鄭新新，王國慶，張 蕾，胡 嬌*

（1. 揚州大學 獸醫(yī)學院/農業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇 揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009）

流感病毒（Influenza A virus，IAV）是一種單股負鏈分節(jié)段的RNA 病毒，屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒屬[1]。根據IAV 顆粒內部核蛋白（Nuclear protein，NP）和基質蛋白（Matrix protein，M）抗原性的不同，可將其分為A、B、C 三型，其中A型流感病毒宿主譜最為廣泛，危害也最嚴重。除了可以感染人之外，IAV 還可感染禽、馬、豬等動物，曾多次引起世界性的大流行，給人類健康和畜牧業(yè)生產造成了嚴重的威脅和經濟損失[2-4]。IAV 亞型眾多、變異快，致病機制復雜，易實現(xiàn)跨種傳播，難以實現(xiàn)有效的防控[5]。

長鏈非編碼RNAs（Long non-coding RNAs，lncRNAs）是一種內源性的細胞RNA，其長度一般大于200 個核苷酸（Nucleotide，nt），無開放閱讀框，不編碼蛋白，曾經一度被認為是基因轉錄的“噪音”[6-7]。然而，隨著研究的深入，越來越多的研究表明lncRNAs 可以通過多種機制調控基因的表達水平，進而參與免疫細胞增殖分化、免疫應答等多種生命活動過程[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)，IAV 感染宿主可誘導機體內大量的lncRNAs 差異表達，這些差異表達的lncRNAs 可以作為分子支架[13-15]、分子信號[14]、分子引導[16-17]、分子誘餌[18-19]，從染色體表觀遺傳修飾[14,20]、mRNA 轉錄[21]及轉錄后修飾[22]等水平，調節(jié)宿主細胞內細胞因子的產生、免疫信號的轉導、免疫通路的激活及抗病毒蛋白的產生等生物學過程，從而間接調控IAV 的復制。同時，lncRNAs 還可以作為競爭內源性RNA（Competive endogenous RNA，ceRNA），通過lincRNA-miRNA-mRNA 組成的ceRNA環(huán)路調控基因的表達水平，從而調控IAV 的復制[18]。此外，IAV 還可“挾持”宿主細胞內的lncRNAs，促進自身mRNAs 的轉錄以及病毒蛋白的表達[21-22]。隨著深度測序技術的快速發(fā)展，lncRNAs 在IAV 感染中的調控作用逐漸被人們所認識，為IAV 的有效防控提供了新的方向。本文綜述了部分lncRNAs 在IAV 感染過程中發(fā)揮的重要作用，重點闡述了這些lncRNAs 在調控IAV 復制中的作用及相關機制，以期為IAV 的靶向治療提供參考和依據。

1 lncRNAs 的基本特性

lncRNAs 由RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNA Pol Ⅱ）或Ⅲ轉錄生成，不具備編碼蛋白質的能力，主要分布在真核細胞的細胞核、細胞質及外泌體 中[23]。lncRNAs 的 結 構 特 征 與mRNAs 類 似，5'末端有帽子結構，3'端有或是沒有多聚腺苷酸的尾巴，經剪接后轉化為成熟的lncRNAs[23]。但是，lncRNAs 的序列保守性相對較差，具有明顯的種屬特異性、組織特異性及時間特異性，即不同動物之間lncRNAs 的表達量不同，同一動物不同組織中l(wèi)ncRNAs 的表達量不同，同一組織或器官不同發(fā)育階段lncRNAs 的表達量也不同[24-26]。例如，紅細胞lncRNA 的大部分序列在8 種不同品系的小鼠中保守表達，但只有15%小鼠的lncRNAs 在人體內表達[24]。lncRNAs 通常由蛋白編碼位點內的任一鏈轉錄，其轉錄位點更集中在啟動子、初始外顯子和內含子附近，轉錄后無需翻譯，直接與多種生物大分子相互作用，通過多種方式快速、高效地調控基因的表達水平[6]。lncRNAs 的分子作用機制，可分為四類：“分 子 支 架”（Scaffold molecule）“分 子 信 號”（Signal molecule）、“分子引導”（Guide molecule）、“分子誘餌”（Decoy molecule）[27]。已有的研究表明，lncRNAs可以通過上述分子作用機制，從多個方面調節(jié)基因的表達水平，從而調控IAV 的復制[13-19]。

