韋棋，蘇福海

(中國計量科學研究院，北京 100029)

芬太尼作為麻醉輔助用藥，因其具有起效快，持續(xù)時間短，鎮(zhèn)痛作用強等特點，自上個世紀60 年代以來，被廣泛應用于外科手術中。但作為一種阿片類藥物，芬太尼可以激活人體內的阿片受體，具有興奮和刺激作用，有較強的成癮性和耐受性。由于其具有類似海洛因的作用，作為藥品的芬太尼在一些國家被用于吸毒，芬太尼濫用現(xiàn)象也隨之出現(xiàn)。早在1964 年，聯(lián)合國毒品和犯罪問題辦公室就將其列為國際管制藥品。2019 年4 月1 日，我國發(fā)布了關于將芬太尼類物質列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》的公告，將25 種芬太尼類物質列為管制藥品。目前芬太尼濫用現(xiàn)象已成為世界性的公共衛(wèi)生問題，芬太尼的濫用不僅會對人體造成傷害，甚至會導致死亡，成人致死劑量僅為幾毫克［1］。從1970 年代卡芬太尼進入市場，至2010年，僅發(fā)生了幾起芬太尼類物質濫用事件，但2013年至2014 年，與芬太尼類物質相關的死亡人數(shù)增長了426%［2］。至2015 年，據(jù)美國疾病控制中心的報告，在33 091 例阿片類藥物死亡中，約有30%是由于芬太尼類物質造成的［3］。芬太尼濫用現(xiàn)象屢禁不止的原因之一在于芬太尼類物質人工合成方法簡單便捷，通過對芬太尼結構中的苯基烷基、丙?；?，尤其是4-哌啶基環(huán)進行修飾，可以衍生出許多新的芬太尼類似物，這些物質大多保留了芬太尼的原有效力或者藥效更強［4］。其中應用較普遍的有呋喃基芬太尼、β-羥基硫代芬太尼和戊?；姨岬龋?］。截至2016 年底，我國共出現(xiàn)了66 種芬太尼類物質［6］。此外芬太尼類物質藥效比海洛因強，但價格低廉，用量小，便于運輸，這些特點使其成為了新一代新型精神活性物質。因此建立高靈敏度、高選擇性和高準確度的芬太尼類物質分析檢測方法具有重要意義。筆者對近年來生物樣品中芬太尼類物質檢測技術研究進展進行綜述，旨在為生物樣品中芬太尼類物質檢測技術相關研究提供參考。

1 檢測方法

1.1 液相色譜–質譜聯(lián)用(LC–MS)法

LC–MS 法具有高靈敏度、高通量、分析速度快、應用范圍廣等特點，可以對生物基質中芬太尼類物質及其代謝物同時進行檢測分析。芬太尼類物質極性強，揮發(fā)度低，相對分子質量大，具有熱不穩(wěn)定性，是較復雜的分析體系，因而LC–MS 法成為當今研究芬太尼類物質應用較普遍的分析方法。

FERNáNDEZ 等［7］建立了超高效液相色譜–串聯(lián)質譜法分析頭發(fā)中16 種合成阿片類藥物。頭發(fā)樣品經(jīng)二氯甲烷、甲醇和水洗滌，室溫下干燥后剪成長度為1 cm 的碎屑，用球磨機研磨成粉末，加入16 ng／mL 的芬太尼-d5 內標溶液25 mL 與1 mL 甲醇，將樣品溶液在45℃下孵育4 h，然后在14 000 r／min 下離心10 min，收集上清液，濃縮至約100 μL，加入0.1 mol／L 的乙酸鈉緩沖溶液2.5 mL，通過固相萃取法萃取樣品，萃取柱用1.0 mL 甲醇，1.0 mL 水和1.0 mL 0.1 mol／L 乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.0)預處理，上樣后，用1 mL 0.1 mol／L 鹽酸和1 mL 甲醇洗滌，以消除潛在的干擾，最后用1.0 mL 甲醇–氨水溶液(體積比為95∶5)洗脫，收集洗脫液并濃縮至300 μL 進樣分析。該方法首次在頭發(fā)樣品中定量檢測出了AH–7921、丙烯芬太尼、巴豆酰芬太尼、U-49900、戊酰芬太尼、4-氟異丁酰芬太尼、四氫呋喃芬太尼，樣品提取效率大于74%。SALOMONE 等［8］建立了一種簡單、快速、高特異性和高靈敏度的UHPLC–MS／MS 分析34 個頭發(fā)樣品的方法，檢測出13 種合成阿片類物質(包括芬太尼類似物)及其代謝物。該方法基質效應小，選擇性較好，檢出限為0.1～1.5 pg／mg，定量限為0.3～4.5 pg／mg，方法靈敏度較高。在該項研究中，研究人員還在芬太尼和呋喃基–芬太尼陽性樣品中檢測出4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)，首次證明了4-ANPP 可以被選作芬太尼類似物的標記物，研究人員指出，4-ANPP 與去甲芬太尼的比例將有助于推測分析對象服用芬太尼類物質的情況。

