馬少蘭 馬彩霞 徐鵬鑫 鄭國琦 納小凡

（寧夏大學生命科學學院，銀川 750021）

寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）是茄科枸杞屬多年生落葉灌木，廣泛分布于中國、韓國、日本、歐洲、北美和地中海等地區(qū)的干旱和半干旱區(qū)域[1]。由于近期研究證實寧夏枸杞果實（枸杞子）具有抗衰老、保護神經、消炎、促進代謝、控制血糖、免疫調節(jié)及抗腫瘤等多種生物學活性[1-2]，枸杞子已作為食品和營養(yǎng)保健品在亞洲及歐美等多國零售市場中銷售[3-5]。受國際市場追捧，枸杞種植業(yè)已成為我國西北省份，尤其是寧夏出口創(chuàng)匯的優(yōu)勢富民產業(yè)之一，為地區(qū)經濟發(fā)展做出巨大貢獻[6]。

然而，受枸杞自身生長特點及傳統(tǒng)種植模式影響，枸杞連作障礙現(xiàn)象已成為限制枸杞產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一，嚴重影響了枸杞園土地生產力和枸杞生產效益，導致農民收入下降。通過多年的田間調查和實驗，納小凡等[6]研究發(fā)現(xiàn)種植超過十年的枸杞園開始出現(xiàn)枸杞子產量和品質降低、病蟲害加重等現(xiàn)象。對連作地再植枸杞生長的分析也表明，連作能夠顯著抑制再植枸杞生長，證實了枸杞連作障礙現(xiàn)象的存在[7]。張俊華和鄭國琦[8]對不同種植年限枸杞園土壤線蟲群落的分析發(fā)現(xiàn)，樹齡超過9年后枸杞園土壤線蟲群落的多樣性下降，且植物寄生性線蟲的相對比例明顯增加。通過對連作地再植枸杞根際土壤細菌群落的分析也表明，連作顯著抑制再植枸杞根際土壤細菌群落多樣性并導致細菌群落結構發(fā)生顯著變化[7]。這些研究均表明長期傳統(tǒng)種植模式下，枸杞園土壤理化性質及土壤生物環(huán)境的變化可能是導致枸杞連作障礙的主要原因，但其作用機制目前仍不清楚。

作為土壤微生物區(qū)系的重要成員，土壤真菌與其他微生物一起參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質循環(huán)和能量流動[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，真菌群落能夠通過互惠共生、病害及營養(yǎng)物質吸收和循環(huán)等方式影響陸生植物群落的多樣性和組成[11]。除此以外，土壤真菌還能夠通過固氮、植物激素分泌、病原菌防護和提高植物抗旱等生物學過程影響植物生理狀況[12-14]。因此研究土壤真菌群落多樣性及其演替規(guī)律，對于探索土壤可持續(xù)利用措施及保持土壤健康至關重要[14-15]。本研究基于前期對連作地再植枸杞根際土壤細菌群落的研究，進一步利用實時熒光定量PCR 和高通量測序技術，分析連作對再植枸杞根際/非根際土壤真菌群落豐度及多樣性的影響，為深入理解枸杞連作障礙機制提供新的理論信息。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地位于銀川市北郊20 km 的南梁農場，該地區(qū)主要氣候類型為中溫帶干旱氣候，年均氣溫在7.9～8.6℃之間，晝夜溫差大，年均降雨量約為145.5 mm，無霜期在129～177 d 之間。樣地土壤類型為砂壤土。

1.2 試驗設計

在實驗區(qū)域內選取連續(xù)種植10年的枸杞田和無枸杞種植史的設施農業(yè)用地，分別將其設置為連作及對照樣地。連作及對照枸杞園土壤基礎理化性質如下：pH 分別為5.2 和6.4；電導率199.7 和1006 μS·cm-1；有機碳9.7 和12.9 g·kg-1；全氮0.9和0.8 g·kg-1；堿解氮46.7 和30.1 mg·kg-1；銨態(tài)氮13.9 和13.7 mg·kg-1；硝態(tài)氮30.3 和20.6 mg·kg-1；全磷0.9 和0.8 g·kg-1；有效磷48.9 和12.3 mg·kg-1；速效鉀260.7 和309.1 mg·kg-1。