2 lncRNAs 的作用機制

盡管lncRNAs 一級結構的編碼序列并不守恒，但它們的作用機制具有相似性。研究表明，lncRNAs 作為“分子支架”，可以募集多種蛋白形成核酸蛋白質復合物，調控基因的表達水平[27]。例如，lncRNA NEAT1（Nuclear enriched abundant transcript 1）可以與SFPQ/SPF（Splicing factor proline and glutamine rich）結合并將其轉移至核旁斑點，促進IL（Interleukin）-8 等抗病毒細胞因子的表達[13]。此外，細胞質中差異表達的lncRNA AVAN（Anti-virus and activate neutrophils）作為分子支架，可以與RIG-I（Retinoic acid-inducible gene-I）和TRIM25（Tripartite motif containing 25）結合，促使RIG-I 發(fā)生泛素化修飾，從而誘導I 型IFN（Interferon）的產生[14]。

lncRNAs 的轉錄具有時間及空間特異性，所以lncRNAs 還可作為“分子信號”，調控細胞內轉錄因子與DNA 的結合，從而調節(jié)基因表達的過程[27]。例如，分布于細胞核中的lncRNA AVAN 能夠與FOXO3a（Forkhead box O3a）的啟動子區(qū)直接結合，增強啟動子區(qū)H3K4me3（Histone-H3-lysine-4trimethylation）和H3K27ac（Histone-H3-lysine-27 acetylation）的組蛋白修飾，從而促進FOXO3a 基因的轉錄與翻譯[14]。

此外，lncRNAs 可以利用自身的空間結構，通過共轉錄的方式引導核酸蛋白質復合物靶向特定基因，以順式或反式作用調節(jié)相關基因的表達[27]。Barriocanal 等研究發(fā)現(xiàn)，lncBST2/BISPR 和lncISG15作為“分子引導”，可以順式調節(jié)BST2（Bone marrow stromal cell antigen 2）和ISG（Interferon stimulated gene）-15 的表達[16]。此外，另有研究表明，lncLrrc55-AS（lencine rich repeat containing 55）可以與PME-1（Phosphatase methylesterase 1）互作，反式調節(jié)IRF（Interferon regulatory factor）3 磷 酸 化 抑 制 劑PP2A（Protein phosphatase 2A）的活性，從而增強IRF3 的磷酸化，從而誘導I 型IFN 的產生[17]。

有趣的是，lncRNAs 還可以作為微小RNA（microRNA，miRNA）和剪接因子的“分子誘餌”，調控基因的表達水平[27]。例如，lnc-ISG20 作為“分子誘餌”，能夠與ISG20 競爭性結合miR-326，降低ISG20 與miR-326 的結合量，促進ISG20 的翻譯過程[18]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，lnc-lsm3b 也可以作為“分子誘餌”，與病毒RNA（viral RNA，vRNA）競爭性結合RIG-I，抑制宿主的天然抗病毒免疫反應[19]。

以上研究為進一步闡明lncRNAs 在IAV 復制和致病機制中的潛在作用奠定了理論基礎。

3 lncRNAs 在調控流感病毒復制中的作用及其作用機理

近年來，越來越多的研究表明，IAV 感染可誘導宿主細胞中大量的lncRNAs 差異表達，并且大多數(shù)差異表達的lncRNAs 與肺部穩(wěn)態(tài)及免疫反應相關的編碼基因共同表達，這些lncRNAs 在調控宿主免疫應答中扮演著至關重要的角色[28]。IAV 感染呼吸道上皮細胞后，一方面，可以直接誘導lncRNAs 的差異轉錄[13,20,22,29-30]，另一方面，又可通過IFN 依賴的信號通路調控lncRNAs 的表達[16,19,21,31]，增強或者抑制宿主的抗病毒應答反應，從而調控IAV 的復制過程。