ADAMOWICZ 等［9］開發(fā)了一種液相色譜–串聯(lián)質譜方法，用于快速、靈敏地檢測全血中的芬太尼類似物及其它新的合成類阿片受體激動劑，可以對43 種阿片類藥物(包括38 種芬太尼類物質)進行快速定性篩選分析。該方法采用核–殼型顆粒色譜柱，通過梯度洗脫程序，所有分析物在13 min內實現(xiàn)了分離，基于動態(tài)多反應監(jiān)測模式(MRM)，共監(jiān)測了132 個MRM 離子對，大多數(shù)化合物的保留時間均可以很好地區(qū)分，選擇性較好，檢出限為0.01～0.20 ng／mL，靈敏度較高，不足之處在于該方法無法實現(xiàn)對某些異構體的分離。STRAYER 等［10］采用固相萃取法萃取樣品，以3.0 mL 甲醇，3.0 mL水和4.0 mL 磷酸緩沖鹽溶液(pH=6.0)預處理萃取柱，將校準樣、對照品和樣品用3.0 mL 水、1.0 mL 1.0 mol／L 乙酸和3.0 mL 甲醇洗滌，以消除潛在的干擾，最后用3.0 mL 二氯甲烷–異丙醇–氫氧化銨(體積比為78∶20∶2)溶液洗脫，收集洗脫液，于40℃空氣流中蒸發(fā)干燥，加入100.0 μL 甲醇復溶，然后采用LC–MS／MS 進行分析。該方法操作便捷，分離速度快，回收率較高，在低、中、高3 個加標濃度水平時的回收率分別為(84±19)%、(78±12)%和(94±4.1)%。QIN 等［11］將100 μL 全血樣品與10 μL 質量濃度為100 ng／mL 的IS 溶液(芬太尼-d5和諾芬太尼-d5 的甲醇溶液)混合均勻，渦旋振蕩15 s 后，分別加入0.7 mL 乙酸乙酯和100 μL 緩沖液(pH=9.2)，渦旋30 s，然后離心5 min，收集有機層，并于40℃空氣流中蒸發(fā)干燥，渦旋振蕩并離心后，加入200.0 μL MPA 溶液(20 mmol／L 乙酸銨溶液、5%乙腈溶液和0.1%甲酸溶液的混合溶液)復溶，將上清液直接注入UPLC–MS／MS 系統(tǒng)進行分析。該方法采用液–液萃取法提取凈化血液樣品，樣品制備簡單快速，價格相對低廉，運行時間快(8min)，所需全血量較少(約100 μL)，檢出限為0.005 ng／mL。

