王曉杰 ，劉曉蘭 ，石彥國

(1.哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室， 哈爾濱 150076； 2.齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

食品蛋白質(zhì)的糖基化修飾，是將親水的糖類物質(zhì)以共價鍵連接的方式導(dǎo)入食品蛋白質(zhì)分子之中，使修飾產(chǎn)物同時具有蛋白質(zhì)的大分子特性及糖類物質(zhì)的親水特性[1]。目前，食品蛋白質(zhì)糖基化修飾的方法有兩種，分別是美拉德反應(yīng)和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)催化的酶法糖基化，后者由于具有反應(yīng)特異性強、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)產(chǎn)物食用安全等特點而備受關(guān)注[1]。

目前，TGase的酶法糖基化已經(jīng)成功應(yīng)用于大豆蛋白[2]、黑豆蛋白[3]、酪蛋白[4]、乳清蛋白[5]、豌豆蛋白[6]、燕麥麩皮球蛋白[7]等食物蛋白質(zhì)的改性中。 近年來，開始有通過TGase生物催化多肽與氨基糖合成糖肽的報道。Hong[8]、Gottardi[9]等用TGase分別催化魚皮膠原蛋白肽、小麥谷蛋白肽與氨基葡萄糖合成了糖肽。與未糖基化的肽相比，糖肽的抗氧化活性和抗菌活性都得到了顯著提高。

玉米肽是以玉米蛋白粉為原料，經(jīng)蛋白酶水解后得到的相對分子質(zhì)量很小但活性很高的短肽分子組成的混合物[10]。玉米肽安全可靠，無毒副作用，是一種天然的食品蛋白，具有醒酒、抗疲勞、提高機體免疫力等功能。然而，在玉米肽的制備過程中，存在生物活性釋放程度低等問題。如果將蛋白酶的酶解技術(shù)與TGase的酶法糖基化技術(shù)相結(jié)合，將有望利用氨基糖的結(jié)合實現(xiàn)玉米肽功能性質(zhì)的顯著提高。目前，除本課題組外，未見利用TGase催化合成玉米糖肽的相關(guān)報道。本實驗以玉米醇溶蛋白為原料，先利用Alcalase堿性蛋白酶酶解制備玉米肽，再利用TGase催化氨基葡萄糖與玉米肽分子共價結(jié)合，優(yōu)化了糖基化反應(yīng)條件，對修飾產(chǎn)物的溶解性進行研究，以表征糖基化修飾對玉米肽功能性質(zhì)的影響，以期為進一步研究玉米糖肽的生物活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

玉米醇溶蛋白，Sigma公司；堿性蛋白酶Alcalase，丹麥諾維信公司；TGase，泰興市一鳴生物制品有限公司；D-氨基葡萄糖、即用型透析裝置(100～500 Da)，上海生工生物工程有限公司；3，5-二硝基水楊酸，天津市化學試劑廠；苯酚，天津科密歐試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DF-I集熱式磁力加熱攪拌器，常州榮華儀器制造有限公司；SHZ-A恒溫水浴振蕩器，上海躍進醫(yī)療器械廠；DF-Ⅱ氮吹儀，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；DU800紫外可見分光光度計，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司；PB-10 pH計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米肽的制備

取3 g玉米醇溶蛋白配成質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的懸浮液，用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至8.5，加入0.15 g Alcalase堿性蛋白酶，在60℃條件下進行酶解反應(yīng)。2 h后取出立即沸水浴滅酶15 min，冷卻至室溫后經(jīng)4 000 r/min離心15 min，取上清液放于-80℃冰箱中凍結(jié)，冷凍干燥48 h后獲得玉米肽。