3.1 lncRNAs 增強宿主的抗病毒天然免疫應答抑制病毒復制IAV 感染誘導宿主細胞中差異表達的lncRNAs 可以作為正調節(jié)因子，增強宿主的抗病毒天然免疫應答，從而抑制IAV 的復制。

lncRNAs 可以通過調節(jié)宿主細胞內RIG-I 的抗病毒活性，增強宿主的抗病毒天然免疫反應。研究發(fā)現(xiàn)，在IAV 感染的初級階段，lnczc3h7a 作為“分子支架”，可以結合TRIM25 和RIG-I，TRIM25 通過第63 位賴氨酸特異鏈接的多聚泛素鏈和RIG-I 共價結合，傳遞抗病毒信號，誘導下游蛋白引發(fā)抗病毒級聯(lián)反應，從而限制病毒復制[15]。此外，有研究表明分布于細胞質中的lncRNA AVAN 也可發(fā)揮“分子支架”的作用，促進RIG-I 與TRIM25 相互結合，增強RIG-I 的泛素化修飾，激活轉錄因子IRF3 并誘導I型IFN 的轉錄[14]。病毒感染往往會破壞RIG-I 介導的信號通路，從而逃避宿主細胞的免疫反應，而lnczc3h7a 和AVAN 可以通過泛素化修飾，增強RIG-I識別病毒結構蛋白及病毒核酸的能力，誘導RIG-I CARDs（Caspase recruitment domains）結構域的構象發(fā)生改變，并與下游接頭蛋白MAVS（Mitochondrial antiviral signaling protein）的CARDs 結構域互作，激活免疫信號通路，抑制病毒感染。

lncRNAs 可以通過調節(jié)ISGs 轉錄起始位點的組蛋白修飾，增強宿主的抗病毒天然免疫反應。研究表明，IAV 感染誘導宿主細胞內lncRNA NRAV（Negative regulator of anti-viral response）的表達量減少，而NRAV 可通過調控IFITM（Interferon-induced transmembrane protein）-3 和MxA（Myxovirus resistance A）轉錄起始位點的組蛋白甲基化過程，或者與NRAV 相關蛋白ZONAB（Zonula occludens-1-associated nucleic acid binding protein）互作，間接促進IFITM3、MxA 等ISGs 的表達，從而抑制IAV 的復制[20]。該研究從表觀遺傳學修飾的角度解釋了lncRNAs 調控宿主抗病毒基因表達的作用機制，拓寬了人們對于IAV 感染期間觸發(fā)的調控網絡的認知。

lncRNAs 能夠促進炎性因子以及IFN 的表達，增強宿主的抗病毒天然免疫反應。研究發(fā)現(xiàn)，IAV感染誘導宿主細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1 的表達量顯著上調，合成大量的核旁斑點；同時，NEAT1 還可與SFPQ/PSF 相互作用，將其從IL-8 的啟動子上移至核旁斑點，啟動IL-8 的轉錄、活化并增強中性粒細胞的趨化性，從而增強宿主的抗病毒作用[13]。Pan 等最新的研究發(fā)現(xiàn)，IAV 感染后，宿主通過IFN 信號通路誘導產生大量的lncRNA ISR，增強宿主的抗病毒天然免疫反應，抑制IAV 的復制，但其作用機制有待于進一步研究[31]。

lncRNAs 通過與轉錄因子互作，激活宿主的先天性免疫應答。研究發(fā)現(xiàn)，IAV 可以通過IFN 依賴的信號通路，誘導宿主細胞編碼產生大量的lncBST2/BISPR，lncBST2/BISPR 與BST-2 的表達成正相關，BST-2 可以 激活NF-κB（Nuclear factor kappa B）信號通路，抑制病毒復制[16]。而分布于細胞核中的lncRNA AVAN 通過與轉錄因子FOXO3a 的啟動子區(qū)直接結合，增強啟動子區(qū)H3K4me3 和H3K27ac 的組蛋白修飾，促進FOXO3a 基因的轉錄與翻譯，激活中性粒細胞，抑制病毒進一步擴散，減輕機體損傷[14]。