挖去連作樣地枸杞，連作及對照樣地經整理后于2012年4月種植一年生枸杞苗（寧杞1 號），行距3 m、株距1 m，樣方面積666 m2，枸杞田間管理與前期研究一致[6]。2016年8月采集寧夏枸杞根際、非根際土壤樣本（最后一茬枸杞果實采摘后）。實驗田內隨機設置3 個樣方（10 m×10 m），每個樣方內隨機選取10 株枸杞，利用土鉆在距離枸杞莖20 cm 處采集0～20 cm 深度土壤；同時挖取枸杞根（直徑小于2 mm），抖去浮土后放入無菌離心管。合并同一樣方內的根際土及非根際土，置于冰盒保存。非根際土過2 mm 篩去雜物并充分混勻，留取1 g鮮土于-20℃保存用于提取DNA；剩余土樣經風干后用于土壤理化性質分析[6]。根際土壤采用納小凡等[6]的方法獲得。土壤DNA 按照Power SoilTMDNA提取試劑盒說明提取。所提DNA 經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后分為三份，一份用于前序研究對 16S rDNA V4 區(qū)段的測序[6]，一份用于本研究中真菌ITS2 區(qū)段的測序，一份保留至-20℃用于qRT-PCR測定16S rDNA 和18S rDNA 基因豐度。

1.3 真菌ITS2 區(qū)段高通量測序及數(shù)據分析

采用兩步擴增法對真菌的ITS2 區(qū)段進行擴增，第一步擴增法引物序列分別為 5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGC-3′和 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′。擴增產物經稀釋后用于第二步擴增反應的模板，引物序列分別為 5′-GCATCGATGAAGAACGCAG C-3′和5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴增條件為：98℃，預變性1 min；98℃，變性10 s；50℃，退火30 s；72℃，延伸1 min；30 個循環(huán)。72℃，延伸5 min。PCR 擴增完成后，應用 Illumina HiSeq 2500 基因組分析平臺對真菌基因ITS2 區(qū)段進行測序。

1.4 實時熒光定量PCR

所提土壤基因組DNA 中16S rDNA（細菌）和18S rDNA（真菌）基因豐度利用QuantStudio?5實時定量熒光PCR 系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，USA）進行。所用細菌引物為Eub338（ACTCCTAC GGGAGGCAG CAG）和Eub518（ATTACCGCGGCT GG），真菌引物為Fu18s1（GGAAACTCAGGTCCA GA）和Nu-SSU-1536（ATTGCAATGCYCTATCCC CA）。PCR 反應體系體積為20 μL，其中包括SYBRPremix Ex Taq（Takara，大連，中國）10 μL、上下游引物各1 μL（10μmol·L-1）、DNA 模板2 μL、ROX 0.4 μL、無菌去離子水5.6 μL。細菌用兩步法進行擴增，擴增程序為：95℃預變性30 s，在95℃變性5 s， 60℃退火和延伸34 s。真菌用三步法進行擴增，擴增程序如下：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次。細菌和真菌溶解曲線按照QuantStudio 5 實時熒光定量檢測系統(tǒng)默認程序分析：95℃變性15 s，60℃復性60 s，95℃復性15 s。將含16S rDNA 和18S rDNA 基因片段的重組質粒DNA 梯度稀釋，并分別以此為模板制備16S rDNA 和18S rDNA 基因擴增標準曲線，計算土壤DNA 樣本中相應基因的絕對含量。

1.5 統(tǒng)計分析

不同樣品間數(shù)據的顯著性分析由SPSS（22.0）中的單因素方差分析完成（Turkey test，n=3）。真菌營養(yǎng)型預測利用FUNGuild數(shù)據庫進行對比檢索[16]。土壤理化因子與土壤真菌群落結構變化的關系利用Canoco（5.0）中基于距離的冗余分析（db-RDA） 完成。作圖使用Origin 9.0 軟件。

2 結 果

2.1 寧夏枸杞根際/非根際細菌和真菌豐度對連作的響應

實時熒光定量PCR 結果表明，連作樣地根際及非根際土壤細菌和真菌豐度分別顯著高于對照樣地根際及非根際土壤（P＜0.05，表1）。其中，連作樣地再植枸杞根際細菌和真菌豐度分別為對照樣地再植枸杞根際的4.8 倍和7.3 倍，而非根際土壤則分別為對照的2.1 倍和5.9 倍（表1）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，對照樣地根際及非根際土壤的細菌/真菌比均高于連作樣地，其比例分別為對照樣地的1.5 倍（P＞0.05）和2.7 倍（P＜0.05，表1）。

