翁宏飚，沈衛(wèi)鋒，牛寶龍

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021)

近年來，我國水產(chǎn)行業(yè)發(fā)展迅猛，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量多年居世界首位。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化水平的不斷提高，養(yǎng)殖水環(huán)境持續(xù)惡化，水產(chǎn)病害頻發(fā)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因水產(chǎn)病害造成的損失約占養(yǎng)殖總產(chǎn)量的10%，損失總額超過100億美元[1]。我國每年水產(chǎn)病害發(fā)病率達(dá)50%以上，疫病已成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。魚類疾病的防控措施主要有藥物防控、免疫預(yù)防、生態(tài)與綜合防控等手段。長期以來，我國水產(chǎn)疫病的控制主要依靠使用各種抗生素和化學(xué)藥物，但化學(xué)投入品的長期使用不僅會增加病原菌的耐藥性，同時(shí)也破壞了魚體及養(yǎng)殖環(huán)境微生態(tài)，導(dǎo)致水產(chǎn)品藥物殘留，嚴(yán)重制約著我國水產(chǎn)行業(yè)發(fā)展[2]。

免疫預(yù)防是控制水產(chǎn)動物病害較為有效的措施，通過刺激水產(chǎn)動物免疫系統(tǒng)，提高其抗病能力，從而降低疾病發(fā)生率，具有無殘留、無污染、不易引起耐藥性等特點(diǎn)。自1942年首次研制出防控硬頭鱒疫病的滅活口服疫苗，已研制出滅活菌苗、減毒菌苗、基因工程亞單位疫苗、DNA疫苗等多種水產(chǎn)疫苗。水產(chǎn)疫苗的接種方式主要包括注射、浸泡(噴霧)和口服3種，不同接種方式對免疫保護(hù)的誘導(dǎo)有重要影響，在實(shí)用性、成本與效益方面均有各自的優(yōu)點(diǎn)。本文就水產(chǎn)口服DNA疫苗的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨為研究安全、高效的新型口服疫苗提供一定的參考信息。

1 免疫機(jī)制

1.1 魚類口服疫苗免疫機(jī)制

與哺乳動物相比，研究者對硬骨魚類的口服免疫機(jī)制尚未完全了解。組織學(xué)觀察口服插管給藥后的熒光微粒在斑馬魚腸道中的分布發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入腸道的微?？杀荒c道快速吸收，并轉(zhuǎn)移到肝臟和胰臟的巨噬細(xì)胞中[3]。硬骨魚后腸上皮細(xì)胞內(nèi)存在大量巨噬細(xì)胞和與免疫相關(guān)的B細(xì)胞、T細(xì)胞，消化道壁附著的黏液中含有多種凝集素、黏蛋白、抗菌肽、毒素、免疫球蛋白等免疫相關(guān)因子[4]。經(jīng)口服給藥處理后，可在草魚、虹鱒等硬骨魚腸道黏膜組織中檢測到特異性抗體[5]，說明口服抗原可誘導(dǎo)硬骨魚的免疫反應(yīng)。免疫誘導(dǎo)后，硬骨魚可以產(chǎn)生IgM、IgD、IgT等多種免疫球蛋白[6]，其中IgT為硬骨魚特有的免疫球蛋白類型[7]。