此外，lncRNAs 還可抑制細胞內關鍵代謝酶的活性，破壞病毒生存的微環(huán)境，增強宿主的天然抗病毒免疫應答。Maarouf 等最新研究發(fā)現(xiàn)，IAV 感染期間，microRNA-155 宿主基因（MicroRNA 155 host gene，MIR155HG）編碼產生一種名為lncRNA-155 的lncRNA，lncRNA-155 通過負調節(jié)PTP1B（Protein tyrosinephosphatase 1B）的活性，促進I 型IFN 的產生，上 調ISG15、Mx1、OAS3（2'，5'-Oligoadenylate synthetase 3）等ISGs 的轉錄水平，抑制IAV 的復制。lncRNA-155 或許通過調節(jié)PTP1B 對JAK2 的磷酸化修飾過程，促進JAK/STAT（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription）信號通路的激活，增強宿主的的抗病毒天然免疫反應[32]。此外，病毒感染誘導產生的ISGs 既可以編碼產生抗病毒蛋白，限制病毒擴散，又可以反過來編碼模式識別受體（Patter-recognition receptors，PRRs）并識別病毒粒子，調控IFN 及抗病毒因子的表達，從而增強宿主機體的抗病毒能力。

綜上所述，lncRNAs 可通過多種機制調節(jié)宿主天然免疫反應中關鍵細胞因子的表達以及新陳代謝等生命過程，從而增強宿主的抗病毒天然免疫反應，抑制IAV 的復制。

3.2 lncRNAs 拮抗宿主的抗病毒天然免疫反應促進病毒復制IAV 感染誘導宿主細胞內差異表達的lncRNAs 還可作為負調節(jié)因子，拮抗宿主細胞的抗病毒天然免疫應答，限制病毒復制。

RIG-I 識別自身lncRNAs，抑制宿主的抗病毒天然免疫應答，促進IAV 的復制。例如，病毒感染晚期產生的I 型IFN 能夠上調lnc-lsm3b 的表達水平，該lncRNA 通過與vRNA 競爭性結合RIG-I 單體，限制RIG-I 蛋白構象的轉變并阻止下游信號的轉導，終止I 型IFN 的產生，從而抑制宿主的抗病毒免疫反應[19]。該研究表明lncRNAs 還可避免vRNA 持續(xù)激活宿主免疫反應而導致的機體損傷，維持機體適度的免疫反應。

lncRNAs 通過負調控IFN 信號通路，拮抗宿主的抗病毒天然免疫反應，促進IAV 的復制。Carnero等研究表明，IAV 感染會誘導細胞內Ai-lncRNA EGOT 的表達水平顯著上調，而EGOT 又可以反過來抑制MX1、IFITM1 等ISGs 的表達，促進IAV 的復制[33]。此外，IAV 感染還可誘導宿主產生lncRNATSPOAP-AS1，其通過抑制IFN-β的轉錄、ISRE（Interferon-sensitive response element）的激活以及ISGs 的表達，負調節(jié)I 型IFN 信號的轉導，從而促進IAV 的復制[29]。最新研究發(fā)現(xiàn)，IAV 感染還可誘導lnc-MxA的表達量明顯上調，而lnc-MxA 通過與IFN-β形成復合物，阻止IRF3、P65 結合在IFN-β啟動子上，從而抑制IFN-β的轉錄，負調節(jié)RIG-I 介導的抗病毒免疫反應，促進病毒復制[34]。

3.3 流感病毒“劫持”宿主細胞內的lncRNAs，促進自身復制IAV 感染誘導宿主細胞產生大量的lncRNAs，IAV“利用”這些lncRNAs，可以促進自身RNA 依賴的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）復合物的組裝，或者宿主細胞內的物質代謝，促進自身復制。