1.2.2 玉米肽的糖基化修飾

將1.2.1中制備的玉米肽配制成溶液，加入氨基葡萄糖混合均勻，加熱到一定溫度并用2 mol/L NaOH調(diào)整至合適的pH，加入TGase開始糖基化反應(yīng)。糖基化反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于85℃水浴中熱處理5 min以鈍化TGase，冷卻至室溫。將反應(yīng)液裝入截留相對分子質(zhì)量為100～500 Da的即用型透析裝置中，將透析裝置放入1 000 mL的燒杯中，加入1 000 mL 蒸餾水。每隔2 h換一次蒸餾水，透析48 h，至透出液的電導(dǎo)率接近蒸餾水為止，將未反應(yīng)的氨基葡萄糖和游離氨基酸透析除去。收集樣液，冷凍干燥獲得玉米糖肽。

1.2.3 接糖量的測定

采用DNS法測定接糖量[11]。準確稱取0.01 g樣品，放于安瓿管中，加入2.5 mL、6 mol/L HCl，在氮氣條件下對安瓿管進行燒管密封。將密封后的安瓿管放在100℃烘箱中進行酸水解，7.5 h后取出安瓿管，自然冷卻至室溫。過濾，取0.8 mL濾液，加入0.7 mL 6 mol/L NaOH和1.5 mL的DNS試劑，沸水浴5 min，取出后流水冷卻至室溫，再加入1 mL蒸餾水，搖勻后測定540 nm處的吸光值，將測定的吸光值代入氨基葡萄糖標準曲線(y=0.002x-0.026，y為吸光值，x為氨基葡萄糖含量)，計算接糖量。接糖量=氨基葡萄糖量/玉米肽質(zhì)量。

1.2.4 玉米糖肽溶解性的測定

準確稱取0.02 g玉米糖肽，分別加入10 mL pH 3～11的緩沖溶液，旋渦混勻30 s后放置在4℃冰箱中過夜，使樣品充分水合。4℃條件下10 000 r/min 離心10 min，收集上清液后采用Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量。用上清液中總蛋白含量占樣品中總蛋白含量的比例表示樣品的溶解性。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖基化反應(yīng)單因素實驗

2.1.1 最適反應(yīng)初始pH的確定

在反應(yīng)溫度44℃、玉米肽質(zhì)量分數(shù)3%、玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比1∶2、TGase添加量50 U/g(以玉米肽質(zhì)量計，下同)、反應(yīng)時間7 h的條件下，研究反應(yīng)初始pH對接糖量的影響，實驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)初始pH對接糖量的影響

由圖1可以看出，隨著pH的增大，接糖量呈先升高后降低的趨勢，在pH為7.7時，接糖量達到最大值，為86.91 mg/g。而當pH大于7.7時，接糖量開始降低。pH是影響TGase催化活力和氨基糖氨基解離的一個重要因素。在pH大于8.0時，可能由于TGase催化活力降低或者氨基葡萄糖的氨基發(fā)生質(zhì)子化[12]，影響了玉米肽與氨基葡萄糖之間的共價結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致玉米肽中糖基的導(dǎo)入量降低。這與TGase催化殼寡糖與玉米醇溶蛋白共價結(jié)合的結(jié)果一致[13]。因此，選擇最適反應(yīng)初始pH為7.7。

2.1.2 最適反應(yīng)溫度的確定

在反應(yīng)初始pH 7.7、玉米肽質(zhì)量分數(shù)3%、玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比1∶2、TGase添加量50 U/g、反應(yīng)時間7 h的條件下，研究反應(yīng)溫度對接糖量的影響，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 反應(yīng)溫度對接糖量的影響

由圖2可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，接糖量呈先升高后降低的趨勢，在反應(yīng)溫度為44℃時，接糖量達到最大值，為73.13 mg/g。當反應(yīng)溫度超過44℃時，接糖量開始降低。在一定溫度范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，TGase活力增強，有利于糖基化反應(yīng)的進行，而當反應(yīng)溫度超過TGase的最適溫度時，高溫會導(dǎo)致TGase活力的降低，同時TGase催化的糖基化反應(yīng)的競爭性反應(yīng)脫酰胺作用也會加劇[13]。因此，選擇最適的糖基化反應(yīng)溫度為44℃。