多聚免疫球蛋白是黏膜防御的主要分子，其受體(pIgR)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)免疫球蛋白分子。哺乳動物中，pIgR主要在黏膜上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞中表達(dá)，由胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)及5個(gè)類免疫球蛋白域組成。免疫球蛋白與其受體結(jié)合后形成復(fù)合體，通過轉(zhuǎn)胞吞作用運(yùn)輸，在腸腔中或細(xì)胞內(nèi)中和病原體，并在機(jī)體免疫激活及免疫耐受誘導(dǎo)等方面有主要作用[8]。已有研究從河豚、虹鱒、大西洋鮭、牙鲆、斑馬魚、草魚等硬骨魚中分離獲得pIgR。與哺乳動物源受體序列相比，硬骨魚的pIgR少了3個(gè)類互補(bǔ)-決定域環(huán)和第5個(gè)類免疫球蛋白域(ILD5)[6]，這些截短受體可與IgT和IgM結(jié)合而發(fā)揮作用[9]。另外，在硬骨魚基因組中發(fā)現(xiàn)許多聚合物免疫球蛋白受體類似物(PIGRL)基因，這些基因可能在黏膜免疫中有不同的功能。Kortum等[10]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚2號染色體上包含1個(gè)由29個(gè)PIGRL基因組成的多基因簇，其中10個(gè)PIGRL基因編碼的蛋白可抑制膜結(jié)合受體。不同于聚合物免疫球蛋白(pIgR)與免疫球蛋白結(jié)合，PIGRL蛋白只與卵磷脂結(jié)合。細(xì)菌攻毒后可以誘導(dǎo)PIGRL基因表達(dá)上調(diào)，而病毒侵染后則抑制基因表達(dá)。大豆蛋白誘發(fā)草魚腸炎模型中，草魚腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞中，哺乳動物免疫耐受相關(guān)細(xì)胞因子的同源基因表達(dá)均顯著上調(diào)[11]。細(xì)菌攻毒虹鱒后，il1b、tnfa、ifng、il8和tgfb等細(xì)胞因子在前腸中的表達(dá)上調(diào)，而tgfb基因在后腸的表達(dá)卻顯著下調(diào)[12]，說明部分腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能。進(jìn)一步研究腸道調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，對研究硬骨魚口服免疫耐受機(jī)制有重要作用。

1.2 DNA疫苗免疫機(jī)制

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[13]。與此同時(shí)，來源于DNA疫苗質(zhì)粒的DNA基序、mRNA轉(zhuǎn)錄本或表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原都可激活機(jī)體天然免疫機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，空載體質(zhì)粒DNA可能誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)，細(xì)菌基因組DNA中常見的未甲基化CpG基序可被機(jī)體作為病原體相關(guān)分子模式加以識別，從而激活免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等，也可與類Toll受體結(jié)合，激活Th1通路[14]。疫苗質(zhì)粒的雙鏈DNA可被細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體識別，通過TANK結(jié)合激酶1介導(dǎo)，激活天然免疫系統(tǒng)，刺激機(jī)體干擾素的合成[15]。伴隨著Mx、IFN-γ等干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)的上調(diào)，miR-462和miR-731表達(dá)也上調(diào)，表明microRNA也參與干擾素介導(dǎo)的免疫保護(hù)[16]。

2 漁用DNA疫苗研究

水產(chǎn)病害可分為病毒性、細(xì)菌性及寄生性病害，水產(chǎn)疫苗對細(xì)菌性病害的作用效果較好。自20世紀(jì)80年代以來，水產(chǎn)疫苗已在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到大規(guī)模應(yīng)用，大多數(shù)商用疫苗是滅活菌苗，少量是基因工程重組苗[17]。2007年，第1個(gè)水產(chǎn)DNA疫苗通過審批，水產(chǎn)DNA疫苗研究進(jìn)入新階段[18]。DNA疫苗是一個(gè)包括強(qiáng)啟動子、目標(biāo)基因及轉(zhuǎn)錄終止序列等關(guān)鍵元件的細(xì)菌質(zhì)粒。已有研究主要聚焦在特異啟動子篩選、多基因(抗原)表達(dá)和DNA疫苗與適合載體及佐劑的配合使用等方面。

2.1 啟動子優(yōu)化

人巨細(xì)胞病毒(HCMV)啟動子是一種常用的DNA疫苗啟動子，在魚和蝦細(xì)胞中可高效表達(dá)[19-20]。篩選適合的魚源啟動子，提高水產(chǎn)DNA疫苗的細(xì)胞表達(dá)特異性，對提高DNA疫苗生物安全性有重要意義。比較草魚肌動蛋白啟動子疫苗和HCMV啟動子疫苗發(fā)現(xiàn)，雖然其免疫保護(hù)率相似，但魚源啟動子可誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異免疫反應(yīng)[21]。Ruiz等[22]利用鯉魚上皮細(xì)胞株體外比較了10種不同魚源啟動子的表達(dá)效率，發(fā)現(xiàn)來源于虹鱒的Mx啟動子、斑馬魚內(nèi)源反轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列(LTR)和草魚肌動蛋白基因啟動子(AE6)的體外表達(dá)效率最高。如果在質(zhì)粒表達(dá)框兩側(cè)插入來源于三文魚的反向重復(fù)序列，則表達(dá)效率更高。通過比較截短啟動子序列后的質(zhì)粒表達(dá)效率，發(fā)現(xiàn)以Mx或LTR的核心序列替代HCMV啟動子相應(yīng)序列后，在培養(yǎng)細(xì)胞中具有相似的抗原表達(dá)水平；當(dāng)Mx增強(qiáng)子與LTR或AE6核心序列組合，在培養(yǎng)細(xì)胞中抗原表達(dá)最高[23]。