研究發(fā)現(xiàn)，IAV 感染誘導宿主細胞編碼產生大量的lncRNA VIN[35]和lncRNA PSMB8-AS1[21]，分別干擾這兩種lncRNAs 后均可不同程度的促進IAV mRNAs 的轉錄以及關鍵病毒蛋白的表達，從而促進IAV 的復制，但具體的作用機制有待于進一步研究。還有其它研究表明，IAV 感染會特異性地上調lncRNA PAAN（PA-associated noncoding RNA）的表達水平，PAAN 可以間接促進病毒RdRp 復合物的組裝，確保vRNA 的有效合成[30]。最新研究表明，IAV 感染還可特異性地誘導宿主細胞編碼產生大量的lncRNA-IPAN，IPAN 可以在轉錄后水平特異性地調節(jié)PB1（Polymerase basic protein）的蛋白水平，從而促進病毒mRNA 的轉錄及其基因組的復制[22]。

此外，Wang 等研究發(fā)現(xiàn)，IAV 感染宿主細胞誘導lncRNA ACOD1（Aconitate decarboxylase 1）大量表達，ACOD1 通過變構調節(jié)谷氨酰胺-草酰乙酸轉氨酶2（Glutamic-oxaloacetic transaminase 2，GOT2）的催化活性，增加病毒復制所需的關鍵產物的產生，促進病毒復制[36]。該研究表明lncRNAs 可以調控宿主細胞內關鍵代謝酶的活性，重塑細胞微環(huán)境，促進病毒復制，為廣譜抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的潛在靶點。

3.4 lncRNAs 與miRNAs 互作抑制流感病毒的復制miRNAs 是由基因組DNA 轉錄，經剪接加工形成的一種內源性的非編碼單鏈小RNA，通常由18 nt～23 nt 組成[37]。成熟miRNAs 的5'端與靶標mRNA 的3'UTR（Untranslated region）區(qū)完全或不完全互補結合，通過抑制mRNAs 的翻譯過程或者直接切割破壞目標mRNAs，從而抑制基因表達。因lncRNAs 存在與mRNAs 相似的序列，因此lncRNAs 可以作為ceRNA，通過相似序列誘捕miRNAs，釋放mRNAs，使其發(fā)揮正常的生物學功能[38]。最新研究發(fā)現(xiàn)了一種與ISG20 大部分序列相同的一種lncRNA，并將其命名 為 lnc-ISG20。 作 為 一 種 內 源 性 的 RNA，lnc-ISG20 通過與ISG20 競爭性結合miR-326，抑制ISG20 與miR-326 的結合，提高ISG20 的蛋白水平，從而抑制IAV 的復制[26]。lincRNA-miRNA-mRNA 組成的ceRNA 環(huán)路理論進一步拓展和豐富了表觀遺傳學的調控機制，為深入理解IAV 的復制機制以及宿主-病毒互作的內在分子機制提供了新的視角。

4 小結與展望

綜上所述，lncRNAs 因其獨特的生物學特性，使其在宿主-病毒互作中的調控能力更為突出：一方面，宿主可以利用自身編碼的lncRNAs 分子，增強自身抗病毒免疫應答反應，限制病毒復制；而另一方面，病毒也可“挾持”宿主的lncRNAs，抑制宿主的抗病毒免疫應答，為自身的復制重塑細胞微環(huán)境。因此，調控lncRNAs 的表達水平和功能也是探索宿主感染和免疫機制的有效策略。然而，lncRNAs 在流感病毒復制和致病機制中的研究目前還處于初級階段，甚至還沒有一個規(guī)范的命名方法，通常研究者只能根據其功能、結構特點、作用方式等進行命名。此外，絕大部分的lncRNAs 在IAV 感染過程中的功能尚不清楚仍需繼續(xù)探索研究。隨著生物信息學技術的發(fā)展以及RNA 與各生物分子間互作的深入研究，相信在不久的將來，lncRNAs 可以作為藥物靶標，設計新的抗IAV 藥物或者與現(xiàn)有的藥物結合使用，靶向防控IAV 的感染。此外，目前臨床中使用的抗IAV 藥物都在一定程度上出現(xiàn)了耐藥性，未來也可以lncRNAs 作為切入點，深入探究藥物耐藥性出現(xiàn)的原因以及它在其中發(fā)揮的作用。因此，基于lncRNAs的研究有望成為預防、治療IAV的有效策略。