)時(shí)間的延長，不同水解時(shí)間的EXTs與Gly-O-Et的反應(yīng)量不斷升高，由圖1a可知，反應(yīng)至4 h后，水解 0，30，60min的EXTs分別與（57.39±8.68）%，（41.79±0.78）%和（64.06±8.74）%的Gly-O-Et反應(yīng)，說明未水解和水解60 min的粗提物均比水解30min的粗提物更契合MTGase的反應(yīng)位點(diǎn)。這可能是因?yàn)镸TGase催化水解30min的粗提物中暴露的殘基之間產(chǎn)生了點(diǎn)修飾，進(jìn)而減少了能夠與Gly-O-Et結(jié)合的位點(diǎn)。

由圖1b可知，不同水解時(shí)間的粗提物與EACA的反應(yīng)量隨著點(diǎn)修飾時(shí)間的延長而不斷升高，其中，水解60min的粗提物與EACA反應(yīng)的速度最快，其次是水解30min的粗提物和未水解的粗提物，這可能是因?yàn)樗鈺r(shí)間越長，粗提物中暴露的反應(yīng)位點(diǎn)越多。反應(yīng)至4 h時(shí)，水解60min的粗提物與 EACA的反應(yīng)量最高，為（42.18±1.42）%，其次是水解30 min和未水解的粗提物，分別為（16.09±3.62）%、（20.09±2.80）%。

圖1 點(diǎn)修飾時(shí)間對(duì)氨基供體反應(yīng)量的影響Fig.1 Influence of cross-linking time towards the reacting amount of exogenous amino donors

由圖1c可知，水解30min的粗提物更易與MEA發(fā)生點(diǎn)修飾反應(yīng)，這可能與MEA具有親水性的小分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，能夠優(yōu)先進(jìn)入MTGase的催化活性部位[18]，迅速與水解30min的底物進(jìn)行反應(yīng)，然而隨著點(diǎn)修飾反應(yīng)的深入并達(dá)到4 h時(shí)，未水解、水解30min和水解60min粗提物點(diǎn)修飾的MEA反應(yīng)量相當(dāng)，分別達(dá)到（25.03±2.49）%、（24.19±4.15）%和（23.48±5.82）%。

2.2.2 MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的影響 MTGase能夠催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間、蛋白質(zhì)和氨基酸之間發(fā)生點(diǎn)修飾反應(yīng)[19]，而不同程度的點(diǎn)修飾作用得到的乳濁液的乳化穩(wěn)定性不同。胃蛋白酶水解時(shí)間和MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的影響見圖2。

胃蛋白酶水解程度不同的粗提物在進(jìn)行以Gly-O-Et為氨基供體的點(diǎn)修飾后，產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性變化趨勢(shì)不同。由圖2a可知，MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng)能夠提高未水解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性，其中，點(diǎn)修飾反應(yīng)2 h時(shí)有顯著的提高，可能是低程度的點(diǎn)修飾作用得到的乳濁液容易發(fā)生脂肪球的聚集合并，而高程度的點(diǎn)修飾反應(yīng)的乳濁液由于連續(xù)相的黏度增大或者是吸附層發(fā)生的變化弱化了聚集作用[20]，具有較高的穩(wěn)定性。然而這種提高是有限的，將產(chǎn)物放置36 h后，未水解且進(jìn)行點(diǎn)修飾2 h的試驗(yàn)組乳化穩(wěn)定系數(shù)為（91.93±0.11）%，相比未水解且未進(jìn)行點(diǎn)修飾的空白組乳液穩(wěn)定性（90.24±0.23%）而言僅僅提高了1.69%。而對(duì)于水解30min和水解60min粗提物的點(diǎn)修飾產(chǎn)物，其乳化穩(wěn)定性不再提高甚至出現(xiàn)明顯的抑制作用。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是小麥醇溶蛋白粗提物經(jīng)過胃蛋白酶酶解后，在水相界面上產(chǎn)生較多的多肽[21]，使得后續(xù)點(diǎn)修飾反應(yīng)過快地進(jìn)行，而阻礙了規(guī)則的蛋白結(jié)構(gòu)的形成[22]，同時(shí)MTGase點(diǎn)修飾后的粗提物，其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)被打開，多肽鏈變得舒展，導(dǎo)致分子內(nèi)部諸多疏水區(qū)域暴露在水溶液中，最終因疏水作用而凝集發(fā)生沉降[23]，從而降低了產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性。