2.2 抗原基因

2.2.1 病毒病抗原基因

傳染性造血組織壞死癥病毒(IHNV)和出血性敗血癥病毒(VHSV)是對三文魚養(yǎng)殖危害極大的2種病毒，除DNA疫苗外，其他類型疫苗研制均較困難。目前已完成了病毒基因組測序、病毒蛋白鑒定及不同病毒分離株基因變異分析工作。三文魚注射免疫IHNV病毒G蛋白質(zhì)粒后，可以誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生病毒中和抗體，顯著提高攻毒后的存活率，而且不同血清型病毒間有抗原重疊，可作為免疫保護(hù)抗原，DNA疫苗免疫后的相對存活率大于80%[24]。

胰腺壞死病是由披膜病毒科的鮭胰腺病毒(SPDV)引起的三文魚病毒病。SPDV病毒由一條正義單鏈RNA構(gòu)成，可編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和1個(gè)結(jié)構(gòu)多肽鏈，結(jié)構(gòu)多肽鏈通過進(jìn)一步加工，形成5個(gè)成熟蛋白，其中糖蛋白E1和E2形成異源二聚體，分布于病毒表面。滅活苗、E2、E1亞單位疫苗均對SPDV病毒表現(xiàn)出免疫保護(hù)性，但DNA疫苗對該病毒無免疫保護(hù)性[25]。感染性胰腺壞死病病毒(IPNV)也是引起魚胰腺壞死的病原之一，由線性雙鏈RNA組成，大RNA片段編碼衣殼蛋白VP2、小衣殼蛋白VP3和剪接肽鏈的蛋白酶NS。含完整A片段的DNA疫苗對IPNV病毒表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)，而僅含VP2基因的DNA疫苗不具備免疫保護(hù)性[26]，也有研究認(rèn)為，只有全病毒滅活苗有一定免疫保護(hù)作用，DNA疫苗和亞單位苗均沒有保護(hù)性[27]。鮭魚貧血病毒(ISAV)是鮭傳染性貧血病的主要病原，是一種被膜病毒，核衣殼血凝素是主要抗原，以病毒血凝素酯酶的表達(dá)質(zhì)粒免疫后，表現(xiàn)出中等攻毒保護(hù)性，而病毒核蛋白表達(dá)質(zhì)粒則無保護(hù)性[27]。

β諾達(dá)病毒是一類由2條正鏈單鏈RNA組成的RNA病毒，可引起硬骨魚病毒性神經(jīng)壞死病。雖然重組衣殼蛋白亞單位苗對其具有良好免疫保護(hù)性，而DNA疫苗免疫后并不表現(xiàn)免疫保護(hù)，而且亞單位苗與DNA苗聯(lián)合免疫也未能進(jìn)一步提高亞單位苗的保護(hù)性[28]，顯示該DNA疫苗并無免疫保護(hù)作用。

鯉春病毒血癥病毒(SVCV)是鯉春病毒血癥的主要病原，可感染淡水養(yǎng)殖的多種鯉科魚類品種。SVCV病毒由一條反義單鏈RNA構(gòu)成，主要編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中G蛋白和M蛋白是囊膜的組成蛋白，三聚體的G蛋白位于囊膜外表面，而M蛋白則位于囊膜內(nèi)表面。研究發(fā)現(xiàn)，由CMV啟動子驅(qū)動的全長G蛋白質(zhì)粒對其免疫保護(hù)效率(48%)較好[29]，且多價(jià)苗可同時(shí)預(yù)防SVCV和錦鯉皰疹病毒(koi herpesvirus，KHV)[30]。