表1 實時熒光定量PCR 法分析枸杞根際/非根際細菌和真菌豐度變化 Table1 Abundances of soil bacteria and fungi in the bulk soil and rhizosphere of L.barbarum detected by real-time PCR

2.2 長期連作對再植寧夏枸杞根際真菌群落α 多樣性及群落結構的影響

對真菌ITS2 區(qū)段的高通量測序結果表明，雖然非根際土壤真菌群落的豐度和均一度指數(shù)均高于枸杞根際土壤，但與對照樣地相比，連作并不影響再植枸杞根際及非根際土壤真菌群落的α多樣性指數(shù)（P＞0.05，圖1a、圖1b）。多維尺度分析（NMDS）表明，連作樣地與對照樣地再植寧夏枸杞根際及非根際土壤的真菌群落均存在明顯差異。但與對照樣地相比，連作樣地再植寧夏枸杞根際真菌群落結構與非根際土壤間的差異明顯降低（圖1c）。

2.3 長期連作對再植枸杞根際/非根際優(yōu)勢真菌豐度的影響

測序結果表明，所測定土壤樣品中的優(yōu)勢真菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota），這些真菌占各樣品總序列數(shù)的99.1%～99.9%（表2）。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，接合菌門在連作地枸杞根際土壤中的相對豐度較對照樣地顯著增加（P＜0.05，表2），但球囊菌門的相對豐度則顯著降低（P＜0.05，表2）。

圖1 再植枸杞根際/非根際土壤真菌群落多樣性分析 Fig.1 Diversity of the soil fungal communities in the bulk soil and rhizosphere of replanted L.barbarum

表2 再植枸杞根際/非根際優(yōu)勢真菌群落相對豐度變化 Table2 Relative abundances of the dominant fungal phyla in bulk soils and rhizosphere of replanted L.barbarum

進一步對相對豐度排名前30 的真菌屬分析發(fā)現(xiàn)，連作顯著促進了再植枸杞根際土壤中毛霉屬和Gibellulopsis的相對豐度（P＜0.05，表3）。此外，連作樣地再植枸杞根際和/或非根際土壤中鐮刀菌屬、葡柄霉屬和粉紅螺旋聚孢霉屬的相對豐度均高于對照樣地，但結果不顯著（P＞0.05，表3）。

表3 再植枸杞根際/非根際優(yōu)勢真菌屬豐度變化 Table3 Relative abundance of dominant fungal genera in the bulk and rhizosphere of replanted L.barbarum

續(xù)表

2.4 連作對再植枸杞根際不同功能真菌相對豐度的影響

將測序結果與FUNGuild 的真菌數(shù)據庫進行比對，在測定的所有土壤樣本中主要發(fā)現(xiàn)六種功能真菌（表4）。統(tǒng)計分析表明，連作地再植枸杞根際土壤中叢枝菌根真菌的豐度較對照樣地再植枸杞根際土壤顯著降低（P＜0.05），其他五種功能真菌的相對豐度則無顯著變化（表4）。

表4 連作及對照條件下再植枸杞根際/非根際不同功能真菌的相對豐度變化 Table4 Relative abundances of soil fungi in the bulk soils and rhizosphere of replanted L.barbarum relative to functional group and treatment

2.5 連作樣地土壤理化性質對枸杞根際/非根際土壤真菌群落的影響

相關性分析表明，枸杞根際土壤中接合菌門的相對豐度與土壤電導率和硝態(tài)氮顯著負相關，而與有效磷含量顯著正相關；壺菌門的相對豐度與土壤全磷含量顯著負相關；球囊菌門的相對豐度與硝態(tài)氮含量顯著正相關，而與有效磷含量顯著負相關（P＜0.05，表5）。非根際土壤中優(yōu)勢真菌門的相對豐度與土壤因子間均無顯著相關關系（P＞0.05，表5）。從真菌功能分類看，枸杞根際土壤中植物病原菌的相對豐度與土壤全磷含量顯著負相關；腐生真菌的相對豐度與土壤電導率及硝態(tài)氮含量顯著負相關；叢枝菌根真菌的相對豐度與硝態(tài)氮含量顯著正相關，而與有效磷含量顯著負相關。而在非根際土壤中，植物病原菌的相對豐度與土壤有機碳含量顯著正相關（P＜0.05，表5）。

