潘韻錚，胡洋，李慶菊，蔣寶平，許立

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗，江蘇南京 210023）

2014 年，美國胃腸病學會發(fā)布的《藥物性肝損傷診斷和治療新版指南》中將藥物性肝損傷（druginduced liver injury，DILI）分為固有型DILI 和特異質型DILI（idiosyncratic DILI，IDILI）［1］。固有型DILI具有可預測、潛伏期短和有明顯的劑量依賴性等特點，而IDILI 則不表現(xiàn)出簡單的劑量依賴性，但它可能與患者的性別、年齡、基因和基礎疾病等存在某種關系，潛伏期長且不穩(wěn)定，具有難以預測的特點［2］。近年來，有關化學藥和中草藥導致IDILI的報道在增加，不少已經(jīng)獲得批準的藥物因IDILI而從市場上撤回或受到“黑框”警告，這不僅提高了制藥企業(yè)研發(fā)新藥的成本，還增加了臨床用藥的風險。因此，預測藥物發(fā)生IDILI 的風險，發(fā)現(xiàn)新的IDILI 生物標志物，建立高效、準確的IDILI 評價模型已經(jīng)成為藥物研發(fā)中的熱點。本文主要對IDILI 的發(fā)生機制假說、預測IDILI 的生物標志物以及IDILI 的評價模型進行綜述，以期為IDILI 的機制研究、風險藥物的篩選和臨床相關疾病的治療提供參考。

1 特異質型藥物性肝損傷發(fā)生機制

IDILI發(fā)生機制十分復雜，目前研究主要從代謝和免疫2個方面提出了IDILI發(fā)生機制的一些假說，并將IDILl劃分為代謝IDILI和免疫IDILI［3］。

1.1 肝代謝功能障礙假說

目前研究證實，很多藥物導致的肝損傷是由肝代謝功能障礙引起的，肝代謝能力降低可導致原形藥物在肝中積累而誘發(fā)肝損傷；相反，代謝能力增強可導致活性代謝物的形成，某些活性代謝物可以與蛋白質共價結合，從而干擾蛋白質功能并啟動細胞死亡［4］。由于遺傳因素和環(huán)境因素的影響，藥物在個體間的肝代謝能力存在差異性［5］。此外，個體間活性代謝物失活能力的差異可以影響這些代謝物的毒性潛能。所以有充分的理由認為，藥物代謝和轉運的個體差異在IDILI 中發(fā)揮著重要作用。事實上，這已經(jīng)成為解釋IDILI的一種流行假說。

藥物在肝中的代謝分為Ⅰ相和Ⅱ相2個反應階段，其中Ⅰ相代謝發(fā)生氧化、還原和水解反應，Ⅱ相代謝發(fā)生結合反應［6］。研究發(fā)現(xiàn)，雙氯芬酸導致的IDILI與編碼Ⅰ相代謝酶細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）和Ⅱ相代謝酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）的基因多態(tài)性有關，代謝酶的多態(tài)性使個體更容易形成或積累雙氯芬酸活性代謝物［7］。雙氯芬酸活性代謝物可能與肝內(nèi)蛋白質結合形成加合物使易感患者產(chǎn)生肝損傷［8］。除代謝酶，肝中的轉運蛋白也參與許多藥物的代謝過程。近年來，研究人員基于細胞和動物模型已經(jīng)探索出幾種與IDILI 相關的藥物轉運體。例如，有機陰離子轉運蛋白和多藥耐藥相關蛋白2 參與了曲格列酮硫酸鹽在體外肝細胞中的積累；曲格列酮及其在膽汁中的硫酸鹽代謝物競爭性地抑制膽汁鹽輸出泵對膽汁酸的消除［9］；曲格列酮還可以抑制在夾層培養(yǎng)的人肝細胞中的膽汁鹽輸出泵［10］。由于這些轉運體對膽汁酸和膽紅素在肝細胞內(nèi)的分布具有重要作用，因此這些轉運體受到抑制可導致個體膽汁淤積和肝損傷。與藥物代謝相似，藥物誘導的肝膽轉運改變可能與其他因素共同作用，從而使個體對IDILI 易感。