鯉皰疹病毒(CyHV)有多種亞型，其中CyHV-3是錦鯉皰疹病毒病的病原，可造成錦鯉、鯉80%以上的死亡率。CyHV-3具有一條大小約295 kb的雙鏈DNA，包含156個(gè)開放閱讀框(ORF)，其中ORF65編碼主要囊膜蛋白。構(gòu)建ORF65疫苗質(zhì)粒并免疫建鯉魚苗，可顯著提高攻毒建鯉成活率[31]。2型病毒(CyHV-2)可導(dǎo)致異育銀鯽大量死亡，ORF72、ORF66、ORF81和ORF82融合表達(dá)的DNA疫苗，口服或注射免疫可提高異育銀鯽的成活率[32]。

傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)是鱖魚病毒病的主要病原。ISKNV主要衣殼蛋白(MCP)是病毒粒子的主要抗原蛋白。以MCP基因構(gòu)建的DNA疫苗浸泡處理鱖魚苗，鱖魚血液中白細(xì)胞含量、白細(xì)胞吞噬能力和超氧化物歧化酶含量均顯著提高，攻毒后死亡率顯著下降[33]。

2.2.2 細(xì)菌病抗原基因

鰻弧菌是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病原微生物，可感染多種硬骨魚。鰻弧菌中鑒定出5種免疫原性蛋白(VAA，Groel，OmpU，PteF和SpK)，其中4種外源表達(dá)的重組蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生白細(xì)胞分化及抗體生成。含VAA基因的DNA疫苗質(zhì)?？梢栽谂囵B(yǎng)細(xì)胞及牙鲆體內(nèi)表達(dá)VAA抗原蛋白，DNA疫苗免疫后，可對牙鲆提供中等免疫保護(hù)[34]；將鰻弧菌抗原VAA與白介素2基因聯(lián)合構(gòu)建雙順反子DNA疫苗，共表達(dá)VAA抗原和白介素2細(xì)胞因子，可以提高攻毒后相對存活率[35]。另外，熱激蛋白(HSPs)也可作為免疫抗原，以鰻弧菌熱激蛋白基因(Hsp33)構(gòu)建的DNA質(zhì)?？稍隗w內(nèi)或培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)熱激蛋白，激活系統(tǒng)免疫和局部免疫，攻毒后免疫保護(hù)為42.86%[36]。

豚鏈球菌是一種水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害嚴(yán)重的革蘭氏陽性條件致病菌，可感染多種主要養(yǎng)殖品種，如大菱鲆等。在養(yǎng)殖溫度過高、密度過大等不利養(yǎng)殖條件下，常造成重大損失，生產(chǎn)中主要以滅活菌苗預(yù)防。利用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)篩選獲得抗原基因sia10，構(gòu)建表達(dá)sia10基因的DNA疫苗，免疫攻毒結(jié)果顯示具有很好的免疫保護(hù)性[37]。已有的研究證實(shí)，由9個(gè)基因組成的鏈球菌溶血素S相關(guān)基因簇可編碼鏈球菌重要毒力因子，基于該基因簇sagE、sagF、sagG、sagI和H基因的DNA疫苗均可有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，免疫個(gè)體表現(xiàn)良好的鏈球菌侵染免疫保護(hù)，而且sagH基因DNA疫苗還表現(xiàn)出對不同血清型鏈球菌的交叉保護(hù)[38]。

愛德華氏菌是一種革蘭氏陰性致病菌，可感染多種淡水或海水養(yǎng)殖魚類，發(fā)生愛德華菌病，主要癥狀包括魚類皮膚損傷、膿腫壞死和腹部腫脹等，嚴(yán)重時(shí)會引發(fā)魚類敗血癥，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來巨大危害。外膜蛋白C(OmpC)是一種孔蛋白，位于細(xì)胞外膜，是主要表面抗原。以O(shè)mpC的DNA疫苗處理牙鲆6周后，在受體魚組織中可以檢測到OmpC基因的轉(zhuǎn)錄本和融合蛋白，攻毒后的相對存活率約為55%[39]。分子伴侶不僅是胞內(nèi)蛋白折疊、組裝與轉(zhuǎn)運(yùn)的幫助蛋白，同時(shí)還是免疫優(yōu)勢抗原，可激發(fā)宿主的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。通過構(gòu)建愛德華氏菌伴侶蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒，免疫牙鲆3～5周后，伴侶分子GroEL基因表達(dá)質(zhì)?？梢哉T導(dǎo)牙鲆的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)[40]。