進一步利用基于距離的冗余分析（db-RDA）發(fā)現(xiàn)，土壤有效磷含量、電導率、速效氮含量及pH分別解釋了寧夏枸杞根際土壤真菌群落變化的33.7%、30.0%、27.1%和26.7%（P＜0.05，表6）。土壤有效磷和硝態(tài)氮含量分別解釋了寧夏枸杞非根際土壤真菌群落變化的34.1%和29.3%（P＜0.05），其他土壤因子均無顯著影響（表6）。

3 討 論

3.1 連作擾亂再植枸杞根際和非根際土壤細菌群落與真菌群落間的平衡關系

實時熒光定量PCR 的結果證實，連作地再植枸杞根際和非根際土壤中細菌和真菌的豐度均顯著高于對照樣地（表1），這一結果說明傳統(tǒng)模式下長期種植枸杞能夠顯著促進土壤微生物種群的繁殖。導致這一結果的原因可能有以下三點：首先，長期施用肥料及枸杞落葉返還土壤能夠通過提供營養(yǎng)和碳源、調整土壤C/N 比及改變土壤微環(huán)境等方式促進土壤微生物群落的生長和繁殖[17]。其次，Bouskill等[18]研究發(fā)現(xiàn)，前期預處理能夠增強土壤微生物群落對后期相同類型環(huán)境脅迫的耐受性。經過長期的定向選擇，枸杞連作地土壤微生物已適應枸杞根際環(huán)境，進而在再植枸杞根際土壤大量定植。此外，連作地土壤可能通過影響再植枸杞生長及其生理狀態(tài)[6]，調整枸杞根系與土壤微生物間的互作關系，導致枸杞根系對根際土壤微生物的控制力降低而使根際微生物過度繁殖。對再植枸杞根際/非根際真菌群落結構的分析發(fā)現(xiàn)，連作地再植枸杞根際真菌群落與非根際真菌群落結構較為相似（圖1C），證實連作可能弱化了再植枸杞根系對土壤真菌的選擇作用。然而就連作如何影響枸杞與土壤微生物間的相互作用仍需深入研究。

由于土壤細菌和真菌群落在底物利用、功能等方面的差異，決定了這兩種微生物群落在應對環(huán)境變化時表現(xiàn)出不同的響應機制[19]。本研究結果也表明，連作對再植枸杞根際/非根際土壤真菌群落的促進作用高于細菌，導致連作地再植枸杞根際和非根際土壤中細菌/真菌的比例均明顯低于對照樣地（表1），使再植枸杞根際土壤微生物環(huán)境偏向于真菌型。近期，Grosso 等[20]研究發(fā)現(xiàn)土壤pH 和植物凋落物的C/N 是影響土壤細菌和真菌群落平衡的主要因素。其中，低pH 和高C/N 均有利于真菌生長。因此，長期施用氮肥導致的土壤pH 降低[6]，可能是連作影響再植枸杞根際和非根際土壤細菌/真菌比例平衡的主要原因之一。

3.2 連作抑制再植枸杞根際土壤叢枝菌根真菌（球囊菌門）的相對豐度

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）是土壤中分布極其廣泛的一類真菌，它能夠與約75%的陸生植物形成互利共生的聯(lián)合體[21]，因其具有幫助植物吸收氮、磷等元素、提高植物對土傳病害和干旱等生物及非生物脅迫的耐受性等功能而受到廣泛關注[22-23]。目前研究發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根真菌主要以球囊菌門為主，因此有研究直接將球囊菌門視為叢枝菌根真菌[21，24]。本研究的測序及真菌功能預測結果表明，球囊菌門和叢枝菌根真菌的相對豐度在不同土壤樣本中均保持一致（表2和表4）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，連作地再植枸杞根際土壤中叢枝菌根真菌的相對豐度較對照樣地顯著降低（表4），且其豐度與硝態(tài)氮含量顯著正相關，而與有效磷含量則顯著負相關（表5）。這些結果說明，長期施肥可能影響了叢枝菌根真菌與再植枸杞根系間的共生關系。由此推測，叢枝菌根真菌豐度的減少可能進一步影響了再植枸杞對生物及非生物脅迫的抗性，從而導致再植枸杞生長減緩。