WANG 等［12］采用液相色譜–常壓電離串聯(lián)質譜法分析人類尿液中的13 種芬太尼類物質和2 種代謝物，該方法采用固相萃取法萃取尿液樣品，采用6 種同位素標記的內標物，方法檢測限為3～27 pg／mL，具有良好的準確度和精密度，可用于快速，靈敏地篩查人類尿液中芬太尼及其代謝物。PATTON 等［13］采用LC–MS／MS 法測定人類尿液中乙酰基去甲芬太尼，該方法將SPE 與LC–MS／MS 耦合，先用β-葡萄糖醛酸苷酶處理分析物，然后用310 μL 含有β-葡萄糖醛酸苷酶的濃度為0.1 mol／L 的乙酸鈉緩沖溶液(pH=5.0)稀釋尿液樣品，加入10 μL 內標溶液，并于37℃下孵育60 min。將混合溶液加載到Strata-X 33u 聚合物強陽離子交換固相萃取柱上(30 mg／3 mL)，并用1 mL 濃度為0.1%的甲酸水溶液和1 mL 水–甲醇溶液(體積比為70∶30)洗滌，用0.5 mL 堿性甲醇–乙腈溶液(體積比為50∶50，含有2%氫氧化銨)洗脫2 次，收集洗脫液，并于60℃氮氣流中蒸發(fā)干燥，然后將分析物用混合溶液重新溶解，進樣分析，混合溶液由A、B 兩組分組成（體積比為1∶1），A 為含有85%的10 mmol／L 甲酸銨水溶液和15%的含有0.1%甲酸的甲醇溶液，B 為乙腈。該方法線性關系良好 (r2＞0.99)，精密度較高(RSD ＜5%)，但檢測限較高，僅達到1 ng／mL，靈敏度較低。

CRAIG 等［14］采用LC–MS／MS 法測定干血點中13 種芬太尼類物質和4 種代謝物。該方法樣品制備簡單，易于檢測新出現(xiàn)的芬太尼類物質，可用于現(xiàn)場快速檢測。KAHL 等［15］采用超高效液相色譜–串聯(lián)質譜法分析生物體液和組織中的芬太尼類物質。在均質的肝和腦組織中加入4 mL 濃度為0.1 mol／L 的磷酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)和50 μL 濃度為80 ng／mL 的內標溶液(β-羥基硫代芬太尼-d5、乙酰芬太尼-c6、芬太尼-d5、呋喃芬太尼-d5 和丁芬太尼-d5)，將樣品溶液渦旋，靜置，離心后通過正壓固相萃取法萃取樣品，將色譜柱用3 mL 甲醇、3 mL去離子水和1 mL 濃度為0.1 mol／L 的磷酸鈉緩沖液(pH=6)預處理，取上清液上樣。然后用3 mL 去離子水和1 mL 濃度為1 mol／L 的乙酸沖洗，以消除潛在的干擾，并在0.8 MPa 下干燥5 min。然后用2 mL 己烷、2 mL 己烷–乙酸乙酯溶液(體積比為50∶50)和3 mL 甲醇沖洗，并在0.8 MPa 下干燥3 min。最后用3 mL 二氯甲烷–異丙醇–氫氧化銨(體積比為78∶20∶2)混合溶液洗脫，收集洗脫液，于40℃氮氣流中蒸發(fā)干燥，加入50 μL 的0.1%甲酸水溶液復溶，注入UHPLC–MS／MS 分析。該方法準確度和精密度符合分析要求，特異性高，可以鑒別出對異丁酰基／丁酰基芬太尼和對氟異丁?；瘜Ψ□；姨岬犬悩嬻w，適用于法醫(yī)毒理學領域的篩選分析。

1.2 氣相色譜質譜聯(lián)用(GC–MS)法

GC–MS 法因其高靈敏度，高分辨率，高選擇性特點，已成為法醫(yī)毒理學和興奮劑分析中鑒定精神藥物的重要分析方法之一。采用GC–MS 方法測定高沸點，具有熱不穩(wěn)定性和腐蝕性的芬太尼類物質時，樣品需要進行衍生化等前處理，操作繁瑣，不利于快速檢測，且可能存在假陰性或假陽性結果，因此在實際應用中應注意對可疑樣品進行進一步確認。

STRANO 等［16］采用GC–MS 法同時檢測人體尿液中芬太尼類物質及其代謝物，采用短氣相色譜柱在6 min 內即可完成色譜分離，采用SIM 數(shù)據(jù)采集模式，結果準確度和重復性較好(RSD ＜15%)，分析成本低。但芬太尼類物質檢測限高達2 ng／mL，靈敏度較低，實際應用中可能會存在漏檢的情況。