水產(chǎn)氣單胞菌病是由嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和溫和氣單胞菌引起的水產(chǎn)病害。嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，其外膜主要由脂多糖、磷脂和一些外膜蛋白(OMPs)組成，且OMPs蛋白在不同血清型間較保守，其中Aha1蛋白位于細(xì)胞表面，是重要的毒力因子，有很強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，根據(jù)Aha1蛋白的2個(gè)保守域構(gòu)建DNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化培養(yǎng)細(xì)胞后，可檢測到抗原蛋白表達(dá)[41]。Han等[42]分別克隆外膜蛋白OMPG和OMP48編碼基因，并構(gòu)建真核-酵母穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，口服免疫鯽魚后，免疫組化顯示，抗原基因在鯽魚腸道黏膜上表達(dá)，DNA疫苗的免疫保護(hù)率為46.7%。

2.2.3 寄生蟲病抗原基因

多子小瓜蟲屬纖毛類原生寄生蟲，是世界范圍內(nèi)淡水魚類的主要寄生蟲病原，主要寄生于魚類表皮和鰓部的上皮細(xì)胞，可引起小瓜蟲病或“白點(diǎn)病”，是影響淡水水產(chǎn)生產(chǎn)的主要因素之一。已有研究顯示，魚體可以產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)以抵抗小瓜蟲寄生[43]，寄生蟲富含的一類表面膜蛋白(I-ags)是有效的免疫抗原，分別構(gòu)建編碼I-ags(Iag52 A、Iag52B)和半胱氨酸蛋白酶(ICP2)質(zhì)粒，不同質(zhì)粒組合處理可以誘導(dǎo)三文魚免疫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)并產(chǎn)生寄生蟲特異性抗體，但并不能顯著提高免疫保護(hù)性[44]。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)免疫寄生蟲病DNA疫苗尚不能有效激活機(jī)體免疫反應(yīng)，還需要篩選更有效的免疫抗原[45]。

2.3 免疫佐劑

在動物免疫接種時(shí)，通常需要疫苗佐劑輔助，以增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答能力，或改變免疫反應(yīng)類型。水產(chǎn)DNA疫苗的最終研究目標(biāo)是獲得可以誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生長期高水平免疫保護(hù)，然而，除少數(shù)幾種DNA疫苗外，大部分在研水產(chǎn)DNA疫苗的保護(hù)性尚不理想，而且由于魚類沒有淋巴結(jié)和骨髓等淋巴器官，對疫苗的反應(yīng)相對較弱。因此，在DNA疫苗研究的同時(shí)，篩選適合的免疫佐劑，以達(dá)到增強(qiáng)免疫的作用。

2.3.1 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是一類能在細(xì)胞間傳遞信息的蛋白質(zhì)或小分子多肽，具有免疫調(diào)節(jié)及效應(yīng)功能有干擾素、白介素、趨化因子等。與哺乳動物干擾素類似，草魚的IFN除了可以調(diào)節(jié)趨化因子和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用、刺激一氧化氮和具有抗菌活性的氧中間體的產(chǎn)生和釋放外，還可以促使Th0細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞，誘導(dǎo)B細(xì)胞中免疫球蛋白類型的轉(zhuǎn)換和主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)Ⅰ類、MHC Ⅱ類分子和APC協(xié)同刺激分子的表達(dá)，在胞內(nèi)細(xì)菌感染和宿主抵抗病毒的過程中有重要的作用[46]。Chang等[47]研究發(fā)現(xiàn)，IFN質(zhì)粒作為佐劑可顯著提高DNA疫苗的保護(hù)效率。Cao等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在適合劑量下，細(xì)胞因子均對DNA疫苗免疫后的抗原基因表達(dá)有顯著作用。一般來說，疫苗注射部位抗原提呈細(xì)胞數(shù)量決定了疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的程度。因此，將趨化因子作為佐劑，則可提高DNA疫苗的免疫反應(yīng)[49]。