2.1.3 最適玉米肽質(zhì)量分數(shù)的確定

在反應(yīng)初始pH 7.7、反應(yīng)溫度44℃、玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比1∶2、TGase添加量50 U/g、反應(yīng)時間7 h的條件下，研究玉米肽質(zhì)量分數(shù)對接糖量的影響，實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 玉米肽質(zhì)量分數(shù)對接糖量的影響

由圖3可以看出，隨著玉米肽質(zhì)量分數(shù)的增加，接糖量呈先增加后減小的趨勢。當玉米肽質(zhì)量分數(shù)為3%時，接糖量達到最大值，為75.29 mg/g。可能是隨著玉米肽質(zhì)量分數(shù)的提高，玉米肽和氨基葡萄糖分子之間的碰撞概率明顯增加，同時TGase催化的反應(yīng)活性位點增加，有利于糖基的導(dǎo)入；但當玉米肽質(zhì)量分數(shù)增加到4%時，反應(yīng)體系的黏度增大或反應(yīng)活性位點飽和，不利于酶促反應(yīng)進行，從而影響了糖基化反應(yīng)的進行。劉金玲等[14]在研究玉米谷蛋白與殼寡糖的酶法糖基化反應(yīng)條件時得出相同的結(jié)論。因此，選擇最適的玉米肽質(zhì)量分數(shù)為3%。

2.1.4 最適氨基葡萄糖添加量的確定

在反應(yīng)初始pH 7.7、反應(yīng)溫度44℃、玉米肽質(zhì)量分數(shù)3%、TGase添加量50 U/g、反應(yīng)時間7 h的條件下，研究氨基葡萄糖添加量對接糖量的影響，實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 氨基葡萄糖添加量對接糖量的影響

由圖4可以看出，隨著氨基葡萄糖添加量的增加，接糖量逐漸增加。當氨基葡萄糖添加量較低時，氨基葡萄糖與玉米肽分子碰撞的概率較小，因而氨基葡萄糖的導(dǎo)入量較小。當增大氨基葡萄糖添加量時，蛋白質(zhì)分子與糖分子之間的碰撞概率增加，有利于糖基化修飾反應(yīng)的進行；當玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比為1∶4時，接糖量達到最大值，為166.19 mg/g。但一味地增大接糖量會增加生產(chǎn)成本。因此，綜合考慮，選擇最適的玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比為1∶3。

2.1.5 最適TGase添加量的確定

在反應(yīng)初始pH 7.7、反應(yīng)溫度44℃、玉米肽質(zhì)量分數(shù)3%、玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比1∶3、反應(yīng)時間7 h的條件下，研究TGase添加量對接糖量的影響，實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 TGase添加量對接糖量的影響

由圖5可以看出，隨著TGase添加量的增加，接糖量整體呈先升高后降低的趨勢。當TGase添加量為50 U/g時，接糖量達到129.57 mg/g，繼續(xù)增大TGase添加量，接糖量逐漸減小。由米氏方程可知，當?shù)孜餄舛纫欢〞r，酶促反應(yīng)速率與酶濃度成正比。但當TGase添加量過高時，加大了玉米肽分子自交聯(lián)的機會，較大的空間位阻阻礙糖基的導(dǎo)入，這與全越等[12]的研究結(jié)果相一致。因此，選擇最適的TGase添加量為50 U/g。

2.1.6 最適反應(yīng)時間的確定

在反應(yīng)初始pH 7.7、反應(yīng)溫度44℃、玉米肽質(zhì)量分數(shù)3%、玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比1∶3、TGase添加量50 U/g的條件下，研究反應(yīng)時間對接糖量的影響，實驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)時間對接糖量的影響