1.3 免疫分析法

免疫化學分析法是用于篩選生物樣品中濫用藥物的常用方法，包括酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、酶免疫試驗法(EMIT)、熒光偏振免疫測定法等。免疫化學分析法是根據(jù)抗原和抗體的特異性結合進行測定，用以檢測不同類別的分析物，分析成本較高。由于某些芬太尼類似物或代謝物可能無法與免疫分析法發(fā)生交叉反應，從而無法鑒定出某些芬太尼類似物抗體數(shù)量，使其應用受到限制［17］。此外免疫分析法不能提供有關分析物的結構信息，還有可能會導致假陽性結果，因此隨著其它高靈敏度儀器的出現(xiàn)與發(fā)展，光譜技術聯(lián)用如GC–MS 和LC–MS 等方法已經(jīng)逐漸取代免疫分析方法。

WANG 等［18］采用自動均相酶聯(lián)免疫測定分析法，對來自急診科患者的尿液樣品進行了篩選分析，并采用LC–HRMS 對陽性樣品進行定性分析，使用LC–MS／MS 進行定量分析。結果發(fā)現(xiàn)，乙酰芬太尼、利培酮和9-羥基利培酮與芬太尼免疫測定法發(fā)生交叉反應，免疫測定法對部分尿液的診斷敏感性為100%，但觀察到7 個假陽性樣品，因此特異性僅為86%。應用免疫化學分析法，應對所有篩查呈陽性的樣品進行確認試驗。

1.4 其它方法

KAMMER 等［19］建立了基于適體的FSA–CIR方法，結合高親和力的DNA 適體探針，實現(xiàn)高靈敏度定量檢測阿片類藥物。FSA 的獨特之處在于它對基質不敏感，可減少基質干擾；CIR 的優(yōu)點在于可以同時測量測試樣品和參比樣品，可提高通量以及干涉儀的獨特功能。結果顯示，采用FSA–CIR 法測定阿片類物質的定量限比LC–MS／MS 法高5 至275 倍，比EMIT 法高約50 至1 000 倍。該方法儀器體積小，靈敏度高，分析速度快，可實現(xiàn)藥代動力學分析，可在樣品濃度低時以高靈敏度、無創(chuàng)地快速定量檢測阿片類藥物。MISHRA 等［20］采用穿戴式微針傳感器陣列，在單個貼片平臺上以微創(chuàng)方式對阿片類藥物和有機磷酸酯神經(jīng)毒劑進行連續(xù)電化學檢測，該方法能夠通過基于納米材料的多層表面結構連續(xù)監(jiān)測芬太尼直至納摩爾水平，不僅可以檢測芬太尼，還可以檢測其代謝產(chǎn)物(主要是去甲芬太尼)。同時基于其獨特的氧化還原特性并根據(jù)不同的電位來測量嗎啡和去甲芬太尼，可用于嗎啡和阿片類藥物的篩選，具有高靈敏度、高選擇性和良好的穩(wěn)定性。

2 生物檢材

2.1 頭發(fā)

頭發(fā)是一種常用的生物檢材，具有采集方便，容易保存，檢測窗口長和無損非侵入性等特點。血液分析和尿液分析可提供與藥物成癮有關的短期信息，而長期的病史需要通過頭發(fā)分析來追溯。頭發(fā)分析可提供藥物成癮史或藥物毒性的相關信息，對于新的精神活性物質的分析，頭發(fā)測試是尿液測試的良好輔助［21］。給藥后，藥物會通過各種機制沉積在頭發(fā)中，與其它生物樣品相比，沉積的藥物非常穩(wěn)定，可以在更長的時間后進行檢測。此外分段分析可以通過利用敏感的分析技術反映給藥時間和給藥情況，包括多次或單次給藥，單獨或同時服用某些藥物。但藥物沉積的機制受到許多因素的影響，如頭發(fā)色素沉著與沉積的藥物濃度之間存在聯(lián)系。研究表明，黑發(fā)的藥物濃度最高，而白發(fā)的藥物濃度最低。藥物的沉積情況還與其結構有關，研究人員采用熒光顯微鏡研究藥物與頭發(fā)的結合力，發(fā)現(xiàn)帶負電荷的藥物，如四氫大麻酸(THC–COOH)很難進入頭發(fā)中［22］。盡管藥物在頭發(fā)中非常穩(wěn)定，但進行染發(fā)燙發(fā)等頭發(fā)護理可能會影響測定結果［23］，頭發(fā)的清潔程度也會影響檢測結果的準確度。由于受到個體差異，如頭發(fā)生長周期及速度不同，頭發(fā)采集部位、藥物代謝等因素的影響也會導致檢測結果重現(xiàn)性較差，而且以頭發(fā)作為樣品進行分析時還存在藥物提取較復雜、耗時長、分析成本高等缺點。