2.3.2 調(diào)節(jié)因子

MyD88是一種激活信號通路、產(chǎn)生炎癥因子的轉(zhuǎn)接分子，在哺乳動物的白介素1受體及Toll樣因子介導(dǎo)的核因子NF-κB激活通路中有重要作用，可作為DNA疫苗的佐劑，提高疫苗的免疫反應(yīng)[50-51]。DDX41是DDX蛋白家族成員，參與信號傳導(dǎo)、基因啟動子調(diào)節(jié)、RNA剪接及蛋白質(zhì)翻譯過程。以共表達(dá)VHSV病毒抗原G蛋白和XXD41的雙啟動子質(zhì)粒免疫牙鲆，可顯著提高攻毒后30 d的存活率，說明DDX41是DNA疫苗的有效佐劑[52]。

2.3.3 病毒復(fù)制子

病毒復(fù)制子是在病毒基因組結(jié)構(gòu)中至少剔除1個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的病毒基因，具備可編碼非結(jié)構(gòu)蛋白且不能組裝成新病毒的特性。在哺乳動物細(xì)胞質(zhì)中，α病毒復(fù)制子的復(fù)制酶復(fù)合體可以激活天然免疫和特異性免疫反應(yīng)，具有免疫佐劑的功能。構(gòu)建可表達(dá)三文魚α病毒復(fù)制酶的佐劑質(zhì)粒并與滅活I(lǐng)SAV病毒聯(lián)用時(shí)，可顯著提高免疫保護(hù)率，提示該病毒復(fù)制子可作為免疫佐劑使用[53]。

2.3.4 小RNA

microRNAs(miRNAs)是進(jìn)化上保守且廣泛存在于真核生物中的一類非編碼單鏈小RNA，主要通過抑制靶基因的表達(dá)或翻譯來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。Lim等[54]通過在VHSV病毒G蛋白表達(dá)質(zhì)粒中插入一個(gè)miR-155表達(dá)盒后，發(fā)現(xiàn)新質(zhì)?？娠@著提高血清殺病毒活性，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的miR-155可以提高先天免疫反應(yīng)，可以作為佐劑分子。

2.4 口服DNA疫苗載體

DNA疫苗經(jīng)多種接種途徑進(jìn)入動物體內(nèi)，被動物宿主細(xì)胞吸收后，轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)抗原蛋白，通過刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)從而起到免疫保護(hù)作用?？诜﨑NA疫苗具有操作簡單、費(fèi)用節(jié)省、魚體應(yīng)激反應(yīng)低、可在幼體期進(jìn)行免疫等優(yōu)點(diǎn)，但口服后質(zhì)粒DNA在腸道生理環(huán)境極容易發(fā)生降解，為了避免或減少腸道酸性環(huán)境及各種腸道核酸酶對質(zhì)粒分子的降解作用，設(shè)計(jì)了多種載體，以提高口服途徑吸收質(zhì)粒分子的完整性。

2.4.1 活菌載體

在對疫苗傳遞系統(tǒng)的研究中，期望獲得一種能在機(jī)體體內(nèi)較長時(shí)間存在且對機(jī)體本身安全，又能產(chǎn)生持續(xù)免疫力的傳遞載體。乳酸桿菌是動物胃腸道的常在菌群，可作為口服DNA疫苗的運(yùn)載工具，誘導(dǎo)局部或全身黏膜免疫反應(yīng)。在水產(chǎn)免疫研究中，乳酸桿菌常作為益生菌加以利用，尚未見作為疫苗載體的報(bào)道[55]。Huang等[56]研究發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚減毒鼠傷寒沙門氏菌無乳鏈球菌口服液DNA疫苗可誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生抗體，提高攻毒后的免疫保護(hù)率，說明減毒菌苗可以作為DNA疫苗的載體。酵母是一種常見的真核表達(dá)宿主，在簡單、低成本培養(yǎng)基中可快速生長，同時(shí)，菌壁主要成分β葡聚糖具有免疫活性，是一種良好的生物飼料添加劑，已有研究發(fā)現(xiàn)，重組釀酒酵母可作為一種新型的口服DNA疫苗載體[57]。