由圖2b可知，與水解30min和水解60min粗提物的點(diǎn)修飾產(chǎn)物相比，未水解的粗提物與EACA進(jìn)行點(diǎn)修飾反應(yīng)后產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性最好，且點(diǎn)修飾2 h和4 h與點(diǎn)修飾0 h相比顯著提高。然而，點(diǎn)修飾反應(yīng)對(duì)乳化穩(wěn)定性的提升有限，放置36 h后，點(diǎn)修飾4 h的試驗(yàn)組乳液穩(wěn)定系數(shù)是（99.19±0.16）%，相比未進(jìn)行點(diǎn)修飾的空白組乳液穩(wěn)定性（96.94±0.80）%而言僅提高了2.25%。同時(shí)，對(duì)水解60 min粗提物進(jìn)行點(diǎn)修飾明顯降低了產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性。

由圖2c可知，MEA點(diǎn)修飾反應(yīng)1 h和2 h時(shí)，對(duì)未水解粗提物乳化穩(wěn)定性的提高最明顯，而點(diǎn)修飾4 h時(shí)降低了乳化穩(wěn)定性。同時(shí)，水解30 min和水解60min的粗提物隨著點(diǎn)修飾反應(yīng)時(shí)間的延長，產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)。

圖2 水解時(shí)間對(duì)點(diǎn)修飾產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Influence of hydrolyzing time towards the emulsion stability of cross-linking products

2.3 小麥醇溶蛋白點(diǎn)修飾產(chǎn)物特征分析

2.3.1 DSC分析 由表4可知，Gly-O-Et點(diǎn)修飾（133.74±1.50）℃對(duì)粗提物熔融溫度（135.3±3.97）℃影響不顯著，EACA點(diǎn)修飾后產(chǎn)物的熔融溫度上升了15.85℃，而MEA點(diǎn)修飾降低了產(chǎn)物的熔融溫度（97.51±2.87）℃。此外，Gly-O-Et和MEA點(diǎn)修飾產(chǎn)物的焓變顯著高于EXTs與EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物，這表明MEA點(diǎn)修飾降低了產(chǎn)物熔融變化及伸展蛋白結(jié)構(gòu)所消耗的能量，使得它最易分散從而獲得膠體特性，其次是Gly-O-Et點(diǎn)修飾產(chǎn)物，而EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物最難實(shí)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)的展開。Ramirez-Suarez等[24]用差示掃描量熱儀對(duì)面團(tuán)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因?yàn)镸TGase使面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，進(jìn)而增加了面筋蛋白的轉(zhuǎn)變焓，故蛋白質(zhì)在熱變形過程中斷開共價(jià)交聯(lián)所需要的熱量而增加。

2.3.2 粒徑、電位分析 蛋白微粒會(huì)隨著pH值的變化而變化，最終在其等電點(diǎn)pI處聚集沉淀，破壞了此前的均勻分散體系，導(dǎo)致不能測(cè)定其粒徑（d，nm）和分散系數(shù)（Particle dispersion index，PDI）。因此，本試驗(yàn)設(shè)定不同pH值（從酸到堿）來探究不同氨基供體點(diǎn)修飾后對(duì)EXTs粒徑、PDI和電位的影響。

表5 點(diǎn)修飾對(duì)粒徑的影響Table5 Effect of cross-linking on micro particle radius

由表5可知，空白組及其點(diǎn)修飾產(chǎn)物的粒徑在 pH 5.34～6.96時(shí)均不可測(cè)。當(dāng) pH=3.31時(shí)，EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物的粒徑最大，而MEA點(diǎn)修飾產(chǎn)物的粒徑最小。當(dāng)pH值提高至8.01時(shí)，3種氨基供體點(diǎn)修飾后均顯著增大了EXTs的粒徑，其中EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物粒徑最大，而3組點(diǎn)修飾產(chǎn)物間無顯著差異。這表明小麥醇溶蛋白粗提物在與MEA發(fā)生點(diǎn)修飾反應(yīng)后，其微粒粒徑由堿性條件下最小轉(zhuǎn)變?yōu)樵谒嵝詶l件下最小。