2.2 血液

血液樣品常用于檢測分析芬太尼類物質的含量，具有檢測技術成熟、血漿中藥物濃度較大且較恒定、結果準確度和精密度高等優(yōu)點。但血液檢測的影響因素較多，如采樣、血液的保存、基質干擾等，因此對實驗人員的操作技術、樣品前處理技術和儀器的靈敏度等要求較高。

2.3 尿液

由于具有準確性和可靠性高、無損及非侵入性、分析成本低等特點，使得尿液檢測成為分析阿片類藥物的常用分析方法之一［24］。PALAMAR［25］通過對532 名過去一個月使用過海洛因或阿片類藥物的成年人進行尿液測試和頭發(fā)測試，發(fā)現(xiàn)雖然頭發(fā)檢測的檢測窗口更寬，檢測時限更長，但短期內尿液檢測的效果更好。在戒毒過程中，監(jiān)控方式之一是對戒毒人員定期進行尿液檢測。研究表明，在尿液樣本中對芬太尼類物質的代謝物進行檢測分析，可以延長檢測時間至暴露后96 h，延長尿液檢測的檢測時限，可以增加對真實暴露樣本的陽性識別率［26］。但由于芬太尼類物質結構相似，代謝途徑相同，許多芬太尼類物質具有相同的代謝物，如去甲芬太尼是α-甲基芬太尼、β-羥基硫代芬太尼和芬太尼的代謝產(chǎn)物［27–28］，因此對代謝物的檢測并不能確定母體藥物，給芬太尼類物質的分析鑒定帶來了一定挑戰(zhàn)。

2.4 其它檢材

芬太尼類物質檢測常用的生物檢材還有干血點和組織等。干血點分析可以簡化分析步驟，不需要對樣品進行前處理［29］，可以對極少量樣品進行分析，具有分析物穩(wěn)定，樣品儲存簡單，運輸方便，分析過程中無感染風險等特點，但對分析儀器和檢測方法的靈敏度要求較高。

生物樣品成分復雜，干擾物眾多，生物樣品中芬太尼類物質的定性和定量分析存在較大困難，單一的分析檢測方法已無法滿足檢測要求，需要采用多種儀器綜合分析和各種聯(lián)用技術分析。檢測人體中的芬太尼類物質可以通過血液、尿液、頭發(fā)和組織等進行檢測。單一的生物檢材不能提供全面的信息，實際應用中需要結合各種不同的生物檢材進行分析，才能獲取準確可靠的信息。由于芬太尼類物質的低劑量、高效能特點，生物基質中芬太尼類物質濃度普遍較低，從而對分析檢測方法的靈敏度提出了挑戰(zhàn)，一般檢出限要求低于1 ng／mL，通常低于0.1 ng／mL［30］，要求分析檢測方法具有高靈敏度。此外“芬太尼家族”的不斷更新，出現(xiàn)了許多結構相似的類似物和結構異構體，給芬太尼類物質的鑒別和定量分析帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)，要求相關的分析檢測方法必須靈活且定時更新，具有高分辨率和高特異性以區(qū)別各種芬太尼類似物及其異構體。