2.4.2 微粒載體

隨著納米材料和技術(shù)的發(fā)展，納米微球載體研究取得了飛速發(fā)展，其具有副作用少、緩釋、長效、避免胃腸道消化水解等優(yōu)點(diǎn)，可以作為DNA疫苗傳送載體，提高質(zhì)粒DNA分子抵御腸道降解環(huán)境能力，已有研究使用乳化技術(shù)，利用殼聚糖、PLGA等包被抗原，制備DNA口服疫苗[58]。

2.5 DNA疫苗安全性

水產(chǎn)DNA疫苗潛在的安全性主要涉及2個(gè)方面。對受體魚來說，外源DNA可能與基因組整合，干擾正常的生理過程，或者誘導(dǎo)產(chǎn)生自體免疫等不良反應(yīng)；對消費(fèi)者來說，水產(chǎn)品中可能殘存的帶有哺乳動物啟動子和抗生素抗性基因的質(zhì)粒，具有潛在的整合進(jìn)入基因組或腸道菌群的風(fēng)險(xiǎn)。截至目前，水產(chǎn)免疫還沒有這2方面的研究報(bào)道，但從數(shù)千例DNA疫苗的人體安全性觀察的初步結(jié)果看，DNA疫苗對宿主沒有明顯的副作用[59]，且沒有影響人類健康問題的事件發(fā)生[60]。DNA疫苗免疫后，質(zhì)?？赡芡ㄟ^被接種魚的分泌物、排泄物或遺體的腐敗物向外界環(huán)境釋放。質(zhì)粒DNA進(jìn)入環(huán)境后會被逐步降解，可通過遺傳改造，使質(zhì)粒DNA失去移動能力，大大降低其被自然環(huán)境中微生物吸收、繁殖和擴(kuò)散的可能性[61]。

3 小結(jié)

水產(chǎn)疫苗的研究開發(fā)工作正在全世界范圍內(nèi)蓬勃發(fā)展，隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，水產(chǎn)疫苗的使用也呈快速發(fā)展勢頭，并將有效解決因化學(xué)藥物濫用而導(dǎo)致的水產(chǎn)品質(zhì)量安全和環(huán)境污染問題。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗具有眾多優(yōu)點(diǎn)，是21世紀(jì)新型疫苗發(fā)展的趨勢，而水產(chǎn)口服DNA疫苗由于具有給藥方便等優(yōu)勢，因而是研究熱點(diǎn)。目前DNA疫苗仍面臨2個(gè)主要問題：第一，公眾對其安全性的擔(dān)憂。盡管疫苗質(zhì)?；駾NA疫苗受體魚并不屬于轉(zhuǎn)基因范疇，第一例水產(chǎn)DNA疫苗也通過審批，然而對長期使用DNA疫苗可能引起的各種反應(yīng)仍缺乏長期深入的研究，未來需在以魚源啟動子替代哺乳動物啟動子、改造質(zhì)粒載體等方面加強(qiáng)研究，以減輕人們對DNA疫苗及相關(guān)產(chǎn)品的消費(fèi)安全和環(huán)境安全的擔(dān)心。第二，目前在研的大部分水產(chǎn)DNA疫苗，特別是水產(chǎn)口服DNA疫苗，其引發(fā)的體液和細(xì)胞免疫達(dá)不到理想的狀態(tài)。通過比較哺乳動物和水產(chǎn)模式魚類的免疫機(jī)制差異，鑒定魚體早期天然免疫反應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制，及其與長效獲得性免疫間的相互作用等，進(jìn)一步解析魚免疫機(jī)制研究。另外，在水產(chǎn)口服DNA疫苗研究中，需考慮如何確定給藥劑量、時(shí)間及保護(hù)專一性等問題；在評價(jià)免疫保護(hù)時(shí)，除了比較免疫組與非免疫組，還需要與傳統(tǒng)疫苗(滅活苗、減毒苗)比較；改進(jìn)攻毒方法，以盡可能反映自然養(yǎng)殖環(huán)境中情況，病原微生物的侵染途徑；開展口服DNA疫苗載體及佐劑研究等，使水產(chǎn)口服DNA疫苗能在不久的將來，更好地為水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)服務(wù)。