1.2 炎癥應激假說

炎癥反應存在于多種疾病中，并且也是IDILI的主要癥狀之一。ROTH 等［11］首次提出了藥物與炎癥物質聯(lián)合應用導致機體肝損傷的炎癥應激假說，他研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）與雷尼替丁等藥物聯(lián)用可導致肝損傷。MENG 等［12］采用低劑量LPS造成大鼠炎癥應激模型，評價了何首烏的肝毒性，并發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物活化受體γ通路的異常抑制和相關炎癥因子過表達是何首烏致免疫性IDILI的誘因。SU等［13］發(fā)現(xiàn)了安全劑量的LPS與異煙肼聯(lián)用可引起大鼠肝損傷，觀察到大鼠肝組織中膽汁酸轉運蛋白、膽汁鹽輸出泵和多藥耐藥蛋白2 在基因和蛋白水平上的下調(diào)，并認為膽汁排泄障礙是異煙肼誘導肝毒性的主要原因。另有研究發(fā)現(xiàn)，用腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）代替LPS 與曲伐沙星聯(lián)用仍然可以誘導肝損傷［14］，提示炎癥因子在IDILI發(fā)生過程中起著重要作用。炎癥應激引起的IDILI 主要與患者機體存在炎癥環(huán)境相關，這提示患者在自身患有炎癥性疾病時，應盡量避免服用有IDILI風險的藥物。

1.3 半抗原假說

半抗原假說是指當藥物或其代謝產(chǎn)物與機體內(nèi)的蛋白共價結合形成藥物/代謝產(chǎn)物-蛋白加合物時，其作為半抗原可被抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APC）加工后被T細胞識別并誘發(fā)強烈的免疫反應［3］。目前在人類和動物模型上研究最廣泛的與半抗原假說有關的IDILI 藥物是氟烷。氟烷曾經(jīng)是一種被廣泛使用的麻醉劑，在使用該藥麻醉的患者中，約20%患者出現(xiàn)臨床上較為輕微的肝損傷，僅有極少數(shù)患者出現(xiàn)非常明顯的肝損傷，因而氟烷導致的肝損傷可能存在個體差異。在死于氟烷型肝損傷的患者中，肝損傷通常表現(xiàn)為小葉中心肝細胞壞死、脂肪變性和炎癥細胞增生［15］。研究發(fā)現(xiàn)，氟烷在肝中被CYP2E1 代謝為三氟乙酰氯，與肝中蛋白質或脂質形成加合物，這些加合物作為半抗原引發(fā)強烈的免疫反應導致肝損傷，并且在暴露于氟烷的動物模型上檢測到針對三氟乙酰氯-蛋白質加合物的抗體［16］。另外，雙氯酚酸和異煙肼也可以經(jīng)肝代謝后形成代謝產(chǎn)物-蛋白加合物誘導肝損傷［17］。除與肝蛋白相結合外，氟氯西林及其代謝產(chǎn)物5-羥甲氟氯西林可與血清白蛋白結合導致肝損傷［18］。藥物及其代謝產(chǎn)物與非肝蛋白結合導致肝損傷的機制還有待進一步研究。

1.4 危險因子假說

危險因子假說是指藥物或代謝產(chǎn)物及其加合物導致細胞損傷或應激反應，進而誘發(fā)損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）的釋放，DAMP 則激活APC 和免疫反應，誘導IDILI 的發(fā)生［3］。KATO 等［19］使用FLC-4 肝癌細胞與THP-1源巨噬細胞結合，評價奈韋拉平和阿莫地喹的IDILI 風險。結果發(fā)現(xiàn)，2 種藥物與FLC-4細胞孵育7 d后的上清液導致THP-1細胞炎癥小體的激活，認為IDILI風險藥物在肝細胞的活性代謝物可以引起危險因子DAMP的釋放，而DAMP的釋放可以激活巨噬細胞炎癥小體。免疫系統(tǒng)對抗原的識別主要由T 細胞受體（T cell receptor，TCR）介導的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）-肽段抗原識別通路（第一信號通路）和危險因子介導的APC 活化信號通路（第二信號通路）共同發(fā)揮作用［20］。藥物與蛋白質的共價結合可產(chǎn)生被特定T 細胞識別的新抗原，這向T 細胞傳遞了所謂的第一信號通路；DAMP 作為刺激因子誘導APC 表達CD80，CD86 和CD40 等共刺激因子，且這些共刺激因子提供第二信號通路。激活T細胞和免疫反應均需要上述2 種信號。因此，可以認為危險因子假說與半抗原假說是互補的。