3.3 連作對再植枸杞根際土壤植物病原菌豐度的影響

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表6 土壤理化因子對寧夏枸杞根際/非根際真菌群落結構的影響 Table6 Effects of soil properties on composition of the soil fungal communities in the bulk soil and rhizosphere of L.barbarum

前期對不同種植年限枸杞根際土壤微生物群落 的分析發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬、李維菌屬及枝孢屬等已知植物病原菌的相對豐度在不同樹齡枸杞間均發(fā)生顯著變化[7]。在本研究中，F(xiàn)UNGuild 數(shù)據庫檢索結果顯示植物致病菌的總體相對豐度在不同樣品中無顯著差異（表4）。然而，就單一植物病原菌而言，連作地再植枸杞根際土壤中已知植物病原菌鐮刀菌屬、擬青霉屬、葡柄霉屬和粉紅螺旋聚孢霉屬的相對豐度均高于對照樣地（表3）。雖然目前就這些植物病原菌是否導致枸杞產生病害尚不清楚，但這些病原真菌相對豐度的增加說明連作地再植枸杞根際土壤微生物環(huán)境較對照樣地更差。此外，這一結果也間接證明連作可能干擾了再植枸杞根系對植物病原菌的抑制作用。

3.4 長期施肥是驅動再植枸杞根際土壤真菌群落演替的主要因子

前人研究表明長期施用化肥所導致的土壤酸化、土壤次生鹽堿化等效應均能夠直接或間接影響土壤微生物群落的結構和組成[21，25]。前序基于相同條件下對細菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH 和有效磷含量是驅動枸杞非根際細菌群落結構變化的主要因素[6]。本研究進一步表明，土壤pH、電導率、硝態(tài)氮和有效磷含量是解釋再植枸杞根際真菌群落的主要因素，其中硝態(tài)氮和有效磷含量也是驅動非根際土壤真菌群落的主要土壤因子（表6）。這些結果與前人研究結果一致[21]。在實際生產中，長期施用氮肥是導致枸杞園土壤酸化的主要原因，并且氮肥和磷肥的長期使用又能夠導致氮、磷元素過量。因此在傳統(tǒng)種植模式下，大量、長期使用化肥所導致的土壤理化性質改變是驅動枸杞園土壤細菌/真菌群落及再植枸杞根際真菌群落結構演替的主要因子。鑒于土壤細菌和真菌群落在多數(shù)土壤生態(tài)過程中具有重要作用，由此可以推測，長期使用化肥對土壤微生物群落的影響可能是導致枸杞連作障礙產生的主要原因之一。

此外，在長期種植過程中枸杞凋落物及根系分泌物的不斷輸入也可能導致枸杞園土壤微生物群落結構發(fā)生改變。本研究也觀察到TOC 含量與植物病原真菌的相對豐度存在顯著正相關關系（表5），但對枸杞凋落物如何驅動枸杞園土壤微生物群落演替以及長期施肥如何影響土壤微生物群落對枸杞凋落物的利用和降解等重要過程仍不清楚。探索這些土壤生物學過程對于理解枸杞連作障礙形成機制及改進枸杞種植技術具有重要理論價值。

4 結 論

長期連作顯著促進再植枸杞根際及非根際土壤細菌和真菌的群落豐度；且連作對真菌的促進作用強于細菌，導致枸杞根際及非根際土壤微生物環(huán)境偏向于真菌型。測序結果表明，再植枸杞根際土壤的優(yōu)勢真菌分別為子囊菌門、擔子菌門、接合菌門、壺菌門和球囊菌門，其中連作地再植枸杞根際土壤中球囊菌門（叢枝菌根真菌）的相對豐度較對照樣地顯著降低，而接合菌門的相對豐度則顯著增加。db-RDA 分析發(fā)現(xiàn)，土壤pH、電導率、硝態(tài)氮和有效磷是驅動再植枸杞根際土壤真菌群落結構變化的主要因素，而硝態(tài)氮和有效磷含量是影響非根際土壤真菌群落結構變化的主要因子。