從圖6可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，接糖量呈先升高后降低的趨勢。在反應(yīng)時間為7 h時，接糖量達到最大值，為139.22 mg/g。而當反應(yīng)時間長于7 h時，接糖量開始降低。分析可能的原因有兩方面，一方面是pH為7.7的弱堿性反應(yīng)條件下，生成的玉米肽糖基化修飾產(chǎn)物可能不穩(wěn)定而發(fā)生降解；另一方面是達到一定反應(yīng)時間后，酶促反應(yīng)趨于平衡，產(chǎn)物增加的同時使分子的空間位阻效應(yīng)更加明顯，從而抑制酶促反應(yīng)的發(fā)生[15]，不利于糖基的導(dǎo)入。因此，選擇最適的反應(yīng)時間為7 h。

2.2 正交實驗

固定反應(yīng)初始pH 7.7、反應(yīng)溫度44℃、玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比1∶3，采用L9(34)正交實驗設(shè)計對接糖量影響較大的3個因素TGase添加量、玉米肽質(zhì)量分數(shù)和反應(yīng)時間進行優(yōu)化，正交實驗因素水平如表1所示，正交實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

由表2可知，各因素對接糖量影響的大小順序依次為玉米肽質(zhì)量分數(shù)>反應(yīng)時間>TGase添加量。氨基葡萄糖糖基化修飾玉米肽的最優(yōu)實驗組合為A3B3C2，即TGase添加量55 U/g，玉米肽質(zhì)量分數(shù)3.5%，反應(yīng)時間7 h。在最優(yōu)條件下，接糖量為148.44 mg/g。經(jīng)3次驗證實驗，得到的接糖量為149.60 mg/g，遠大于玉米醇溶蛋白和玉米谷蛋白中單糖和殼寡糖的接入量[11,14]，推測是蛋白酶的酶解作用將玉米醇溶蛋白的空間位阻降低，同時使包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的活性位點暴露出來，增加了酶與底物之間的反應(yīng)效率，使氨基糖的接枝度增大。

2.3 玉米糖肽的溶解性

以玉米肽為對照，測定在pH 3.0～11.0范圍內(nèi)玉米糖肽的溶解性，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可以看出，在pH 3.0～11.0范圍內(nèi)，玉米肽的溶解性顯著升高，且未出現(xiàn)等電點，這與課題組報道[15]的玉米肽在較寬的pH范圍內(nèi)能保持良好的溶解狀態(tài)結(jié)論一致。經(jīng)氨基葡萄糖糖基化修飾后，玉米肽的溶解性進一步提高，在pH 6.0時，玉米糖肽的溶解性比玉米肽提高16.31%，可能是由于氨基葡萄糖所提供羥基基團的增加造成的[16]，也進一步說明糖基化修飾改善了玉米肽的帶電荷性質(zhì)，為玉米糖肽生物活性的發(fā)揮奠定基礎(chǔ)。

圖7 糖基化修飾對玉米肽溶解性的影響

3 結(jié) 論

以玉米醇溶蛋白為原料，先利用Alcalase堿性蛋白酶酶解制備玉米肽，再以TGase為催化用酶，氨基葡萄糖為?；荏w，通過糖基化反應(yīng)修飾玉米肽，以接糖量為指標，采用單因素實驗和正交實驗確定了氨基葡萄糖糖基化修飾玉米肽的糖基化反應(yīng)條件為：反應(yīng)初始pH 7.7，反應(yīng)溫度44℃，玉米肽質(zhì)量分數(shù)3.5%，玉米肽與氨基葡萄糖質(zhì)量比1∶3，TGase添加量55 U/g，反應(yīng)時間7 h。在最優(yōu)工藝條件下，接糖量為149.60 mg/g。與玉米肽相比，在pH 6.0時，玉米糖肽的溶解性提高16.31%。同時，糖基化修飾改善了玉米肽的帶電荷性質(zhì)。在今后的研究中，可以通過體外化學法和體內(nèi)實驗進一步開展玉米糖肽生物活性等方面的研究，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。