3 展望

3.1 樣品前處理技術發(fā)展

樣品前處理是生物樣品中芬太尼類物質分析中的重要步驟，也是分析過程中最耗時耗力的環(huán)節(jié)之一。生物樣品中芬太尼類物質分析的前處理技術一般采用固相萃取、液液萃取、蛋白沉淀等傳統(tǒng)方法，處理過程繁瑣費時，需用大量有機溶劑，存在安全隱患，且污染環(huán)境。樣品前處理技術未來發(fā)展趨勢主要集中在實現(xiàn)樣品前處理過程的自動化和減少樣品和溶劑的用量，以提高分析速度，避免操作失誤，減少環(huán)境污染，降低分析成本。近年來，人們開發(fā)了許多新的萃取技術以取代傳統(tǒng)的萃取方法，如固相微萃取法、液相微萃取法、微珠萃取法、半微量液–液萃取法、分散固相萃取法(dSPE)、鹽析輔助液–液萃取法(SALLE)、分散液–液微萃取(DLLME)法、超臨界流體萃取法、磁性納米顆粒、分子印跡聚合物等新型處理技術［31–35］。這些方法具有自動化程度高、分析速度快、有機溶劑用量少、對環(huán)境友好等優(yōu)點，有望成為未來研究生物樣品中芬太尼類物質的新型樣品前處理技術。

3.2 檢測技術發(fā)展

多種儀器結合和各種聯(lián)用技術綜合分析是生物樣品中芬太尼類物質分析的新趨勢。質譜因其高分辨率，高選擇性的特點，是法醫(yī)毒理學和興奮劑分析中鑒定違禁藥物的重要分析工具之一。質譜儀與氣相色譜、液相色譜等儀器聯(lián)用，如GC–MS，LC–MS，MS／MS，CE–MS 和FTIR–MS 等，用于分離和檢測復雜化合物的各種組分，具有強大的分離和定性定量能力，在毒品分析檢測方面具有極大的優(yōu)勢。其中MS／MS 將多個質譜串聯(lián)在一起，充分利用質譜的分離與分析功能，可以簡化試樣的預處理過程，適于分析復雜化合物，定量分析多個化合物，在檢測生物樣品中的違禁藥物方面具有極大的優(yōu)越性。MS／MS 多與GC 和LC 聯(lián)用，GC–MS／MS 和LC–MS／MS 具有高靈敏度和高特異性，對芬太尼類物質的分析檢測具有獨特優(yōu)勢。隨著科學技術的不斷發(fā)展，GC–MS／MS 和LC–MS／MS 與SPME 等新型樣品制備技術相結合，將在芬太尼類物質的分析中發(fā)揮更大的作用。

此外，傳統(tǒng)的分析檢測方法一般只適用于實驗室分析，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測和原位實時分析，需要深入研究新型便攜式分析儀器，加快其向便攜式、微型化、經(jīng)濟化、智能化發(fā)展，以適應現(xiàn)場分析的發(fā)展趨勢。SARAH［36］將碳和氯化銀電極絲網(wǎng)印刷到聚對苯二甲酸乙二醇酯上，用離子液體處理碳電極，開發(fā)了一種電化學傳感器現(xiàn)場檢測芬太尼的方法，該方法僅需1 min 即可識別出芬太尼藥物。此外ABRAHAMSSON［37］開發(fā)了磁懸浮法(MagLev)，可以實現(xiàn)阿片類物質的快速分析，該裝置能夠根據(jù)密度分離違禁藥物(可卡因、甲基苯丙胺、海洛因、芬太尼及其類似物)，摻假劑和稀釋劑的粉末混合物，并可以鑒定各成分，樣品量低至50 mg。該裝置具有便攜式和操作簡便的特點，分離迅速，與FTIR–ATR、拉曼光譜或質譜法聯(lián)用，可提高其靈敏度和定性能力。MORATO［38］開發(fā)了一種新的接觸噴霧質譜法測定溶液中的30 種違禁藥物，利用單個基材進行樣品收集和直接分析，無需樣品預處理即可分析液體樣品，分析時間小于2 min，樣品量低至10 μL，具有靈敏度較高以及無創(chuàng)的特點，未來有望應用于臨床或法醫(yī)環(huán)境中的即時檢測。