1.5 免疫穩(wěn)態(tài)失衡假說

研究表明，臨床上大多數(shù)的IDILI 是免疫介導的。然而在許多IDILI 患者中，盡管繼續(xù)使用IDILI風險藥物治療，肝損傷的情況仍然可以消退，這表明肝的主要免疫反應是免疫耐受［21］。免疫穩(wěn)態(tài)失衡假說是指肝的免疫耐受因某種因素被破壞，使得肝對藥物的易感性增強，從而導致IDILI 的發(fā)生。MAK 等［22］使用細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）抗體治療的程序性死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）基因敲除小鼠建立一種免疫耐受受損的動物模型，評價了曲格列酮/吡格列酮和托卡朋/恩托卡朋2 組結構相似的藥物。通過血清生化指標和組織病理特征表明，曲格列酮和托卡朋分別與CTLA-4 抗體聯(lián)合治療可以引起PD-1基因敲除小鼠嚴重的肝損傷，而吡格列酮和恩托卡朋則未引起明顯的肝損傷。免疫穩(wěn)態(tài)的失衡主要與患者基礎疾病、體質和遺傳等因素有關，為降低IDILI 發(fā)生概率，臨床上應避免同時服用具有潛在IDILI風險的藥物和免疫調(diào)節(jié)類藥物。

1.6 人類白細胞抗原基因多態(tài)性假說

人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是人類MHC 的表達產(chǎn)物。HLA基因編碼人類MHC受體。根據(jù)其編碼分子結構可分為MHCⅠ類、MHCⅡ類和MHCⅢ類分子，其中MHC Ⅰ由HLA-A，HLA-B和HLA-C編碼，MHC Ⅱ由HLA-DP，HLA-DQ和HLA-DR編碼［23］。MHC Ⅰ位于一般細胞表面，可供CD8+T細胞識別啟動免疫反應；MHC Ⅱ位于APC上，輔助T細胞啟動免疫反應［24］。有研究報道，HLA等位基因的特異性與IDILI之間存在明顯的相關性［25］。奈韋拉平誘導的IDILI 與HLA-B＊35：05等位基因存在相關性［26］，氟氯西林誘導的膽汁淤積性IDILI 和HLA-B＊57：01等位基因存在相關性［27］，中藥何首烏誘導的IDILI 與HLA-B＊35：01等位基因相關［28］。特異性HLA基因與IDILI之間的相關性為其免疫機制提供了強有力的證據(jù)。然而，HLA基因多態(tài)性誘導IDILI 的相關機制尚不清楚。除HLA基因多態(tài)性，藥物代謝酶和解毒酶相關的基因多態(tài)性也可能與IDILI的發(fā)生相關。例如，曲格列酮誘導的IDILI 與谷胱甘肽S-轉移酶互補基因的無效突變相關［29］。

2 預測特異質型藥物性肝損傷的生物標志物

根據(jù)IDILI 的臨床特征，其主要分為3 種類型：肝細胞性肝損傷、膽汁淤積性肝損傷和自身免疫性肝炎［30］。預測IDILI 的理想的生物標志物應具有較強的靈敏性、穩(wěn)定性、組織特異性及個體關聯(lián)性，能夠反映IDILI的臨床特征和發(fā)展進程，并且檢測方法簡單便捷。谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）和谷草轉氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）是目前臨床上評價肝毒性最常用的生物標志物，并被視為預測和診斷肝損傷的“黃金標準”［31］。但由于非肝損傷或非藥物因素導致的肝損傷也可能引起其升高，如降血脂藥非諾貝特能通過激活啟動子顯著增加GPT基因表達，從而引起非病理性GPT升高［32］；長期以快餐食品為基礎飲食也會導致肝損傷而引起血清GPT和GOT水平上升［33］，這使其在預測IDILI 應用中受到一定限制。隨著研究的不斷深入，目前發(fā)現(xiàn)了能夠預測IDILI的生物標志物包括高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1）、角蛋白18（keratin-18，K18）和微RNA（microRNA，miRNA）等。

2.1 高遷移率族蛋白B1

HMGB1是存在于真核細胞中的一類與細胞核內(nèi)轉錄、DNA 修復和核小體組裝相關的非組核蛋白［34］。細胞核外的HMGB1 是重要的炎癥介質，它在多種疾病中可由死亡或受損的細胞被動釋放，參與細胞、組織的炎癥和壞死過程［35］。外分泌的HMGB1 可以與細胞膜上的Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）或晚期糖基化終產(chǎn)物受體（the receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）結合，從而通過募集免疫細胞和誘導細胞因子釋放來促進炎癥反應。DONG等［36］發(fā)現(xiàn)，大鼠ig給予雷公藤甲素溶液后，其血清和肝組織中的HMGB1 水平顯著升高，并且證實HMGB1-TLR4 介導的炎癥通路在雷公藤致大鼠肝損傷中發(fā)揮了重要作用。炎癥應激可引起IDILI，而HMGB1作為一種重要的炎癥介質在血漿中升高通常早于GPT，并且經(jīng)過修飾后高度乙?；投騺喰偷腍MGB1在血漿中可以穩(wěn)定存在［35，39］，對IDILI的嚴重程度和預后判斷有重要醫(yī)學價值。因此HMGB1可作為預測IDILI的生物標志物。