表6 點(diǎn)修飾對(duì)PDI的影響Table6 Effect of cross-linking on PDI

由表6可知，當(dāng)pH 4.31時(shí)，EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物的PDI迅速增大，且遠(yuǎn)高于Gly-O-Et、MEA點(diǎn)修飾產(chǎn)物及空白組。隨著溶液體系變?yōu)槿鯄A性（pH 8.01）時(shí)，EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物的PDI依然顯著高于其它3組。這表明，EACA點(diǎn)修飾顯著擴(kuò)大了EXTs的pI范圍。

由表7可知，在pH=3.31和pH=8.01時(shí)，EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物的電位均顯著小于Gly-O-Et、MEA點(diǎn)修飾產(chǎn)物以及空白組，這表明EACA點(diǎn)修飾后會(huì)削弱底物的靜電排斥作用，影響其pI，從而降低產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性。在相應(yīng)的酸性條件下，MEA點(diǎn)修飾產(chǎn)物電位顯著小于空白組，而在堿性條件下，其電位與空白組無顯著差異，這說明引入羧基可能并不會(huì)增加，甚至可能減弱了底物的靜電相互作用。

表7 點(diǎn)修飾對(duì)電位的影響Table7 Effect of cross-linking on Zeta-ζ，Zeta-ζrefers to Zeta-potential

2.3.3 接觸角測(cè)定 三相接觸角（θ）是衡量顆粒表面潤濕性的直觀數(shù)據(jù)，是制備Pickering乳液固體微粒的重要指標(biāo)。當(dāng)θ≈90°時(shí)，顆粒吸附能最大，對(duì)應(yīng)Pickering乳液最穩(wěn)定[25-26]。由圖3可知，3種氨基供體點(diǎn)修飾后，產(chǎn)物的接觸角均顯著增大，且EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物的接觸角最大，高達(dá)（91.77±1.42）°，其次是MEA、Gly-O-Et。這表明與 Gly-OEt和MEA相比，EACA點(diǎn)修飾反應(yīng)有效改善了小麥醇溶蛋白粗提物顆粒的表面潤濕性，這種差異出現(xiàn)的原因可能是EACA在MTGase催化的點(diǎn)修飾反應(yīng)過程中隨機(jī)地或有選擇性地與一些親水或疏水性蛋白片段位點(diǎn)結(jié)合，從而直接影響了產(chǎn)物的親水或疏水性。

圖3 點(diǎn)修飾對(duì)接觸角的影響Fig.3 Effect of cross-linking on contact angles

3 結(jié)論

通過乙醇提取法和等電點(diǎn)沉淀法相結(jié)合并輔以超聲處理的方法，得到小麥醇溶蛋白最優(yōu)的提取結(jié)果：添加60%乙醇和5mmol/L檸檬酸緩沖液，并超聲29.67min。以提取獲得的小麥醇溶蛋白粗提物為底物，利用胃蛋白酶進(jìn)行水解，以水解不同時(shí)間的粗提物為底物，進(jìn)行MTGase點(diǎn)修飾反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gly-O-Et與未水解EXTs微粒懸濁體系點(diǎn)修飾反應(yīng)2 h時(shí)，對(duì)應(yīng)產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性顯著提高；EACA與未水解產(chǎn)物點(diǎn)修飾4 h時(shí)，對(duì)應(yīng)乳化穩(wěn)定性相對(duì)較高；MEA與未水解產(chǎn)物交聯(lián)2 h時(shí)的產(chǎn)物其乳化穩(wěn)定性最好。

受水解時(shí)間、氨基供體和點(diǎn)修飾時(shí)間的影響，點(diǎn)修飾對(duì)水解粗提物的乳化穩(wěn)定性影響較為復(fù)雜。然而，點(diǎn)修飾對(duì)粗提物乳化穩(wěn)定性的影響小于水解時(shí)間的影響。同時(shí)，受?；w基團(tuán)的不同，點(diǎn)修飾反應(yīng)前、后粗提物的熱穩(wěn)定性不同，對(duì)粗提物的粒徑和電位造成的影響有限，而基于吸附能和三相接觸角的關(guān)系，EACA點(diǎn)修飾產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的乳液符合制備Pickering固體微粒的要求。

本研究以小麥醇溶蛋白粗提物及其酶解產(chǎn)物為底物，利用3種不同氨基供體調(diào)控MTGase進(jìn)行點(diǎn)修飾改性來提高其乳化穩(wěn)定性，并從多角度探究點(diǎn)修飾對(duì)EXTs物理化學(xué)特性的影響，為擴(kuò)大小麥醇溶蛋白在食品工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供一定的論據(jù)。