2.2 角蛋白18

中間絲是細胞骨架蛋白，角蛋白是其最大的亞家族蛋白，它主要以特定角蛋白對的形式表達于上皮細胞，具有維持上皮組織完整性和連續(xù)性的功能。K18 是在多種肝疾病患者Mallory-Denk 體中發(fā)現(xiàn)的磷酸化中間絲蛋白［37］。在細胞發(fā)生凋亡時，K18可以被胱天蛋白酶切割后釋放到外周血液循環(huán)中，并隨時間積累［38］。ANTOINE 等［39］結合組織學和蛋白組學技術，用對乙酰氨基酚誘導的肝毒性模型小鼠發(fā)現(xiàn)，血清中出現(xiàn)的胱天蛋白裂解K18（細胞凋亡指標）和全長K18（細胞壞死指標）與細胞死亡的組織學時間進程有較強的相關性。在肝細胞性肝損傷中，K18 對于細胞死亡的敏感性高于GPT，在GPT水平升高前即可顯著升高。因此，K18有望成為預測IDILI的生物標志物。

2.3 微RNA

miRNA 是一類在轉錄后調(diào)節(jié)基因表達水平的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。通常miRNA在體液中的含量相對穩(wěn)定，只有當器官受損時外周血液中的miRNA 含量才會增加［40］。近年來研究表明，部分miRNA 可以作為疾病和毒性的生物標志物。KIA等［41］使用對乙酰氨基酚和雙氯芬酸研究了miR-122作為藥物毒性的肝細胞富集生物標志物在人原發(fā)性肝細胞和肝癌細胞中的潛在應用，并比較了miR-122毒性試驗與傳統(tǒng)細胞毒性試驗在檢測藥物引起的肝細胞微擾方面的敏感性。結果表明，miR-122 可以作為藥物誘導的肝細胞毒性的敏感生物標志物。miRNA 作為藥物性肝損傷的生物標志物具有一定的優(yōu)勢。首先，血液中的miRNA 比GPT 等傳統(tǒng)生物標志物更敏感。研究發(fā)現(xiàn)，在藥源性肝損傷患者中，miR-122 的血清水平在剛發(fā)生肝損傷的患者中比恢復中的患者高110%，而GPT 的差異僅為3.5%。其次，研究發(fā)現(xiàn)，血液中的miRNA在檢測肝損傷方面比傳統(tǒng)生物標志物更具有器官特異性，有助于區(qū)分肝損傷和肝外器官損傷［42］?？傊琺iRNA的組織特異性和體液穩(wěn)定性等優(yōu)勢使其具有作為預測IDILI生物標志物的潛能。

3 特異質型藥物性肝損傷相關藥物的評價模型

預測藥物產(chǎn)生IDILI的風險，建立高效、準確的IDILI 評價模型已經(jīng)成為新藥研發(fā)中的熱點。近年來，基于IDILI發(fā)生的相關機制嘗試建立了一些用于評價和篩選IDILI風險藥物的體內(nèi)和體外模型。

3.1 炎癥應激模型

炎癥應激模型是基于炎癥應激的IDILI 發(fā)生機制假說所建立的，它是目前研究最廣泛的IDILI 模型。在體內(nèi)研究中，常使用低劑量的LPS造成動物輕度炎癥，然后施加藥物造成IDILI。目前炎癥應激的動物模型已成功應用于雙氯酚酸、雷尼替丁、氯丙嗪、曲伐沙星和三氟溴乙烷等IDILI風險藥物評價中。另外，炎癥應激模型還可以應用于體外藥物肝損傷的評價研究。HADI 等［43-44］利用小鼠和人的精密肝切片建立與炎癥應激相關IDILI 體外評價模型，通過這2種精密肝切片模型檢測出酮康唑、氯氮平、雙氯芬酸鈉和曲格列酮4 種IDILI 風險藥物與LPS 聯(lián)用表現(xiàn)明顯的肝毒性。COSGROVE 等［45］將LPS 及TNF-α、干擾素γ、白細胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）和IL-6 等細胞因子與不同藥物聯(lián)合應用，并在HepG2細胞和肝原代細胞上大規(guī)模成功篩選出具有IDILI 風險的藥物。炎癥應激模型由于其使用的LPS及細胞因子價格相對較低，造模方法簡單，且具有體內(nèi)和體外均適用的優(yōu)勢，因此該模型可用于大規(guī)模IDILI風險藥物的篩選。

3.2 免疫耐受抑制模型

免疫耐受抑制模型是基于免疫穩(wěn)態(tài)失衡的IDILI發(fā)生機制假說而建立的。癌癥化療的一個有希望的領域涉及免疫檢查點抑制劑的使用，它可以通過破壞免疫耐受促使免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞。通過使用免疫檢查點蛋白抑制劑可以建立一種與人類IDILI 非常相似的動物模型。METUSHI 等［46］發(fā)現(xiàn)，阿莫地喹可以導致PD-1基因敲除的雌性C57BL/6小鼠發(fā)生輕度的肝損傷，且這種損傷會逐漸消退。在此基礎上，課題組又給予PD-1基因敲除小鼠CTLA-4抗體同時抑制PD-1的表達和CTLA4蛋白活性，再給予阿莫地喹時則出現(xiàn)了嚴重的肝損傷。MAK等［47］用CTLA-4抗體預處理的PD-1基因敲除小鼠評價IDILI 風險藥物異煙肼和奈韋拉平的肝毒性。結果發(fā)現(xiàn)，這2 種風險藥物與免疫檢查點抑制劑同時使用會造成小鼠嚴重的肝損傷，說明削弱免疫耐受可能是揭示藥物引起IDILI 潛能的一種方法。然而，目前免疫耐受抑制模型僅僅局限于動物研究，該評價模型使用的造模方法比較復雜且價格昂貴。因此，該模型不適合用于大規(guī)模的IDILI風險藥物的篩選。

3.3 類器官培養(yǎng)評價模型

類器官是應用3D培養(yǎng)技術對器官祖細胞或干細胞在體外進行誘導分化形成的三維細胞復合體，在結構和功能上都類似于目標器官或組織［48］。LI 等［49］采用3D 類器官HepaRG 細胞體外評價模型，并結合高內(nèi)涵成像技術評價了肝毒性藥物胺碘酮、環(huán)孢素及陰性對照藥阿司匹林的毒性差異。GRANITZNY 等［50］建立HepG2 細胞與THP-1 單核細胞或巨噬細胞的共培養(yǎng)評價模型，在TNF-α 或LPS 存在下對具有IDILI 風險的曲格列酮、曲伐沙星、雙氯芬酸鈉和酮康唑4種藥物及其非IDILI的配體化合物進行了評價。結果發(fā)現(xiàn)，所有具有IDILI風險的藥物在TNF-α 或LPS 存在下誘導嚴重的肝細胞損傷，證實了肝細胞與免疫細胞之間的相互作用在IDILI 個體易感性改變中起著重要作用。與傳統(tǒng)2D 細胞培養(yǎng)模式相比，3D 培養(yǎng)的類器官改變了普通貼壁細胞間單純的物理接觸聯(lián)系，增強了細胞間的生物通信，提高了細胞內(nèi)藥物代謝相關酶、轉運體和白蛋白的水平，能更好地應用于模擬器官和組織的生理病理狀態(tài)［51］，因而在生物醫(yī)學研究和藥物安全性評價方面具有廣闊的應用前景。

4 結語

IDILI 的發(fā)生是一個綜合且復雜的過程，是藥物、機體和環(huán)境三者共同作用的結果，應綜合考慮多種因素的影響。近年來，隨著對IDILI 的研究深入，初步闡明了肝代謝功能障礙、炎癥應激、半抗原、危險因子、免疫穩(wěn)態(tài)失衡和基因多態(tài)性等有關IDILI 發(fā)生的機制假說，發(fā)現(xiàn)了HMGB1，K18 和miRNA 等可作為預測IDILI 的生物標志物。另外，研究人員也嘗試建立了炎癥應激、免疫耐受抑制和類器官培養(yǎng)等用于評價和篩選IDILI 風險藥物的體內(nèi)和體外模型。然而，對于IDILI的研究仍然不夠成熟，某些發(fā)生機制還停留在假說階段，缺少生物學實驗的驗證；一些評價模型由于成本高、操作復雜等缺點而不利于進行大規(guī)模的藥物篩選。因此，今后不僅需要加強IDILI發(fā)生機制和生物標志物的研究，還應重視預測并評價IDILI 高風險藥物，以降低IDILI對患者和制藥企業(yè)所帶來的損失。